一种微滴式数字PCR检测低比例痕量目标基因的遗传分析方法与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种微滴式数字pcr检测低比例痕量目标基因的遗传分析方法。

背景技术：

每染色体都有两条的二倍体生物，如人、鼠、猪等，于一对染色体(同源染色体)相同位置的成对等位基因或多态性位点的两个成员，分别来自父方和母方，若相同即为纯合子，若不同则为杂合子；既决定生物体性状，也是判断子代与亲代之间遗传关系的依据。

具有生物学功能而控制相对性状的等位基因，其作用有显性和隐性之分；显性基因(用大写字母a表示)在杂合状态下表现其性状，而隐性基因(用小写字母a表示)只有在纯合状态下才表现明显性状。在遗传中，子代的等位基因是由父亲方的一个基因和母亲方的一个基因而组合遗传；而在配对组合过程中，就存在杂合子和纯合子两种情况；所谓杂合子，就是从一方a基因，另一方得到a基因，配对后就是aa组合；而纯合子是从父母双方来的基因都是一样的，也就组合成aa或aa。对人类而言，绝大部分的遗传病都是隐性的，如果子代的隐性遗传病基因型为aa，则为临床表型严重的患者，绝大部分为致死致残的严重后果。据此隐性遗传病的分子机制和遗传规律，只要父方未将致病的隐性基因a遗传给子代，子代即可排除基因型为aa的纯合子重症患者。

与个体遗传背景相关的同源染色体上多态性位点，即人类遗传标记，如单核甘酸多态性(snp)、短串联重复序列(str)等，也同样存在纯合和杂合两种状态。根据遗传规律，子代某多态位点上的两个等位基因分别来自父母双方，无基因突变的情况下，如果子代未遗传疑父的其中一个基因，则可排除其亲缘关系。其次，基因组上的等位基因，有与其紧密连锁的多态性位点；通过对夫妇双方的等位基因单倍型分析，以确定双方与的差异性连锁多态位点，通过检测子代基因组或孕期母体血浆游离dna中是否存在父方的多态位点目标序列，即可确定子代是否遗传了父方连锁的等位基因；如母方与等位基因a连锁的snp位点为t、与a连锁的为c，父方与a连锁的为g、与a连锁的为a，那么只要在子代基因组或孕期母体血浆游离dna中未检测到此多态位点a碱基等位基因，即可确定子代没有遗传与此连锁的a基因而排除aa纯合的可能。

另外，目前造血干细胞移植是临床上治疗白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、重型再生障碍性贫血、地中海贫血等血液系统疾病的最有效手段之一；根据造血干细胞的来源，可以分为自体、异体同基因(如双胞胎)、以及异基因(如父母、同胞、无血缘关系者)移植，其中绝大部分为异基因移植。异基因干细胞移植的目的是建立供者型的正常造血与免疫功能，以取代受者原有的异常的造血及免疫系统，其成败的关键在于受者与供者的造血与免疫系统能否和平共处，即形成一种平衡的嵌合状态。由此可见，为判断移植是否成功并及时地实施免疫抑制治疗、预后等，需要对移植后受体体内形成的供、受者外周血细胞嵌合体进行检测并观察其变化趋势。从遗传学的角度来说，嵌合体本质上是两个基因型不同的混合物，嵌合状态的检测与变化实质上是两个基因型的比例；因此，利用两个不同基因型之间的差异等位基因为标志进行定量分析，即可获得两者的拷贝数比例而获知其嵌合状态。

要实现人类、鼠、猴等哺乳类动物的上述遗传分析目标，可对已出生的受检对象进行取样和dna分析，也可采用孕期穿刺手术胎儿取样(如胎儿绒毛、羊水或脐带血标本)dna分析，还可以孕期母体外周血浆游离dna为样本进行检测；而在具体实践之中，由于目前普遍采用的创伤性穿刺采样手术可导致宫内感染、流产、胎儿死亡等并发症，且局限于采样的合适孕周，所以均趋向于现症个体取样或孕期母体外周全血无创取样的dna检测遗传分析。

