一种盐酸氯苯胍人工抗原的合成方法与流程

本发明涉及一种盐酸氯苯胍人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术：

盐酸氯苯胍（robenidinehydrochloride）是一种新型高效抗球虫药。该药于上世纪70年代初在美国上市并作为饲料添加剂被广泛使用，主要用于预防和治疗鸡的球虫感染。在我国主要用于防治鸡、兔以及水产动物的寄生虫感染。长期使用会产生严重的抗药性，农业部第235号公告规定盐酸氯苯胍在鸡脂肪、皮、可食组织中的最高残留限量分别为200、200、100μg/kg。近年来，人们对长期低水平摄入兽药残留所致的各种慢性疾病和诱导病原菌产生耐药性等问题特别关注。为保障水产品质量安全和消费者身体健康，促进水产养殖业的健康、可持续发展，有必要对水产品中的药物残留进行监控。因此，建立快速有效的检测盐酸氯苯胍含量的方法具有重要意义及市场价值。

酶联免疫法（elisa）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，然而得到高亲和力和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种盐酸氯苯胍人工抗原的合成方法，所制备的产品用于盐酸氯苯胍免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案，一种盐酸氯苯胍人工抗原的合成方法，其由盐酸氯苯胍与1,3-二氨基胍盐酸盐反应得到具有羧基的产物，即半抗原rob，用碳二亚胺法将半抗原rob与载体蛋白偶联，即得到盐酸氯苯胍人工抗原；步骤为：

（1）半抗原rob的合成：

合成路线如下：

将4-苯丁酸甲酯（化合物1）(1.50g,8.42mmol)溶解于20ml三氟乙酸，加入六亚甲基四胺(1.29g,9.26mmol)，反应液在80℃条件下搅拌过夜，之后冷却至室温，减压浓缩，用硅胶柱纯化得到黄色油状中间产物2；

将中间产物2(700mg,3.39mmol)溶解于10ml盐酸（6mol/l）中，反应液在60℃条件下搅拌过夜，将反应液过滤，滤饼用水冲洗，真空干燥，得到白色固体中间产物3；

将中间产物3(400mg,2.08mmol)溶解于10ml纯甲醇溶液，加入1,3-二氨基胍盐酸盐(261mg,2.08mmol)，反应液在60℃条件下搅拌1h，反应液冷却至室温后，加入对氯苯甲醛(292mg,2.08mmol)，在60℃条件下搅拌1h，混合物进行减压浓缩，残渣经硅胶柱纯化得到白色固体目标化合物4，制备得半抗原rob。

（2）完全抗原的制备：步骤（1）制备的半抗原rob与bsa偶联得到偶联物完全抗原rob-bsa。

步骤（2）所述完全抗原rob-bsa的制备方法如下：

a、称取步骤（1）制备的rob3.5mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐5.2mg，n-羟基琥珀酰亚胺3.2mg，用300μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4～5h(称为a液)；称取牛血清蛋白bsa10mg（rob与bsa摩尔比为30:1），加入等体积硼酸缓冲溶液（称为b液）；在室温条件，逐滴将a液加入到b液中，室温反应过夜，即得偶联物rob-bsa混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物rob-bsa混合液放入透析袋于0.01mol/l的pbs中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原rob-bsa。

盐酸氯苯胍人工抗原的鉴定

（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。

（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。

偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。

用pbs配制0.5mg/ml的蛋白溶液与完全抗原溶液，以pbs建立基线，在波长200~500nm间扫描，得到蛋白溶液与完全抗原溶液在半抗原的紫外吸收特征峰处的吸光值分别为a1，a2；用甲醇配制5~50μg/ml的半抗原即为xμg/ml，以甲醇建立基线，在波长200~500nm间扫描，得到半抗原紫外吸收特征峰处的吸光值a3，半抗原的相对分子质量为m1，蛋白的相对分子质量为m2，则偶联比=[(a2-a1)(x/m1)/a3]/(0.5/m2)

本发明的有益效果：本发明成功合成了盐酸氯苯胍人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径。

附图说明

图1半抗原rob的nmr鉴定图。

图2半抗原rob的lc-ms鉴定图。

图3rob-bsa人工抗原的免疫原紫外鉴定图。

具体实施方式

实施例1半抗原rob的合成

合成路线如下：

将4-苯丁酸甲酯（化合物1）(1.50g，8.42mmol)溶解于20ml三氟乙酸，加入六亚甲基四胺(1.29g，9.26mmol)，反应液在80℃条件下搅拌过夜，之后冷却至室温，减压浓缩，用硅胶柱纯化得到黄色油状中间产物2；

将中间产物2(700mg，3.39mmol)溶解于10ml盐酸（6mol/l），反应液在60℃条件下搅拌过夜，将反应液过滤，滤饼用水冲洗，真空干燥，得到白色固体中间产物3；

将中间产物3(400mg，2.08mmol)溶解于10ml纯甲醇溶液，加入1,3-二氨基胍盐酸盐(261mg，2.08mmol)，反应液在60℃条件下搅拌1h，反应液冷却至室温后，加入对氯苯甲醛(292mg，2.08mmol)，在60℃条件下搅拌1h，混合物进行减压浓缩，残渣经硅胶柱纯化得到白色固体目标化合物4，制备得半抗原rob。

实施例2完全抗原的制备

完全抗原rob-bsa制备方法如下：

a、称取实施例1制得的称取rob3.5mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐5.2mg，n-羟基琥珀酰亚胺3.2mg，用300μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解(称为a液)，室温搅拌反4～5h。称取牛血清蛋白bsa10mg（rob与bsa摩尔比为30:1）,加入等体积硼酸缓冲溶液（称为b液），在室温条件，逐滴将a液加入到b液中，室温反应过夜，即得偶联物rob-bsa混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物rob-bsa混合液放入透析袋于0.01mol/l的pbs中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原rob-bsa。rob-bsa免疫原的紫外鉴定图如图3所示。

实施例3盐酸氯苯胍人工抗原的鉴定

（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。

（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。

偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。

偶联物蛋白浓度测定：将反应前蛋白的质量除以透析后偶联物的体积即可得到偶联中蛋白的含量。

偶联物rob-bsa的特征吸收峰在328nm处，此处的吸光值a2=0.929581，bsa在此处的吸光值a1=0.021483，rob的特征吸收峰a3=1.612249，rob的相对分子质量m1=385.5，bsa的相对分子质量m2=67000，x为10μg/ml，则根据偶联比公式：

偶联比=[(a2-a1)(x/m1)/a3]/(0.5/m2)，rob-bsa中半抗原rob与蛋白bsa的偶联比为119.932:1。