一种68Ga标记的类艾塞那肽化合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于放射性核素标记技术领域，具体涉及一种⁶⁸ga标记的类艾塞那肽化合物及其制备方法和应用。

背景技术：

胰岛素瘤又称胰岛β细胞瘤，是胰腺神经内分泌肿瘤中较为常见的一种，可引发高胰岛素血症，导致低血糖等症状。手术治疗是胰岛素瘤唯一的根治手段，而术前精确定位又是实施手术治疗的关键。因胰岛素瘤的瘤体较小(通常小于1-2cm)，常规的影像学检查可能出现漏诊，血管造影、选择性动脉钙刺激静脉采血测定胰岛素(asvs)虽可提高检出率，但属侵入检查，存在感染、出血等危险因素。精确度高且无创的肿瘤定位方式已成为近年来的研究热点。

目前，生长抑素受体(somatostatinreceptor，sstr)显像被认为是检测胃肠胰腺神经内分泌肿瘤最敏感的方法。常用的探针如¹¹¹in-dtpa-奥曲肽，它与肿瘤表达的sstr-2特异性结合，显像敏感度达80％～90％。然而许多胰岛素瘤不表达sstr-2，¹¹¹in-dtpa-奥曲肽显像的敏感度低于50％。针对不同肿瘤中特定高表达的肽受体，选择合适的分子探针进行肿瘤显像，可以提高诊断的准确性和敏感度。

研究显示，胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-likepeptide-1receptor，glp-1r)在神经内分泌肿瘤中高度表达，尤以胰岛素瘤过度表达，而在正常组织如胰岛，肺，肠等中少量表达，这为胰岛素瘤的受体显像和靶向治疗提供了理想靶点。胰高血糖素样肽-1(glp-1)是由肠道细胞分泌的一种多功能肽类激素，在调节葡萄糖稳态中发挥重要作用。glp-1通过与glp-1受体(glp-1r)特异性地结合，刺激胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的产生。然而glp-1在体内很快被降解，半衰期极短(仅2min)，使其临床应用价值受到限制。

艾塞那肽(exendin-4)是从希拉毒蜥唾液中分离的一种多肽激素，由39个氨基酸残基组成，与glp-1有53％的同源性。与天然glp-1相比，glp-1受体激动剂艾塞那肽具有较强的二肽基酶抗性(血浆半衰期为60～90min)，可以在体内更持续，稳定的发挥glp-1样效应。研究显示，胰岛素瘤特别是良性胰岛素瘤高表达glp-1r。多种放射性核素标记exendin-4的类似物用于胰岛素瘤的显像在国内外也得到了广泛的研究。¹¹¹in和⁹⁹tcm标记的exendin-4类似物用于胰岛素瘤的spect显像均已进行动物实验和临床研究。wicki等用¹¹¹in-dtpa-lys⁴⁰-exendin-4对荷胰岛素瘤小鼠进行spect显像研究，药物在肿瘤处浓聚，wild尝试用⁹⁹tcm标记exendin-4类似物用于荷胰岛素瘤小鼠显像，sowa-staszczak则进行了临床试验，均取得良好效果。但是较低的分辨率和较高的辐照剂量，限制了其发展。

较spect而言，pet具有更高的图像分辨率，在肿瘤定位及诊断中的地位日益显著。《insulinomaimagingwithglucagon-likepeptide-1receptortargetingprobe¹⁸f-fbem-cys³⁹-exendin-4》以cys取代exendin-4c端的ser的方式获得新肽cys³⁹-exendin-4，并进行¹⁸f-fbem标记获得¹⁸f-fbem-cys³⁹-exendin-4(xuy,pand,xuq,zhuc,wangl,chenf,yangr,luos,yangm.[j].journalofcancerresearchandclinicaloncology,2014,140(9):1479-1488)。研究显示，¹⁸f-fbem-cys³⁹-exendin-4能够与glp-1r特异性结合，micro-pet显像中肿瘤清晰可见，生物学特点与¹⁸f-fbem-cys⁴⁰-exendin-4类似。¹⁸f-fbem-cys³⁹-exendin-4的合成过程异常的繁琐，耗时超过120min。《preliminaryevaluationof[¹⁸f]alf-nota-mal-cys³⁹-exendin-4ininsulinomawithpet》公开了一种简化合成方式，采用螯合剂nota-mal与cys³⁹-exendin-4反应合成nota-mal-cys³⁹-exendin-4，再通过al¹⁸f行一步法标记合成[¹⁸f]alf-nota-mal-cys³⁹-exendin-4，micro-pet显像示肿瘤部位呈放射性浓聚，具有良好的靶本底比，但是其标记产率仅为17.5±3.2％，且¹⁸f必须通过回旋加速器生产，生产及维护成本很高。