母体血浆中存在的游离胎儿dna，研究表明主要有3种来源，分别为胎盘、进入母体血循环胎儿造血细胞的凋亡、胎儿dna分子直接通过胎盘转移进入母体血浆。由此可见，基于母体血浆中游离胎儿dna检测的无创性遗传分析是可行的，并有效避免了穿刺手术胎儿取样的损伤，其技术优势明显，有很好的应用前景。目前已有基于母体血浆中游离dna的无创性遗传分析研究和应用主要有：通过检测孕妇外周血浆游离dna中是否存在与父源地贫基因突变单倍型相连锁的snp，从而判断父亲的突变基因是否遗传给了胎儿的人类地中海贫血无创产前诊断方法；夫妇双方携带不同β-地贫基因突变(异型基因突变)类型的前提下，直接检测孕妇外周血浆游离dna中是否存在父源地贫基因的排除性产前诊断等。这些研究也证明了基于孕妇外周血浆游离dna检测的遗传分析可行性，但采用检测方案与方法，其灵敏度与准确性有限。鉴于孕妇血浆中游离胎儿dna的含量低，且所占的比例小，在此高母源dna比例背景条件下有效检出子代目标基因，是广大科技术人员所面临的难题，目前的研究报道普遍为孕12周及以上，以足够孕周而保证胎儿dna的含量，以尽可能避免假阴性结果，但实现更早孕周的早期检测，始终是大家所追求的目标。

最近推出的数字pcr技术，是一种单分子计数手段，可实现核酸分子的绝对定量。微滴式数字pcr(ddpcr，美国bio-rad公司技术)是通过微滴发生器将含有核酸分子的反应体系形成成千上万个纳升级的独立pcr反应体系微滴，其中每个微滴含一个至数个或不含待检核酸靶分子，扩增后对每个微滴进行逐个检测以确定各微滴中是否存在待检靶分子，从而实现靶分子的绝对定量，可有效避免模板间的相互干扰而大大提高检测的灵敏度与准确性。

据上所述，技术方案与技术平台的灵敏度越高，就越能更低比例痕量目标序列的有效检出，灵敏度更好，能检测的孕周也更早。技术方案与技术平台的准确性越好，就越能保证受检样本中目的序列的正确检出，防止假阳性及假阴性结果。因此，如果能发明具有足够灵敏度准确性的技术与方法，能从高模板背景条件下有效检出低比例痕量目标序列，即可应用于复杂样本中低比例痕量目标等位基因或多态性位点的有效检测，而实现诸如上述隐性遗传病的排除性产前诊断、亲缘关系的排除性分析、嵌合状态追踪等遗传分析；也可应用于高杂质背景下痕量目标基因检测的法医物证。另外，其应用范围不局限于人类，还可应用于鼠、猪等哺乳动物孕期母体血浆游离dna的子代遗传分析。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供一种微滴式数字pcr检测低比例痕量目标基因的遗传分析方法，该微滴式数字pcr检测低比例痕量目标基因的遗传分析方法具有以下优点，具体的：

1、能直接从高丰度核酸背景条件下，对低比例痕量目的基因的拷贝数进行绝对定量，直接反映受检目的基因的拷贝数及其所占比例。从而实现是否存在等位基因来源的快速检测和直接遗传分析，本发明方法灵敏度高、准确可靠，结果分析简单，所需模板量少，通过实验也证实本发明的方法准确可靠；

2、采用微滴式数字pcr策略，将检测体系制备成近2万个独立pcr体系微滴，有效避免了各pcr反应间的相互干优而保证了高灵敏度扩增效率；

3、采用低tm值taqman探针荧光pcr策略，等位基因特异性探针只与待检靶序列有效结合，有效避免了非特异性杂交所导致的假阳性，而保证了检测体系的高准确性；

4、采用双重taqman微滴式荧光pcr技术，以短片段扩增子设计方式，可保证短片段长度游离dna的模板有效性，实现了靶序列高灵敏度有效扩增。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现。

