肿瘤免疫T细胞检测试剂盒和检测方法与流程

本发明属于精准生物医学检测领域，更具体地说，涉及利用定量pcr扩增检测与肿瘤免疫精准医疗临床前和临床研究相关的免疫系统特异基因在人体外周血液t细胞中的定量表达谱以及特异pcr引物。

背景技术：

肿瘤免疫治疗是应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性，增强机体免疫应答，并应用体外扩增免疫细胞或效应药物输注患者体内，协同机体免疫系统抑制肿瘤生长(kershawetal.,2013；barrettetal.,2014；meleroetal.,2015)。上世纪五十年代burnet和thomas提出了“免疫监视”理论，认为机体中经常会出现的突变的肿瘤细胞可被免疫系统所识别而清除，为肿瘤免疫治疗奠定了理论基础(burnet,1967)。近年来，肿瘤免疫治疗已在部分肿瘤类型如淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌等的治疗中表现出了极佳的抗肿瘤活性，一些肿瘤免疫治疗抗体药物已获得美国fda(foodanddrugadministration,fda)批准临床应用。肿瘤免疫治疗由于其突出的疗效和创新性，2013年美国《科学》杂志把肿瘤免疫治疗选为当年最大的科学突破(science,2013)，2015年又将肿瘤免疫联合治疗列为最值得关注的四项科学进展之一(travis,2015)。肿瘤免疫治疗有望成为继手术，化疗，放疗，靶向治疗后肿瘤治疗领域的一场革新。然而，免疫细胞对肿瘤细胞的有效识别，以及肿瘤细胞对免疫细胞活性的抑制，是肿瘤免疫治疗面临的挑战和难题。

car—t(嵌合抗原受体t细胞)肿瘤免疫治疗技术：t细胞表面表达激活性受体如：cd28、ox40、gitr、cd137、cd27、hvem等，这些受体的激活能有效增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。针对免疫细胞特异识别肿瘤细胞有效性，car—t(嵌合抗原受体t细胞)疗法应运而生：即通过精确检测患者肿瘤细胞特异性，在体外对患者t细胞改造表达对自身肿瘤细胞特异的嵌合抗原受体，再回输到患者体内，让免疫系统高效特异识别并杀伤肿瘤细胞。如：alfacd19.4-1bb.cd3zetacarts已开始用于淋巴瘤的临床治疗探索。

肿瘤免疫检查点抑制治疗技术：t细胞表面还表达免疫检查点抑制性受体如：ctla4、pd1、gitr、tim3、btla、lag3等，这些受体的活化将抑制t细胞的抗癌功能。针对肿瘤细胞对免疫系统的抑制是通过激活免疫细胞的抑制性受体实现的，以抗体药物如pd—1(程序性细胞死亡1)抗体药物为代表的免疫检查点抑制疗法已用成功于多种肿瘤的免疫临床治疗。

免疫治疗t细胞检测试剂盒与检测方法：无论是car—t治疗技术还是免疫检查点抑制治疗技术的成功实施，需要前期个性化的精准检测，为治疗方法提供精确的靶点。现代生命科学与临床医学的进步，尤其是人基因组测序计划的完成，以及定量pcr技术等分子诊断检测技术的发展，为肿瘤的个性化精准检测与精准医疗提供了可能。然而，针对目前肿瘤免疫的免疫细胞定量pcr检测靶点不完善。针对目前肿瘤免疫存在的缺乏对免疫细胞受体和配体、细胞因子等基因表达的有效检测的问题：(1)在多种免疫细胞中，外周血液t细胞对肿瘤细胞有强的细胞毒性；(2)有多种激活性受体参与t细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，而且不同类型的肿瘤对不同的激活性受体有响应性；(3)肿瘤细胞可能通过激活t细胞的抑制性受体，从而使t细胞失活，其中不同类型的肿瘤可能活化不同的抑制性受体通路；(4)在免疫治疗过程中可能产生不良的细胞因子风暴，要及时对治疗过程进行调整；(5)患相同肿瘤的患者之间有个体差异，需要进行个性化的肿瘤免疫治疗和其它诊治手段。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种肿瘤免疫t细胞检测试剂盒以及检测方法，其能够高效定量检测肿瘤免疫治疗前、治疗过程中与治疗后相关免疫细胞基因。

根据本发明的第一方面，提供了一种肿瘤免疫t细胞检测试剂盒，包括基于sybr-green定量pcr扩增对人体外周血液t细胞中免疫相关靶基因进行pcr扩增以检测其特异定量表达的特异引物(对)，所述免疫相关靶基因包括受体和配体相关靶基因、nk细胞相关靶基因以及关键细胞因子基因，