技术实现要素：

本发明针对现有技术不足，提供了一种合成时间短、产率高的⁶⁸ga标记的新型类艾塞那肽化合物及其制备方法及应用。

本发明具体技术方案如下：

一种⁶⁸ga标记的类艾塞那肽化合物，⁶⁸ga-nota-mal-cys³⁹-exendin-4(简写为镓[⁶⁸ga]-类艾塞那肽)，其分子式为⁶⁸ga-c202h309n55o66s2，分子量为4694，化学名为镓[⁶⁸ga]-4,7-二乙酸-1,4,7-三氮杂环壬烷-(1-乙酰氨基)-n-乙基琥珀酰亚胺-[半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-亮氨酸-色氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-丝氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸-甘氨酸-谷氨酸-甘氨酸-组氨酸]。

⁶⁸ga-4,7-triacetic-acid-1,4,7-triazacyclononane-(1-acetamido)-n-ethylsuccinimide-cys-pro-pro-pro-ala-gly-ser-ser-pro-gly-gly-asn-lys-leu-try-glu-ile-phe-leu-arg-val-ala-glu-glu-glu-met-gln-lys-ser-leu-asp-ser-thr-phe-thr-gly-glu-gly-his。

本发明还公开了一种上述化合物的制备方法，使用⁶⁸ga对前体化合物nota-mal-cys³⁹-exendin-4进行标记。

前体化合物为nota-mal-cys³⁹-exendin-4(简写为类艾塞那肽)，分子式为c202h309n55o66s2，分子量为4626。化学名：4,7-二乙酸-1,4,7-三氮杂环壬烷-(1-乙酰氨基)-n-乙基琥珀酰亚胺-[半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-亮氨酸-色氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-丝氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸-甘氨酸-谷氨酸-甘氨酸-组氨酸]。

4,7-triaceticacid-1,4,7-triazacyclononane-(1-acetamido)-n-ethylsuccinimide-cys-pro-pro-pro-ala-gly-ser-ser-pro-gly-gly-asn-lys-leu-try-glu-ile-phe-leu-arg-val-ala-glu-glu-glu-met-gln-lys-ser-leu-asp-ser-thr-phe-thr-gly-glu-gly-his。

合成路线如下所示：

上述制备方法包括：

(1)使用盐酸溶液对锗-镓发生器进行淋洗，收集⁶⁸ga淋洗液；

(2)取醋酸钠缓冲液加入到nota-mal-cys³⁹-exendin-4标记瓶中，混匀，然后加入放射性活度为111～185mbq的⁶⁸ga淋洗液，混匀后100℃反应10min，反应液纯化后测定其放射性活度，计算其标记产率。

具体的技术方案包括：

(1)使用0.05mhcl对锗-镓发生器进行淋洗，淋洗流速1ml/min，同时收集⁶⁸ga淋洗液；

(2)取1ml醋酸钠缓冲液(0.25m)加入到nota-mal-cys³⁹-exendin-4标记瓶中，100℃加热条件轻轻振荡混匀并预热5min，然后加入放射性活度为111～185mbq的⁶⁸ga淋洗液，轻轻振荡混匀后100℃反应10min，反应后溶液通过活化的sep-packc18小柱进行纯化，并经60％乙醇淋洗，以生理盐水稀释后保存备用，测定其放射性活度并计算标记产率。

本发明的另一目的在于提供本发明所述的⁶⁸ga标记的类艾塞那肽化合物在制备胰岛素瘤显像诊断试剂中的应用。

研究结果表明本发明所述的⁶⁸ga标记的类艾塞那肽化合物，肿瘤对其摄取值较高，肿瘤显像灵敏度高，且有着较低的肝脏摄取，毒副作用小，其优良的生物学性能和较好的药代动力学性质可以作为靶向glp-1受体的胰岛素瘤特异性显像剂。