一种微滴式数字pcr检测低比例痕量目标基因的遗传分析方法，包括有如下步骤，具体的：

1、分别选取目的基因、参比基因的扩增序列；

2、分别设计目的基因和参比基因扩增序列的引物、荧光探针；

3、样本采集及dna抽提：edta抗凝外周全血，及时分离血浆或白细胞团并抽提血浆游离dna或基因组dna；

4、样本检测：以待检血浆游离dna样本作为模板，对目的基因和参比基因进行双重微滴式数字pcr反应，检测荧光微滴数绝对值；

5、结果分析：根据各荧光通道荧光微滴计数值对参比基因和目的基因进行拷贝数定量，判断分析检测样本目的基因的拷贝数比例及阴阳性结果。

优选的，所述参比基因和所述目的基因二重pcr反应体系扩增效率一致，相互无干扰。

优选的，所述目的基因单碱基差异序列检测探针的结构，差异位点位于探针中间位±3碱基因之内。

优选的，所述扩增序列为一段gc含量40～60％、长度80～150bp的dna序列，且与基因非扩增区无同源序列。

优选的，扩增的变性温度为94～96℃，退火温度为60～62℃。

优选的，特异性双标记taqman探针的tm值高于扩增引物tm值1-5℃。

优选的，所述参比基因为待检dna样本所属物种基因组中无突变的看家基因或保守序列。

优选的，待检dna样本可来源于哺乳动物所属物种母体血浆游离dna。

优选的，待检dna样本可来源于多物种复杂背景下的基因组dna。

优选的，在进行双重微滴式数字pcr反应前，需先对反应体系进行优化，优化的步骤如下：

1、优化体系中目的基因和参比基因的引物、荧光探针、缓冲液、镁离子、模板dna的浓度，使双重微滴式数字pcr体系中各单重pcr反应的扩增效率达95～100％；

2、优化体系中目的基因的探针浓度，使双重微滴式数字pcr体系检测结果准确，无假阳性结果。

本发明的有益效果为：本发明所述的一种微滴式数字pcr检测低比例痕量目标基因的遗传分析方法，其包括有如下步骤：1、分别选取目的基因、参比基因的扩增序列；2、分别设计目的基因和参比基因扩增序列的引物、荧光探针；3、样本采集及dna抽提：edta抗凝外周全血，及时分离血浆或白细胞团并抽提血浆游离dna或基因组dna；4、样本检测：以待检血浆游离dna样本作为模板，对目的基因和参比基因进行双重微滴式数字pcr反应，检测荧光微滴数绝对值；5、结果分析：根据各荧光通道荧光微滴计数值对参比基因和目的基因进行拷贝数定量，判断分析检测样本目的基因的拷贝数比例及阴阳性结果。通过上述步骤设计，本发明的微滴式数字pcr检测低比例痕量目标基因的遗传分析方法具有以下优点，具体的：1、能直接从高丰度核酸背景条件下，对低比例痕量目的基因的拷贝数进行绝对定量，直接反映受检目的基因的拷贝数及其所占比例。从而实现是否存在等位基因来源的快速检测和直接遗传分析，本发明方法灵敏度高、准确可靠，结果分析简单，所需模板量少，通过实验也证实本发明的方法准确可靠；2、采用微滴式数字pcr策略，将检测体系制备成近2万个独立pcr体系微滴，有效避免了各pcr反应间的相互干优而保证了高灵敏度扩增效率；3、采用低tm值taqman探针荧光pcr策略，等位基因特异性探针只与待检靶序列有效结合，有效避免了非特异性杂交所导致的假阳性，而保证了检测体系的高准确性；4、采用双重taqman微滴式荧光pcr技术，以短片段扩增子设计方式，可保证短片段长度游离dna的模板有效性，实现了靶序列高灵敏度有效扩增。

附图说明

下面利用附图来对本发明进行进一步的说明，但是附图中的实施例不构成对本发明的任何限制。

图1为β^cd41-42/βⁿ和βⁿ/βⁿ的血浆游离dna样本ddpcr检测结果：上方数据表中，a01为βⁿ/βⁿ样本，b01为β^cd41-42/βⁿ样本；中间荧光分布图为βⁿ/βⁿ样本，下方荧光分布图为β^cd41-42/βⁿ样本；左侧分布图为fam荧光通道参比基因β-actin靶序列，右侧为hex荧光通道目标基因β-cd41-42靶序列。

图2为人类基因组snp位点rs3746g/c杂合子个体rs3746g等位基因微滴式数字pcr检测结果图：fam通道为2拷贝参比基因(53copies/μl)，hex通道为1拷贝的rs3746g等位基因(26.3copies/μl)，符合1/2比例靶值。

图3为人类基因组snp位点rs3746g/c等位基因浓度梯度微滴式数字pcr检测结果线性回归分析图。

具体实施方式

本发明的技术方案中的要求及方法原理如下：

(1)技术方案与策略：本发明设计的技术方法，旨在高核酸背景条件下，有效检出低比例痕量目标基因序列。据现有的研究报道，虽然微滴式数字pcr(ddpcr)具有抗干扰和高灵敏度的特点，但在某一检测范畴或应用领域，所面临的难题是如何将检测目的结合现实的样本类型和靶基因特点，确定结果分析模式及质量控制措施，以形成具体可操作的技术方案与策略；