所述受体和配体相关靶基因包括：2b4、b7-1、b7-2、btla、c4a、cd4、cd8a、cd11b、cd11c、cd27、cd28、cd3d、cd3e、cd3g、cd40、cd40l、cd48、cd70、cd74、cd80、cd86、cd96、cd137、cd155、cd160、cd226、cd247、ceacam1、ctla4、foxp3、galectin3、galectin9、gitr、gitrl、gp100、hhla2、hvem、klrg-1、lag3、light、magea3、hla-a、hla-b、hla-dra、hla-drb1、mlana、ox40、ox40l、pd1、pdl1、pdl2、tra、trb、tcf7、tigit、tim1、tim3、trav40、vista，与每个所述受体和配体相关靶基因所对应的特异引物的dna序列如表1所示；

所述nk细胞相关靶基因包括：cd16、cd94、fas、fasl、hla-e、il-2、il-12、il-15、kir、mic-a、nkg2a、nkg2d、trail、trailr、ulbp1，与每个所述nk细胞相关靶基因所对应的特异引物的dna序列如表2所示；

所述关键细胞因子基因包括：granzymeb、ifn-gamma、il-4、il-5、il6、il10、il13、perforin、tgf-beta、tnf-alpha，与每个所述关键细胞因子基因所对应的特异引物的dna序列如表3所示。

本发明的检测试剂盒还可以包括：

多孔pcr反应板，每对特异引物对应容纳于pcr反应板的一个孔，并且pcr反应板还包括至少一个空白阴性对照孔和至少一个看家基因孔，

其中空白阴性对照孔中不含任何特异引物，所述至少一个看家基因孔中含有与该看家基因所对应的特异引物。

通过上述空白阴性对照以及看家基因(阳性)对照，能够快速辅助判断检测结果是否准确。

根据本发明，pcr反应板的每个孔中均含有除人体外周血液t细胞cdna外包括特异引物在内的pcr反应所需试剂。空白阴性对照孔中因此也含有pcr相关试剂以能够执行比对判断。

根据本发明，看家基因可以包括：beta-actin、ppia、tbp、18s，与每个看家基因所对应的特异引物的dna序列如表4所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种人体外周血液t细胞中免疫相关靶基因检测方法，包括：基于sybr-green定量pcr扩增，利用特异引物对人体外周血液t细胞中免疫相关靶基因进行pcr扩增以检测其特异定量表达，其中所述免疫相关靶基因包括受体和配体相关靶基因、nk细胞相关靶基因以及关键细胞因子基因，

所述受体和配体相关靶基因包括：2b4、b7-1、b7-2、btla、c4a、cd4、cd8a、cd11b、cd11c、cd27、cd28、cd3d、cd3e、cd3g、cd40、cd40l、cd48、cd70、cd74、cd80、cd86、cd96、cd137、cd155、cd160、cd226、cd247、ceacam1、ctla4、foxp3、galectin3、galectin9、gitr、gitrl、gp100、hhla2、hvem、klrg-1、lag3、light、magea3、hla-a、hla-b、hla-dra、hla-drb1、mlana、ox40、ox40l、pd1、pdl1、pdl2、tra、trb、tcf7、tigit、tim1、tim3、trav40、vista，与每个所述受体和配体相关靶基因所对应的特异引物的dna序列如表1所示；

所述nk细胞相关靶基因包括：cd16、cd94、fas、fasl、hla-e、il-2、il-12、il-15、kir、mic-a、nkg2a、nkg2d、trail、trailr、ulbp1，与每个所述nk细胞相关靶基因所对应的特异引物的dna序列如表2所示；

所述关键细胞因子基因包括：granzymeb、ifn-gamma、il-4、il-5、il6、il10、il13、perforin、tgf-beta、tnf-alpha，与每个所述关键细胞因子基因所对应的特异引物的dna序列如表3所示。

根据本发明，检测人体外周血液t细胞中免疫相关靶基因的特异定量表达优选包括：

提供未引入特异引物的阴性空白对照pcr扩增反应；

提供阳性对照看家基因pcr扩增反应；

检测所有扩增产物的荧光强度并获取相应的荧光强度曲线；

判断阴性空白对照pcr扩增反应产物的荧光强度曲线是否为水平直线(或无熔解曲线峰)或其ct值是否需要大于设定值，如果是则继续后续判断步骤，如果否(认定为检测失败或假阳性)则终止后续判断步骤；

判断阳性对照看家基因pcr扩增反应产物的荧光强度曲线是否具有对数扩增曲线，且是否具有单一熔解曲线峰，如果是则进一步判断其ct值是否小于设定值，如果是则继续后续判断步骤；如果否则(认定为检测失败)终止后续判断步骤；

