靶向AKAP3的亲和肽P296的制作方法

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种多肽。

背景技术：

a型激酶锚定蛋白(a-kinaseanchorproteins,akaps)是结合蛋白激酶a(pka)亚基的一组结构不同的蛋白质。大量的证据表明akaps在camp介导的信号传导中起着重要的作用。akap3是一个癌睾抗原。研究表明，akap3是精子特有的基因，主要在精子形成过程中减数分裂后表达，在精子前体细胞的形态变化和调节精子功能中起重要作用。在正常组织中，akap3表达仅存在于睾丸中。akap3的mrna在各种肿瘤细胞系中广泛表达。研究发现，akap3在卵巢癌中高表达，并且akap3的表达和肿瘤的组织学分级有关，也与肿瘤的临床分期有关。

技术实现要素：

本发明克服了现有技术的不足，提供了一种靶向akap3的亲和肽或akap3来源的抗肿瘤ctl表位肽p296及其应用。

一方面，本发明提供了一种多肽，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

另一方面，本发明提供了所述多肽的制备方法，该多肽可通过固相合成制得，如采用标准fmoc方案制备。

另一方面，本发明提供了含所述多肽的食物、保健品或药物组合物，药物组合物可包括多肽及其药学上可接受的载体或赋形剂，其形式可为疫苗。

再一方面，本发明提供了所述多肽用于制备akap3表达阳性肿瘤的预防性或治疗性多肽疫苗的用途。

本发明的有益效果为：

本发明的多肽是akap3抗肿瘤ctl表位肽，较好地诱导特异性ctl应答，提升ifn-γ的表达量，从而增强肿瘤预防和治疗的效果，可制为一种新型的肿瘤治疗性疫苗甚至食物、保健品。

附图说明

图1表征elispot法检测表位肽体外特异性ctl分泌ifn-γ的能力；

图2表征ldh法检测表位肽体外特异性ctl细胞毒性；

图3表征elispot法检测表位肽体内特异性ctl分泌ifn-γ的能力；

图4表征ldh法检测表位肽体内特异性ctl细胞毒性；

图5表征elisa法检测小鼠血清中ifn-γ的分泌量；

图6为转基因小鼠体重变化图。

各图中所涉*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001分别代表实验组与pbs组的显著性差异；▲p<0.05，▲▲p<0.01和▲▲▲p<0.001分别代表实验组与hbcag18–27或者th表位组的显著性差异。

具体实施方式

本发明的候选肽p296，其序列为mmvsimktl(met-met-val-ser-ile-met-lys-thr-leu)，如seqidno.1所示，采用标准fmoc方案进行固相合成，经质谱检测其分子量为：1053.6[m+h]，基本同理论值1053.4。下面鉴定该候选肽(有时亦称表位肽)的活性，所用实验方法、试剂均为常规选择，参见文献：shirr,liuj,zouz,qiym,zhaimx,zhaiwj,gaoyf:theimmunogenicityofanovelcytotoxictlymphocyteepitopefromtumorantigenpl2l60couldbeenhancedby4-chlorophenylalaninesubstitutionatposition1.cancerimmunology,immunotherapy:cii2013,62(11):1723-1732。如无特别说明，所涉名词、缩写均为本领域常规含义。

1.t2a2细胞亲和力实验

①收集t2a2细胞，用无血清imdm洗3次，调整细胞浓度至1×10⁶/ml，铺于24孔板中，1ml/孔。实验组加入2.5μg/ml的β2微球蛋白，50μm的候选肽p296；设置阳性组、阴性组、背景对照组。于37℃、5％co2培养箱中共孵育18h。

②收集孵育后的细胞，用冰pba洗3次，加入0.5ml1:100稀释的单克隆抗体bb7.2，4℃避光孵育30min。

③冷pba洗3次，加入50μl稀释度为1:50的fitc-羊抗鼠igg溶液，4℃避光孵育40min。冷pba洗涤1次，1mlpba重悬，上流式细胞仪进行检测。同时，设置已被鉴定的hbcag18-27作为结合力和稳定性实验的阳性肽，pbs作为阴性对照，未加肽刺激的单纯t2a2细胞作为背景对照。

结果用荧光系数(fi)表示：荧光系数(fi)＝(表位肽平均荧光强度－背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度。结果分析：如果fi>1.5：候选肽与hla-a*0201具有强亲合力；1.5>fi>0.5：中等亲合力；fi<0.5：弱亲合力。经分析，本肽的fi＝1.64。