在目前低比例痕量dna目标序列检测的现实需要，主要有以下几个方面：①针对隐性遗传病，只有当夫妇双方都将突变基因遗传给胎儿，才会是此遗传病的重症患者；所以，只要确定父方未将突变基因遗传给胎儿，即可排除重症患儿的可能，可免除穿刺手术胎儿取样产前基因诊断；据此，如果夫妇双方的致病基因突变位点不同，比如夫方为β-地贫cd26突变、女方为β-地贫cd17突变，那么在合适的孕周，只要在女方血浆游离dna中未检测到夫方的β-地贫cd17突变，则可排除胎儿为重症地分的可能；如果夫妇双方的致病基因突变位点相同，则可通过分析与夫方突变基因连锁的差异性多态位点，如夫妇双方均为β-地贫cd17突变，某一连锁snp位点，女方为t/t，夫方为t/a且突变单倍型为a，那么在合适的孕周，只要在女方血浆游离dna中未检测到此snp位点的a碱基等位基因，即可排除胎儿为重症地分的可能；②针对体细胞突变的恶性肿瘤，其瘤体细胞存在与正常组织细胞不同的等位基因突变位点标志，手术切除或(和)化疗后，定期检测患者外周血浆游离dna中此肿瘤特异等位基因，则可监测此肿瘤是否有转移或复发；③骨髓移植治疗后，是否为宿主抗移植物或移植物抗宿主的移植失败，还是宿主与移植物嵌合状态的移植成功，则以宿主与移植物之间的等位基因多态位点差异，如某等位基因snp位点，宿主为t/t，移植物为a/a，那么可以对宿主外周全血中的a碱基等位基因进行定量检测和比例分析，据此嵌合状态而判断预后和指导用药；④同种属病原体混合物中致病高危型别的筛检，如人乳头瘤病毒(hpv)16和18型长期感染可能与女性宫颈癌的发生有关，以hpv的保守序列为参比序列、高危型特异序列为目标序列，对宫颈拭子等样本中总hpv和高危型hpv进行定量和比例分析，可为疾病的诊断、治疗和预后提供依据；

有鉴于此，以待检所属物种基因组中无突变的看家基因或保守序列为参比基因，以待检的特异性等位基因或多态位点序列为目的基因，分别设计特异性pcr扩增引物及双荧光标记taqman探针。其中，参比基因探针为5’端fam荧光、3’端bhq1淬灭标记，目的基因探针为5’端hex荧光、3’端bhq1淬灭标记。建立基于bio-rad2×ddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)的荧光pcr扩增体系，于bio-radqx200ddpcr系统配套dropletgenerator制备微滴；然后转移微滴至96孔pcr板，封膜后于bio-radc1000pcr仪扩增；扩增完成后，直接将pcr反应板置qx200dropletreader进行微滴计数及荧光信号检测。仪器配套软件分别显示fam和hex荧光通道计数的总微滴数和具有荧光信号的微滴量，有一定强度荧光信号的微滴即代表此微滴中有受检dna模板目标序列。fam标记的为参比基因，既可作为判断检测体系是否扩增正常的内参反应，又可作为受检所属物种dna模板的总拷贝数计算目标基因拷贝数比例，还可以评估游离dna模板的上样量。hex标记的为目标基因序列，如果某些微滴的hex荧光信号达到一定强度，则表示此微滴中包含目标基因序列，即检测结果阳性，这也是受检目标基因绝对定量的数据来源。再以目标基因的绝对定量拷贝数与参比基因dna模板总拷贝数相比，计算目标基因拷贝数比例；

(2)参比基因和目标基因引物及探针设计原则及通用要求：基于双标记taqman探针的荧光pcr，有引物特异性与探针特异性两个途径，保证其中之一即可保证检测体系的特异性。以看家基因或保守序列的参比基因，保证无非特异扩增的引物特异性为首选，如果特殊情况下不能完全保证其特异性，则保证探针序列的单一特异性。以待检等位基因或多态位点序列为基础的目标基因，一般情况下，特异性位点(如snp)一定范围的上下游序列，不同的基因型或单倍型之间无差异，所设计的引物是扩增此序列范围，无待检基因型或单倍型特异性，因而所设计的taqman探针，要求待检特异位点位于探针序列中间±3个碱基之内，以保证探针特异性而保证检测体系的准确性，如：t/a杂合的snp位点，待检基因型为a，探针序列为31bp，那么此a碱基位于此探针序列的12－18位置，以保证此探针不会与基因型为t的序列发生非特异杂交；

(3)检测体系中双标记taqman探针的tm值要求：按一般的荧光pcrtaqman探针设计要求，其tm值高于引物tm值5-10℃，通常情况下，引物的退火温度60℃左右，taqman探针的tm值为65-70℃。此技术方案适用于常规荧光定量pcr体系，但在微滴式数字pcr中，各微滴反应体系独立，灵敏度高，按此常规设计方案，易导致假阳性结果。本发明中，taqman探针的tm值只高于引物tm值1-4℃(61-64℃)；