如果免疫相关靶基因扩增反应产物的荧光强度曲线具有对数扩增曲线，并具有单一熔解曲线峰且其ct值小于所述设定值，则判定该免疫相关靶基因特异表达；如果为水平直线或ct值需要大于所述设定值，则判定不含该靶基因(如果为其它情况例如具有多个熔解扩增曲线峰，则认定检测失败，重新执行检测)。

在本发明中，ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。每个样品的ct值与该样品的起始量(拷贝数)的对数存在线性关系，起始量越多，ct值越小。可以利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代ct值。这样，只要获得未知样品的ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始量，从而对样品进行定量。在本发明中，关于ct值的上述设定值优选设定为40。

本发明利用sybr-green定量pcr手段，精准确定靶基因在人体血液细胞中的定量表达谱(例如荧光强度曲线)。从而可以例如将患者的特异靶基因定量表达谱与正常对照人群的定量表达谱进行比较，确定下一步精准医疗技术所需要的个性化治疗靶点。

本发明能成功在人体外周血液t细胞中精准检测免疫系统相关靶基因的定量表达谱，其中包括t细胞激活性受体和抑制性受体，可以为肿瘤患者精准免疫治疗提供靶点；在治疗过程中，对il6和il10等细胞因子的表达分析，能及时检测患者对免疫治疗反应的细胞风暴，为避免不良反应提供指导；对治疗过程中和治疗后的免疫系统状态进行评估，为治疗使用抗体药物的量或回输改造t细胞数目、甚至靶点的调整提供支持。本发明检测全面、快速、定量精准、灵敏度高、成本低。

附图说明

图160个t细胞激活性受体基因、抑制性受体基因，以及其它受体基因、配体基因和相关靶基因特异性扩增产物单一的熔解曲线(meltingcurve)。

图215个nk细胞相关靶基因特异性扩增产物单一的熔解曲线。

图310个关键细胞因子基因特异性扩增产物单一的熔解曲线。

图44个稳定表达常用看家基因特异性扩增产物单一的熔解曲线。

具体实施方式

一、pbmc细胞纯化培养

试剂：

操作：

1.取人外周血15ml，抗凝(eata或肝素)处理，室温15分钟。

2.室温350g离心5分钟，吸出血浆待用。血细胞中加入1倍体积pbsbuffer稀释混匀。(如使用成份血，则加入1倍体积pbsbuffer，稀释混匀。)