2.肽/mhc复合物稳定性分析

收集t2a2细胞，用无血清imdm洗3次，调整细胞浓度至1×10⁶/ml，铺于24孔板中，1ml/孔。分别加入50μm的候选肽，设置阳性组、阴性组、背景组和调零组，每孔加入2.5μg/ml的β2微球蛋白，于37℃、5％co2培养箱中共孵育18h。

孵育完成后，以冷pba洗涤3次以洗净未结合的肽，加入10μg/mlbrefeldina(布雷菲德菌素a)孵育1h。以0h、2h、4h、6h为时间点，37℃、5％co2共孵育。冷pba洗涤2次，加500μl稀释度为1:100的单克隆抗体bb7.2，4℃避光孵育30min。冷pba洗涤2次，加50μl稀释度为1:50的fitc-羊抗鼠igg，4℃避光孵育40min。冷pba洗涤后，pba重悬细胞，于流式细胞仪检测，结果以dc50表示。

经检测，dc50>4h。

3.体外免疫活性检测

细胞毒t淋巴细胞体外诱导

①40ml离心管中加入适量肝素钠溶液，抽取hla-a2阳性健康志愿者外周血20ml，无菌ph＝7.2的pbs将抗凝血进行稀释。

②将4ml的淋巴细胞分裂液贴壁缓缓加入无菌的离心管，随后加入经pbs稀释过的抗凝血，注意不要打破界面。2000rpm，离心20min。

③离心结束后，离心管中细胞从上至下分为四层；弃去第一层血浆层，吸取第二层环状乳白色的淋巴细胞层，置于另一无菌离心管中，随后加入5倍体积的pbs洗涤，2000rpm，15min。

④弃上清，收集沉淀。用含10％胎牛血清的imdm培养基调整细胞浓度为1×10⁶/ml，置于24孔板中培养。

⑤设定pbs组、hbv组、实验组，第2天hbv组、实验组分别加入相对应的多肽和β2-m(两者终浓度均设为10μg/ml)，pbs组加入相对应的pbs，第3天加入50u/ml的重组人源il-2(rhil-2)，观察培养液状态，进行半量换液，补加rhil-2。每7天进行一轮重复刺激，刺激过程：24孔板进行1000rpm，10min离心，去除上清，加入新鲜的含10％胎牛血清的imdm培养基，同时补加上述量相对应的多肽、rhil-2和β2-m，第2轮刺激的第3天加入cd3抗体。

⑥完成3轮刺激后，继续培养2-3天，收集细胞即作为效应ctl。

免疫活性检测：

1)elispot(enzyme-linkedimmunospotassay酶联免疫斑点实验)法检测分泌ifn-γ的t细胞数

a.首先进行预包被板的活化：

取出所需elispot板条，每孔加200μl无血清的imdm培养基进行封闭，静置10min后将培养基弃去；

b.细胞铺板：

诱导的ctl作为效应细胞，荷肽的t2a2作为刺激细胞，细胞浓度均调整为2×10⁶个/ml；实验孔每孔加50μl效应细胞和50μl刺激细胞；

阴性对照孔每孔加100μl无血清的imdm培养基；

阳性对照孔每孔加50μl的效应细胞和10μlpha再补加40μl无血清的imdm培养基培养。

铺板完毕放于培养箱中，37℃、5％co2孵育18h；

c.细胞裂解：

孵育结束后，倾尽孔中培养基，每孔加入200μl无菌的去离子水，4℃裂解细胞10min；倾尽孔内液体，加入200μl1×washingbuffer进行洗涤，洗涤6次，每次停留60s，洗涤完毕后，在吸水纸上拍干；

d.加入检测抗体孵育：

加入100μl生物素标记的抗体，37℃孵育1h；孵育完成后，倾尽孔内液体，加入200μl1×washingbuffer进行洗涤，洗涤6次，每次停留60s，洗涤完毕后，在吸水纸上拍干；

e.加入酶联亲和素孵育：

加入100μl酶联亲和素，37℃孵育1h；孵育完成后，倾尽孔内液体，每孔加入200μl1×washingbuffer进行洗涤，洗涤6次，每次停留60s，洗涤完毕后，在吸水纸上拍干；

f.显色：

加入100μl现配的aec显色液，室温25℃避光静置30min，进行显色；显色完成后，倾尽孔内液体并打开孔板底座，去离子水洗涤，终止显色。置于通风处，室温静置干燥；用elispot图像分析仪计数96孔板中每孔的斑点数，结果比较如图1所示。