(4)短片段扩增子设计：某些受检样本，不但为高丰度核酸背景条件下的低比例痕量dna模板，而且目的基因dna模板的来源，可能为基因组dna降解的残留片段，也可能为细胞凋亡所释放的dna片段，还可能为胎儿dna经胎盘屏障而进入母体血浆，这些模板均为短片段。所以，为了保证pcr扩增灵敏度，除对体系组份的常规优化外，本发明还采用了短扩增子设计，即引物设计pcr扩增序列小于150bp，以保证pcr体系扩增效率和敏感性，绝大部分待检序列模板能有效检出；

(5)双重微滴式数字pcr反应体系设计：为保证检测体系dna模板的一致性及比例分析的准确性，建立的pcr检测体系，为目的基因与参比基因在同一反应管进行同步检测的双重微滴式数字pcr反应体系；

(6)质量控制及数据分析模式：根据微滴式数字pcr技术原理及检测目的，必须控制检测体系的dna上样量，以保证达到荧光值的阳性微滴中，绝大部分有且只有1个、极少数为2个或2个以上待检dna模板，符合泊森分布规律，才能准确进行拷贝数绝对定量。本发明中，以fam标记参比基因的阳性微滴数对此方面进行分析评估。当检测的总微滴数为10000时，fam标记阳性微滴数不能超过3000(30％)，以保证绝大部分阳性微滴中只有1个dna模板，能准确地对此检测体系中dna模板进行绝对定量。而对于待检的低比例目标基因，其hex荧光标记阳性微滴数会大大少于fam标记参比基因，其阳性微滴数更能直接反映其真实拷贝数。目标基因绝对拷贝数÷参比基因绝对拷贝数＝目标基因的比例。值得注意的是，完全杜绝假阳性和假阴性扩增尚不现实，所在数据及结果分析时，必须以方法的灵敏度范围为依据，如灵敏度为≥0.5％，而某样本的目的基因比例检测结果为0.2％，则说明此结果可信度低，可能由个别微滴中的假阳性扩增所致。

下面结合具体的实施方式来对本发明进行说明。

实施例1微滴式数字pcr检测母体游离dna中父源突变基因的β-地贫无创产前基因诊断：

本实施方案选择男方为β-地贫基因cd41-42突变(基因型β^cd41-42/βⁿ)、女方为其他β-地贫基因突变携带的志愿者为检测对象，应用本发明，以β-actin基因为参比序列，β-地贫cd41-42突变基因为目标序列，设计特异性引物和taqman探针，建立微滴式数字pcr检测体系；通过对目标基因浓度梯度样本的检测进行准确性、灵敏度和线性检测范围评价，并对20例孕妇血浆样本的检测进行应用性评价。以观察本发明用于高丰度低比例痕量目标基因检测和遗传分析的可行性与有效性，以及应用效果。

选择依据及代表性：

β-地贫属常染色体隐性遗传方式，当夫妇双方均为β-地贫基因携带者时，其所孕胎儿即有1/4的机率为β-地贫基因纯合或双重杂合的中重型地贫患儿。目前临床上常规采用的β-地贫产前诊断策略，是于相应的孕周采集胎儿绒毛、羊水或脐带血样品，通过dna分析以确定受检胎儿β-地贫基因型。这种侵入性的穿刺取样具有一定的流产风险，采样方式也受对应孕周的限制，还存在穿刺过程中母源污染所致假阳性或假阴性误诊。近年来，以孕妇外周血中游离胎儿dna为样本的无创产前诊断(nipd)已成为关注的焦点，是当前国内外致力于研究发展的技术领域。

根据β-地贫的分子基础和遗传规律，只有当夫妇双方均将基因突变单倍型遗传给胎儿，才发生β-地贫基因纯合或双重杂合的重型患儿，所以只要确定父方未将基因突变单倍型遗传给胎儿，即可排除重型β-地贫患儿的可能。目前的研究报道所采用的技术方法和诊断方案，其灵敏度与准确性尚不理想。研究报道孕期≥10周的孕妇血浆游离dna中，胎儿游离dna的比例＞3％。本实施例即以夫妇双方为非同型，且父方为cd41-42突变的β-地贫携带孕妇血浆游离dna为样本，采用本发明，建立一种微滴式数字pcr方法，实现β-地贫基因cd41-42突变的快速无创产前基因诊断，以验证本发明的可行性与有效性。

实验步骤

1、目的基因和参比基因扩增序列的选择：

以人类7号染色体上的看家基因β-actin为参比序列，β-地贫基因cd41-42(-cttt)突变为目标序列，按本发明的技术策略要求，选取扩增序列：

β-actin基因的扩增序列为：

agtgaggaccctggatgtgacagctccccacacaccacaggaccccacagccgacctgcccaggtcagctcaggcaggaaagac(seqno.1)；

β-地贫基因cd41-42(-cttt)突变扩增序列为：

gtctattttcccacccttaggctgctggtggtctacccttggacccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccactcctgatgctgttatgggca(seqno.2)。