3.取15ml离心管，加入5ml淋巴细胞分离液。于上层缓慢加入5ml稀释血细胞。

4.室温450g离心20分钟。血细胞从上至下依次分成血小板层，白细胞层(白膜)及红细胞层。

5.用移液器吸取血小板层(约2ml)。将白细胞层(白膜层，约3ml)转移至新的15ml离心管中。

6.加入10mlpbsbuffer，450g离心20分钟。

7.弃上清，沉淀重悬于10mlpbsbuffer中。

8.200g离心20分钟收集细胞。使用移液器小心吸取培养上清，倾倒会导致细胞损失。

9.细胞计数(仅以cd8⁺tcell为例)。

●调整细胞浓度至50x10⁶cell/ml。

●按每1ml加入cd8⁺enrichedantibodiescocktail50μl，混匀后室温静置5分钟。

●按每1ml加入magnet150μl，混匀后室温静置10分钟，

●将离心管置于磁力架上静置5分钟，吸取上层细胞悬液至新的15ml离心管中。

●重复该操作一次。

●室温离心300g，收集细胞。

●细胞计数。

10.用10％fbs的aim-v培养基重悬细胞沉淀，并调整细胞浓度至2x10⁶cell/ml。

11.按细胞数的1/10加入anti-cd3/cd28dynabeads，加入重组人il-240iu/ml培养液。

12.分装24孔板，每孔1ml，37℃培养。

二、制备pbmc细胞反转录单链cdna标准品

试剂：

trizol试剂lifetechenologiescat#:15596

iiifirst-strandsynthesissystemlifetechenologiescat#:18080-051i制备pbmc细胞总rna

1)室温离心300g，收集细胞。

2)细胞计数。

3)按照10⁷细胞/ml的量，加入trizol试剂，混匀，室温放置10分钟。

4)按照200ul/mltrizol，加入氯仿，剧烈震荡30秒，室温放置10分钟。

5)4度10000g离心15分钟。

6)小心将400ul上清转移到新的1.5ml试管，加入600ul异丙醇，室温放置15分钟。

7)4度10000g离心沉淀总rna。

8)去上清，用1ml80％乙醇洗rna沉淀，10000g室温离心6分钟。

9)小心去上清，室温挥发剩余乙醇，用无rnaase的水溶解rna沉淀，分光光度计确定rna浓度，负80度保存，待用。

ii反转录制备pbmc细胞单链cdna

1)在200ulpcr管中加入1ulrandomprimer，5ug总rna，用无rnaase的水补足体积到12ul。

2)在pcr仪中70度，变性反应5分钟。

3)将pcr管转移到冰浴，放置5分钟

4)准备反应混合液：dntp、dtt、superscriptiiirnapolymerase、5xreactionbuffer，体积8ul。

5)将8ul反应液加入到pcr管中，混匀。

6)在pcr仪中，25度退火反应10分钟；50度延伸反应50分钟，85度灭活10分钟，冷却到4度，反应结束。

7)将pbmc细胞反转录单链cdna保存在负20度，待用。

三、sybr-green基础的定量pcr反应

dbisybrgreenqpcrmastermix德国dbicat#dbi-2043

i设计和合成定量pcr引物

1)获得人体免疫系统相关靶基因和看家基因(总计85个)的cdna全长序列。

表1t细胞受体基因、配体基因、其它基因和定量pcr扩增引物

表1(继续)

表1(继续)

表1(继续)

表2nk细胞相关靶基因和定量pcr扩增引物

表3细胞分子基因、其它基因和定量pcr扩增引物

表4看家基因和定量pcr扩增引物

2)提供针对每个基因cdna序列的特异性pcr引物，pcr全长60-200bp。

具体引物结构参见上述表1至表4。

3)合成并溶解引物，引物浓度10um。

iisybr-green基础的定量pcr

1)将pbmc细胞反转录单链cdna稀释到一定浓度(例如1-5um)。

2)制备反应混合体系：5ul稀释pbmc细胞反转录单链cdna作为扩增，10ul2xsybr-green反应液，1ul靶基因特异pcr引物，4ul水，混匀。

3)在定量pcr仪上进行扩增反应：99度2分钟，一个循环；99度15秒，55度15秒，72度20秒，40个循环；99度15秒，60度15秒，60度到95度，20分钟；95度，15秒；结束。

4)数据分析，检测引物对靶基因的扩增特异性，分析熔解曲线(meltingcurve,参见图1至图4，其中纵坐标为荧光强度，横坐标为靶基因pcr扩增产物大小)。

图1示出了60个t细胞激活性受体基因、抑制性受体基因，以及其它受体基因、配体基因和相关靶基因特异性扩增产物单一的熔解曲线。结果显示本发明的引物对每个靶基因的扩增后产生单一熔解曲线，pcr扩增特异。

图2示出了15个nk细胞相关靶基因特异性扩增产物单一的熔解曲线。结果显示：本发明的引物对每个靶基因的扩增后产生单一熔解曲线，pcr扩增特异。

图3示出了10个关键细胞因子基因特异性扩增产物单一的熔解曲线。结果显示：本发明的引物对每个靶基因的扩增后产生单一熔解曲线，pcr扩增特异。

图4示出了4个稳定表达常用看家基因特异性扩增产物单一的熔解曲线。结果同样显示：筛选的引物对每个靶基因的扩增后产生单一熔解曲线，pcr扩增特异。

四.检测试剂盒组成：

含85对引物的96孔pcr反应板，其中有三个空白阴性对照孔，4个看家基因每个有三个重复孔(以验证试剂盒稳定性)。

每个孔中均含有除外周血液t细胞cdna外的pcr反应所需试剂(包括水)。

本发明克服了肿瘤免疫治疗前诊断和免疫治疗过程中的靶基因检测缺陷，其优点在于：

(1)特异性检测靶基因在外周血液t细胞中的定量表达；

(2)检测多种激活性受体基因在外周血液t细胞中的表达，为car-t肿瘤免疫治疗技术提供靶基因选择参考；

(3)检测多种抑制性受体在外周血液t细胞中的表达，为肿瘤免疫检查点抑制治疗技术提供靶基因选择参考；

(4)检测多种nk细胞相关靶基因的表达，为精准肿瘤免疫医疗提供治疗靶点。

(5)检测多种细胞因子基因，监测在免疫治疗过程中可能产生不良的细胞因子风暴，为及时对治疗过程进行调整提供参考；

(6)患相同肿瘤的患者之间有个体差异，本发明为进行个性化的肿瘤免疫治疗提供理论基础。

当然，本发明也可以针对正常人进行相关靶基因检测，用于科研等非疾病诊断与治疗领域。