本发明优点：

1.⁶⁸ga由⁶⁸ge-⁶⁸ga发生器生产，发生器可以使用1年或更长时间，生产成本低。而且⁶⁸ga的半衰期较短，辐照剂量低，可作为胰岛素瘤glp-1rpet显像的良好示踪剂。

2.本研究以⁶⁸ge-⁶⁸ga发生器生产的⁶⁸ga淋洗液以及设计的新型类艾塞那肽化合物nota-mal-cys³⁹-exendin-4，建立⁶⁸ga标记nota-mal-cys³⁹-exendin-4的方法，评价其药理学特点以及在荷胰岛素瘤(ins-1)裸鼠模型中的生物学特性，并进一步用于靶向glp-1r成像研究。临床前研究表明，本发明所述⁶⁸ga-nota-mal-cys³⁹-exendin-4的合成时间约25min，标记产率高达80％以上，hplc法测定产品放化纯>98％，标记产物⁶⁸ga-nota-mal-cys³⁹-exendin-4可以与glp-1受体特异性结合，是潜在的glp-1受体显像剂，适用于胰岛素瘤的诊断。

附图说明

图1为⁶⁸ga-nota-mal-cys³⁹-exendin-4的hplc图(放射性检测)。

图2为ins-1细胞免疫化学染色结果。

图3为⁶⁸ga-nota-mal-cys³⁹-exendin-4在荷瘤鼠体内micro-pet/ct显像结果。

图4为roi定量分析⁶⁸ga-nota-mal-cys³⁹-exendin-4在荷瘤鼠体内的分布。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体工艺步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1⁶⁸ga-nota-mal-cys³⁹-exendin-4的制备

本发明涉及实验仪器与材料:⁶⁸ge/⁶⁸ga发生器(德国abx公司)，2480wizard2自动伽玛计数仪(美国perkinelmer公司)，高效液相色谱仪lc-20at(日本岛津公司)；30％ultrapure盐酸(德国merckgmbh)，醋酸钠(美国sigma公司)，sep-packc18小柱(美国waters公司)，生理盐水(中国大冢制药有限公司)，nota-mal-cys³⁹-exendin-4(>98％，江苏省原子医学研究所提供，也可参考文献《preliminaryevaluationof[¹⁸f]alf-nota-mal-cys³⁹-exendin-4ininsulinomawithpet》制备；无水乙醇(德国merckkgaa)，micro-pet/ct(德国西门子)。

用5ml注射器抽取0.05mhcl4ml对锗-镓发生器进行淋洗，淋洗流速1ml/min，同时收集流出液；取1ml醋酸钠(0.25m)缓冲液加入到含90μgnota-mal-cys³⁹-exendin-4标记瓶中，100℃轻轻振荡混匀5min，然后加入放射性活度为111～185mbq(10～20mci)的⁶⁸ga淋洗液，轻轻振荡混匀后100℃反应10min。反应后溶液通过活化的sep-packc18小柱进行纯化，并经60％乙醇淋洗，测定其放射性活度并计算标记产率，并以生理盐水稀释后保存备用。

整个合成时间约25min，反应后所得产品的放射性活度除以反应前所加入⁶⁸ga淋洗液的放射性活度，可得标记产率在80％以上，hplc法测定产品放化纯>98％(如图1所示)。hplc分析鉴定条件如下：zorbaxrax-c18柱，流动相为：a：含0.1％三氟乙酸(tfa)的乙腈溶液；b含0.1％tfa的水溶液。梯度洗脱：从2分钟的5％a和95％b增加到32分钟的65％a和35％b，柱温为室温，紫外检测器波长为254nm，流速为1ml/min。

⁶⁸ga-nota-mal-cys³⁹-exendin-4的体外稳定性好，在生理盐水中至少可室温存放3个半衰期(>4h)；在血浆中稳定，37℃孵育2h后原型药所占的比例超过95％。