2、引物和双标记taqman探针设计：

设计相应的引物和双标记taqman探针，包括特异性扩增β-地贫基因cd41-42(-cttt)突变序列的上下游引物和探针，β-actin基因的上下游引物和探针，各引物、探针序列见表1；表中，探针比引物的tm值高1-5℃。

表1目的基因sry、参比基因β-actin的引物、荧光探针及封闭探针序列表

3、样本准备：

目标基因靶序列浓度梯度样本配制：将已备的4份βⁿ/βⁿ和2份β^cd41-42/βⁿ已知基因型血浆样本，按基因型分别进行混合。然后，于基因型为βⁿ/βⁿ的血浆中，按10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0％的比例直接加入基因型为β^cd41-42/βⁿ的混合血浆，每个比例浓度平行配制2份，每份总体积500μl，用于方法学的建立与评价。并收集男方为β-地贫基因cd41-42突变(基因型β^cd41-42/βⁿ)、女方为其他β-地贫基因突变携带的志愿者夫妇20对，于孕10-16周，抽取孕妇外周全血10ml，edta抗凝，作为方法学评价样本；

血浆游离dna提取及样本准备：用qiaampcirculatingnucleicacidkit(德国qiagen公司产品，货号55114)，按操作说明，将18份目标基因靶序列浓度梯度血浆样本，已知基因型为βⁿ/βⁿ和β^cd41-42/βⁿ血浆样本各1份及20份孕妇血浆样本(每份取500μl)，按操作说明，提取游离dna，100μl灭菌双蒸水洗脱，-20℃保存备用。

4、双微滴式数字pcr(ddpcr)检测体系优化：

经过一系列的优化、调整及扩增效率评价，所确定的微滴式数字pcr(ddpcr)检测体系为：检测体系总体积20.0μl，含2×ddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)10.0μl、10pmol/μlβ-cd41-42和β-actin正反向引物及taqman探针各0.3μl、血浆游离dna(1-5ng/μl)模板4.0μl、灭菌双蒸水4.2μl。配制好的pcr扩增体系，于bio-radqx200ddpcr系统配套dropletgenerator按操作说明制备微滴；然后转移微滴至96孔pcr板，封膜后于bio-radc1000pcr仪扩增(pcr反应条件为95℃预变性10min，94℃30sec+60℃1min40个循环，98℃10min)。扩增完成后，直接将pcr反应板置qx200dropletreader，按仪器和软件操作说明，进行微滴计数及荧光信号检测。

5、数据及检测结果分析：

仪器配套软件分别显示具有fam和hex荧光信号微滴数(即靶序列拷贝数)的绝对值及分布直方图，fam标记的为β-actin看家基因，既可作为判断检测体系是否扩增正常的内参反应，又可作为游离dna的总拷贝数计算目标基因拷贝数比例，还可以评估游离dna模板的上样量。hex标记的为目标基因序列，如果此通道检出荧光微滴，则说明待检游离dna中有β-地贫cd41-42突变基因目标序列。

6、检测方法的灵敏度与准确性验证：

应用本研究建立的方法，检测已知基因型(βcd41-42/βn、βn/βn)和目标基因浓度梯度血浆游离dna样本，每样本平行检测3次，进行方法学准确性、灵敏度和线性检测范围评价。

7、样本检测：

应用本研究建立的方法，检测已收集的20例孕妇血浆游离dna样本，每样本平行检测3次。并将检测结果与随访的确诊基因型进行对比分析。

实验结果：

1、β^cd41-42/βⁿ和βⁿ/βⁿ的已知基因型血浆游离dna样本检测结果：

如图1所示，βⁿ/βⁿ样本中只检出参比基因β-actin靶序列，β^cd41-42/βⁿ样本中检出参比基因β-actin和目标基因β-cd41-42靶序列。β^cd41-42/βⁿ样本中，参比基因β-actin的相对拷贝数为2，β-cd41-42突变基因的相对拷贝数为1，此样本的检测结果分别为108copies/μl和53copies/μl(相对拷贝数比例≈2:1)，说明两个pcr反应的扩增效率一致，结果准确可靠；

2、检测体系的灵敏度与线性范围：

目标基因浓度梯度血浆游离dna样本的检测结果见表2，目标序列比例为已知靶值，cd41-42微滴比例为检测结果。检测结果显示，当目标序列比例为5.00％-0.50％时，相对误差均小于0.05，此浓度范围的线性回归方程y＝1.0101x-0.0071，r²＝0.9994。由此可见，目标序列拷贝数比例达0.50％时，此方法能准确有效检出。