2)ldh(lactatedehydrogenase乳酸盐脱氢酶)法检测细胞毒性实验

①靶细胞、效应细胞的准备

本实验中将sw620作为靶细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，每孔加入5000个/50μl，加入不同数量和体积的效应细胞(前面体外诱导制备)，使实验组形成不同的效靶比(分别为12.5:1、25:1、50:1)，并补加无血清的imdm培养基至总体积100μl，每组设置3个复孔。

同时设立以下对照：

靶细胞自发释放组

靶细胞最大释放组

效应细胞自发释放组

背景对照组

总体积校正对照组，各对照组也设3个复孔，每孔总体积100μl。

②ldh实验步骤：

细胞培养板96孔板置于37℃，5％co2培养箱中培养4h。孵育结束前45min，加入10μl10×裂解液添加在靶细胞最大释放孔和体积校正孔中。培养结束后，离心培养板1000rpm，10min；取出96孔板，每孔轻轻吸取50μl上清置于另一96孔板对应的孔中，全部转移结束后，每孔迅速加入50μl乳酸脱氢酶底物混合液，室温避光孵育30min；孵育结束后，每孔添加50μl终止液；酶标仪上以490nm检测吸收od值，计算杀伤率。

杀伤率＝(实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释)×100％。

结果比较如图2所示。

4.akap3的hla-a2.1/k^b转基因小鼠体内免疫活性检测

效应ctl(细胞毒性t淋巴细胞)的体内诱导

随机选取6～8周龄hla-a2.1/k^b转基因小鼠，每组5只，雌雄随机分配。

实验共设置pbs组、th表位组、实验组。每组注射小鼠体内的剂量如下：

pbs组：pbs：弗氏不完全佐剂(ifa)＝1:1

th组：pbs：th表位：弗氏不完全佐剂(ifa)＝1:1:2

实验组：实验组：th表位：弗氏不完全佐剂(ifa)＝1:1:2

第1次免疫注射记为第0天，按照上面所给各个组分进行皮下免疫注射，在第5d、第10d时进行第2次和第3次加强免疫；同时每次免疫注射前，对hla-a2.1/k^b转基因小鼠进行观察，记录体重，结果如图6所示。

制备效应细胞：

①将免疫注射后的hla-a2.1/k^b转基因小鼠于第11d脱颈处死，置于75％酒精中，浸泡处理10min消毒后，无菌开腹腔取出脾脏，去除脂肪和结缔组织放于200目不锈钢网筛中；

②培养皿中加入少量ph＝7.2的pbs，并将200目钢网置于其上，用20ml医用注射器内芯进行研磨，尽量研磨干净。pbs冲洗，移去筛网，培养皿中得脾细胞悬液(约10ml)，转移至无菌离心管中；

③1000rpm、10min水平离心，弃上清，收集细胞；每管加入5ml红细胞裂解液，轻轻吹打重悬细胞，4℃孵育15min裂解红细胞；1000rpm、10min水平离心弃上清，收集细胞。pbs洗涤2次；

④将脾细胞重悬于10ml含10％胎牛血清的rpmi1640培养基中。计数后的脾细胞悬液置于6孔板中培养，每孔5ml细胞悬液；次日每孔加入250u重组鼠源il-2、β2-m以及与相对应的多肽；在37℃、5％co2培养箱中培养5d，收获后作为效应细胞，进行elispot和ldh检测。elispot和ldh检测方法同前面体外免疫实验所用方法，elispot法检测结果如图3所示，ldh法检测结果如图4所示。

hla-a2.1/k^b转基因小鼠血清中ifn-γ酶联免疫分析(elisa)

在转基因小鼠脱颈处死之前，用眼球取血的方法取各组免疫小鼠静脉血，室温静置2-4h后，3000rpm离心10分钟取上层血清，标记好后-80℃保存。elisa法检测小鼠血清中ifn-γ抗体水平，结果比较如图5所示。

序列表

<110>漯河医学高等专科学校

<120>靶向akap3的亲和肽p296

<160>1

<210>1

<211>9

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

metmetvalserilemetlysthrleu

15