实施例2⁶⁸ga-nota-mal-cys³⁹-exendin-4在荷瘤小鼠体内micro-pet/ct显像

(1)免疫细胞化学染色

胰岛素瘤细胞(ins-1细胞)按5×10⁵/孔的密度铺于24孔板，置于培养箱中孵育过夜。次日用移液枪吸去孔中培养液，pbs漂洗后用95％乙醇固定细胞30min，再用pbs冲洗。加入双氧水室温反应5min后pbs漂洗，接着加入一抗(1:200鼠抗人glp-1)，阴性对照组则用pbs代替一抗，37℃放置1h。pbs漂洗后，加入二抗(兔抗大鼠igg-hrp)37℃放置15min。pbs漂洗后加入二氨基联苯胺(diaminobenzidine，dab)显色，反应3min，pbs冲洗，加入苏木素染色，冲洗，镜检。ins-1细胞免疫化学染色后，倒置显微镜下进行阳性组(图2-a，一抗为1:200glp-1)与阴性组(图2-b，pbs阴性对照组)对比观察，表明ins-1细胞glp-1受体高表达。

(2)肿瘤动物模型的建立

取对数生长期的ins-1细胞，消化并制成悬液，调整细胞密度为5×10⁷/ml，置于无菌离心管中。用1ml无菌注射器抽取0.2ml细胞悬液注入balb/c裸鼠右侧腋下。两周后，肿瘤直径可达2-3mm。

(3)⁶⁸ga-nota-mal-cys³⁹-exendin-4在荷瘤小鼠体内micro-pet/ct显像

取荷glp-1受体表达阳性的荷胰岛素瘤ins-1裸鼠3只，由尾静脉注射100μci⁶⁸ga-nota-mal-cys³⁹-exendin-4。以体积分数3％的异氟烷-氧气混合气体预麻醉后，将荷瘤鼠置于pet/ct扫描床上，并体积分数为1.5％的异氟烷-氧气混合气体维持麻醉并检测呼吸。分别于注射后30min、60min和120min行micro-pet/ct静态显像，采集10min。另取3只荷胰岛素瘤ins-1裸鼠行阻断实验，按体重10mg/kg经尾静脉注射冷化合物cys³⁹-exendin-4，10min后注射100μci的⁶⁸ga-nota-mal-cys³⁹-exendin-4，注射后60min行micro-pet/ct显像，采集10min。结果分别如图3所示，图中箭头所示为肿瘤。

荷瘤鼠注射⁶⁸ga-nota-mal-cys³⁹-exendin-4后30min到120min显像如图3所示，胰岛素瘤ins-1均清晰可见，图中可看出肿瘤与对侧相比具有良好的对比度，然而在过量未标记cys³⁹-exendin-4阻断下，胰岛素瘤ins-1对上述示踪剂的摄取不显著。

roi定量分析如图4所示：注射药物30min后肿瘤摄取值为11.50±0.56％id/g，60min为11.10±0.89％id/g，120min依然高达10.67±1.10％id/g。与之相比，在大剂量冷化合物阻断下，肿瘤摄取值明显降低，仅为0.42±0.05％id/g。另外，《preliminaryevaluationof[¹⁸f]alf-nota-mal-cys39-exendin-4ininsulinomawithpet》所述的¹⁸f标记的[¹⁸f]alf-nota-mal-cys³⁹-exendin-4在30min、60min的摄取值分别为9.15±1.6％id/g、7.74±0.87％id/g，在120min骤降至3.67±0.53％id/g，显著低于⁶⁸ga-nota-mal-cys³⁹-exendin-4的肿瘤摄取。

肾脏摄取值随时间的延长降低，注射药物30min、60min、120min后分别为51.70±2.80％id/g、51.10±3.20％id/g、48.5±3.70％id/g；肝脏的摄取值较低，在30min、60min、120min的摄取值分别为2.60±0.24％id/g、2.30±0.38％id/g、1.60±0.29％id/g。说明药物主要通过肾脏排泄，较低的肝摄取也降低了对肝脏的毒副作用。

综上，本发明所述的⁶⁸ga标记的类艾塞那肽化合物，肿瘤对其摄取值较高，肿瘤显像灵敏度高，且有着较低的肝脏摄取，毒副作用小，其优良的生物学性能和较好的药代动力学性质可以作为靶向glp-1受体的胰岛素瘤特异性显像剂。本发明制备方法不仅成本低，操作简便快捷，而且标记产率很高，标记产物放化纯高，稳定性好，有利于制备得到的⁶⁸ga标记的类艾塞那肽化合物作为靶向于glp-1受体的肿瘤pet显像剂在临床推广应用。