表2目标基因浓度梯度样本的ddpcr检测结果

注：#加入的βcd41-42/βn血浆为突变杂合子，所以阳性模板比例只为加入血浆量的一半。*单位为copies/μl。

3、样本检测结果：

20例孕妇血浆游离dna样本的检测结果见表3。9例检出β-地贫基因cd41-42突变，阳性模板的比例均大于2.00％。所有阳性和阴性样本，与随访确诊的胎儿基因型结果100％相符。

表320例孕妇血浆游离dna样本的检测结果

注：*其数字为0.00时，即表示母体血浆游离dna中未检出cd41-42突变基因序列，可排除胎儿为重型β-地贫患儿的可能。#母体血浆游离dna中检出cd41-42突变基因序列，随访的羊水穿刺产前基因诊断结果显示胎儿为双重杂合重型β-地贫患儿。

结论：本实施例的实验结果证明，本发明所述的方法可广泛用于低比例痕量目标基因的遗传分析。

实施例2微滴式数字pcr检测差异snp位点等位基因的造血干细胞移植后的嵌合体分析：

本实施方案选择人类造血干细胞移植为检测对象，在已确定宿主与供体间差异性单核苷酸多态性(snp)位点的基础上，应用本发明，以β-actin基因为参比序列，以差异性供体snp等位基因为目标序列，设计特异性引物和taqman探针，建立微滴式数字pcr检测体系；通过对目标等位基因浓度梯度样本的检测进行准确性、灵敏度和线性检测范围评价，并对2例造血干细胞移植后全血样本的检测进行应用性评价。以观察本发明对嵌合状态遗传分析的可行性与有效性，以及应用效果。

选择依据及代表性：

造血干细胞移植是目前治疗白血病和地中海贫血等血液系统疾病的最有效手段之一。随着移植理论和技术的进步，异基因造血干细胞移植的应用越来越广泛。为判断移植是否成功并及时地实施免疫抑制治疗、预后等，人们需要对移植后受体体内形成的供、受者外周血细胞嵌合体进行检测并观察其变化趋势。此外，嵌合体分析还可为移植相关的其他免疫学研究提供良好的实验手段。由此可见，嵌合体分析技术的检测灵敏度和定量的精确性尤为重要。

从遗传学的角度来说，异基因的供受者外周血细胞嵌合体本质上是两个基因型不同的个体之细胞的混合物。因此，利用人体染色体上的一些遗传标记可以区分供受者细胞并对供受者细胞的比例进行定量分析。snp为第三代遗传标记，供体与受体之间的snp位点等位基因的拷贝数，分别代表两者的基因量，之间的比例即为嵌合程度。

因此，本实施例以人类造血干细胞移植患者外周全血中差异性snp等位基因为靶点，应用本发明，建立一种微滴式数字pcr方法，实现造血干细胞移植患者外周供受体嵌合状态准确检测，以验证本发明的可行性与有效性。

实验步骤：

1、目的基因和参比基因扩增序列的选择：

以人类7号染色体上的看家基因β-actin为参比序列，以人类1号染色体上snp位点rs37460(g/c)等位基因为目标序列，按本发明的技术策略要求，选取扩增序列：

β-actin基因的扩增序列为：

agtgaggaccctggatgtgacagctccccacacaccacaggaccccacagccgacctgcccaggtcagctcaggcaggaaagac(seqno.9)；

rs37460(g/c)等位基因扩增序列为：

accggattagattatctaagcaaatgttgtgggaacaggtaacatagaaa(g/c)

tacctagtgcaccactgggcatatagtaggtgctcaataaatgctttcccc(seqno.10)。

2、引物和双标记taqman探针设计：

按本发明方法，设计相应的引物和双标记taqman探针，包括特异性扩增rs37460(g/c)等位基因的上下游引物和探针，β-actin基因的上下游引物和探针，各引物、探针序列见表1；表中，探针比引物的tm值高1-5℃。

表1目的基因sry、参比基因β-actin的引物、荧光探针及封闭探针序列表

3、样本准备：

rs37460(g/c)等位基因靶序列浓度梯度样本配制：将已备的rs37460(g/g)和rs37460(c/c)已知基因型外周全血样本，按0+100μl、0.05+0.95μl、0.1+0.9μl、0.2+0.8μl、0.3+0.7μl、0.7+0.3μl、0.8+0.2μl、0.9+0.1μl、0.95+0.05μl、1.0+0μl的比例直接进行混合，每个比例浓度平行配制2份，每份总体积100μl，用于方法学的建立与评价。另收集已确定供者rs37460基因型为g/g、受者为c/c的造血干细胞移植后受者全血1份，供者rs37460基因型为c/c、受者为g/g的造血干细胞移植后受者全血1份，作为样本进行检测；

外周全血基因组dna提取及样本准备：用传统酚-氯仿法，提取外周全血基因组dna，灭菌双蒸水溶解，稀释至10-20ng/μl，-20℃保存备用。

4、双微滴式数字pcr(ddpcr)检测体系优化：

经过一系列的优化、调整及扩增效率评价，所确定的微滴式数字pcr(ddpcr)检测体系为：检测体系总体积20.0μl，含2×ddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)10.0μl、10pmol/μlrs37460和β-actin正反向引物各0.3μl、10pmol/μlβ-actintaqman探针0.3μl、10pmol/μlrs3746-g(或rs3746-c)探针0.3μl、基因组dna(10-20ng/μl)模板1.0μl、灭菌双蒸水7.2μl。配制好的pcr扩增体系，于bio-radqx200ddpcr系统配套dropletgenerator按操作说明制备微滴；然后转移微滴至96孔pcr板，封膜后于bio-radc1000pcr仪扩增(pcr反应条件为95℃预变性10min，94℃30sec+60℃1min40个循环，98℃10min)。扩增完成后，直接将pcr反应板置qx200dropletreader，按仪器和软件操作说明，进行微滴计数及荧光信号检测。(rs3746-g和rs3746-c分别与β-actin组合成反应管，即如果须同时检测rs3746-g和rs3746-c两种基因型，则须分为两个反应管分别进行检测)。

5、数据及检测结果分析：

仪器配套软件分别显示具有fam和hex荧光信号微滴数(即靶序列拷贝数)的绝对值及分布直方图，fam标记的为β-actin看家基因，既可作为判断检测体系是否扩增正常的内参反应，又可作为游离dna的总拷贝数计算目标基因拷贝数比例，还可以评估基因组dna模板的上样量。hex标记的为目标基因序列，如果此通道检出荧光微滴，则说明待检基因组dna中有rs3746-g(或c)等位基因目标序列。

6、检测方法的灵敏度与准确性验证：

应用本研究建立的方法，检测rs37460(g/c)等位基因靶序列浓度梯度样本，每样本平行检测3次，进行方法学准确性、灵敏度和线性检测范围评价。

7、样本检测：

应用本研究建立的方法，检测1例已知rs3746基因型为g/c杂合的个体，以及已收集的2例造血干细胞移植后受者外周全血基因组dna样本，分别检测rs3746-g和rs3746-c两种基因型的拷贝数比例，每样本平行检测3次。并将检测结果与目前常规采用的荧光定量pcr结果进行对比分析。

实验结果：

1、检测体系的灵敏度、准确性与线性范围目标基因浓度梯度样本的检测结果见表2，目标序列比例为已知靶值，rs3746微滴比例为检测结果。检测结果显示，当等位基因目标序列比例为0.05-1.00时，相对误差均小于0.05，此浓度范围的rs3746-g线性回归方程y＝0.995x+0.0015，r²＝0.9991；rs3746-c线性回归方程y＝1.0054x+0.0006，r²＝0.9999。由此可见，等位基因目标序列拷贝数比例达0.50％时，此方法能准确有效检出。

表2rs3746-g等位基因浓度梯度样本的ddpcr检测结果

注：#g为rs37460(g/g)的外周全血，c为rs37460(c/c)外周全血，此列表示将这两种基因型的外周全血按此体积进行混合，单位为μl*单位为copies/μl。

表3rs3746-c等位基因浓度梯度样本的ddpcr检测结果

注：#g为rs37460(g/g)的外周全血，c为rs37460(c/c)外周全血，此列表示将这两种基因型的外周全血按此体积进行混合，单位为μl*单位为copies/μl。

3、样本检测结果：

1例rs3746基因型为g/c杂合的个体的检测结果见图2，rs3746为g的等位基因为总拷贝数的1/2，检测结果显示检测值与靶值相符；2例造血干细胞移植后受者全血样本的检测结果见表4。样本1的检测结果为0.1725(rs3746-c)+0.8277(rs3746-g)＝1.0002；样本2的检测结果为0.7651(rs3746-c)+0.2347(rs3746-g)＝0.9998。而目前常规的荧光定量pcr检测则分别为0.1913(rs3746-c)+0.8346(rs3746-g)＝1.0259、0.7043(rs3746-c)+0.2685(rs3746-g)＝0.9728。相比较，本方法的sd明显降低，精密度大大增加，结果也更加准确可靠。

表42例造血干细胞移植后受者全血样本rs37460等位基因检测结果

注：*

结论：本实施例的实验结果证明，本发明所述的方法可广泛用于低比例痕量目标基因的遗传分析。

以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。