一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒的制作方法

本发明属于他汀类药物检测领域，特别涉及一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒。

背景技术：

他汀类药物是使用广泛的降脂药，能有效地防治心脑血管疾病，在美国超过25％的年纪大于45岁的人服用他汀类药物。尤其在冠心病经皮支架植入术(pci)后二级预防中，采用积极的他汀调脂治疗对冠心病防治有重要意义。

他汀类药物随着剂量的升高，降低ldl的作用增强，但同时不良反应发生率也高。他汀类一个主要的毒副反应是肌病，有5～29％的患者会发生他汀引起的肌病(statininducedmyopathy，sim)，主要表现为疲乏、无力、肌痛、肌肉痉挛、有的出现严重危害生命的横纹肌溶解(rhabdomyolysis)，引起患者死亡。肌病影响用药依从性，33％出现肌病的患者会自行停药，引起死亡、再次心梗等心血管事件的发生，对患者的生存构成严重的威胁。根据基因诊断进行个体化用药可保障用药安全、节省医药开支，并已逐渐成为临床治疗的新趋势。尤其是检测下列5种代表性基因具有重要的用药指导意义：

(1)apoe属载脂蛋白家族，主要在肝脏和脑组织中表达，通过多种途径参与机体的脂质代谢，是影响血脂水平的重要内在因素。apoe基因定位于人类19号染色体上，主要有两种单核苷酸多态性，形成3种单倍型，分别为apoe2(388t-526t)、apoe3(388t-526c)和apoe4(388c-526c)。apoe基因多态性被认为是高脂蛋白血症及动脉粥样硬化性血管病的易感候选基因。人群中有6种不同的apoe表型：三种纯合子(e2/2、e3/3、e4/4)和三种杂合子(e3/2、e4/2、e4/3)。其中，apoe3/3是野生型(wild-type)。apoe2携带者的他汀类药物降脂效果好，apoe4携带者他汀类药物的降脂效果较差。

(2)slco1b1基因具有很高的遗传多态性。突变型slco1b1基因引起编码的转运蛋白活力减弱，表现为肝脏摄取药物能力降低，引起他汀类药物血药浓度上升，增加横纹肌溶解症或肌病的发生风险。slco1b1*1a、*1b、*15是常见的基因突变类型，其中*1b、*15是他汀类药物主要不良反应“横纹肌溶解症”的独立决定因子。该突变基因携带者相比未突变者发生肌毒性的风险增加约20倍。服用他汀类药物前对该突变进行检测对发生肌毒性的预测和预防具有重要意义。

(3)cetp胆固醇酯转移蛋白，基因组第一内含子taq1b第277位点的snp(g/a)多态性对他汀类药物的反应效果有明显的影响。其中b1b1基因型和b1b2基因型个体他汀类药物调脂效果好，而b2b2基因型个体对他汀类药物治疗反应较弱。

(4)abcb1多耐药基因1，表达蛋白为药物转运体，基因序列中有两个位点snp多态性对他汀类药物代谢有一定的影响，分别为基因组2677位点和3435位点，这两个位点都为突变型个体使用阿托伐他汀时的降脂效果小。

(5)mthfr高血压患者，tt基因型，用普伐他汀治疗，出现致死性冠心病和非致死性心肌梗塞的风险，比cc基因型高。cc基因型是保护性的基因型，风险低。ct基因型，介于二者之间。

目前，国内有针对他汀类药物代谢基因apoe和slco1b1基因多态性检测的相关试剂盒，但针对5种基因(apoe、slco1b1、cetp、abcbi、mthfr)的检测试剂盒目前还没有任何厂家推出。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒，该试剂盒应用mgb探针与实时荧光pcr技术，具有省时方便、灵敏度高、样品阳性符合率及阴性符合率均99.5％以上等优点；主要用于他汀类药物的个性化用药辅助诊断：辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀等。

本发明的一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测apoe、slco1b1、cetp、abcbi、mthfr位点的引物对和探针对，具体序列如下：

所述试剂盒还包括dna聚合酶、ung酶、dntps、镁离子和pcr缓冲液。

所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

所述试剂盒引物对的浓度为400nm；探针对的浓度为300nm。

所述试剂盒用于定量pcr的反应体系为：总体积25μl，20μlpcrmix和5μldna模板。

所述试剂盒用于定量pcr的反应条件为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃45s，40个循环。

有益效果

本发明应用mgb探针与实时荧光pcr技术，具有省时方便、灵敏度高、样品阳性符合率及阴性符合率均99.5％以上等优点；主要用于他汀类药物的个性化用药辅助诊断：辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀等。

附图说明

图1为实施例1slco1b1基因rs2306283位点检测阳性对照品结果图；

图2为实施例1slco1b1基因rs2306283位点检测阴性对照品结果图；

图3为实施例1slco1b1基因rs2306283位点检测待测样本结果图；

图4为实施例1slco1b1基因rs4149056位点检测阳性对照品结果图；

图5为实施例1slco1b1基因rs4149056位点检测阴性对照品结果图；

图6为实施例1slco1b1基因rs4149056位点检测待测样本结果图；

图7为实施例1apoe基因rs429358位点检测阳性对照品结果图；

图8为实施例1apoe基因rs429358位点检测阴性对照品结果图；

图9为实施例1apoe基因rs429358位点检测待测样本结果图；

图10为实施例1apoe基因rs7412位点检测阳性对照品结果图；

图11为实施例1apoe基因rs7412位点检测阴性对照品结果图；

图12为实施例1apoe基因rs7412位点检测待测样本结果图；

图13为实施例1cetp基因taq1b位点检测阳性对照品结果图；

图14为实施例1cetp基因taq1b位点检测阴性对照品结果图；

图15为实施例1cetp基因taq1b位点检测待测样本结果图；

图16为实施例1abcb1基因rs1128503位点检测阳性对照品结果图；

图17为实施例1abcb1基因rs1128503位点检测阴性对照品结果图；

图18为实施例1abcb1基因rs1128503位点检测待测样本结果图；

图19为实施例1abcb1基因rs1045642位点检测阳性对照品结果图；

图20为实施例1abcb1基因rs1045642位点检测阴性对照品结果图；

图21为实施例1abcb1基因rs1045642位点检测待测样本结果图；

图22为实施例1mthfr基因rs1801131位点检测阳性对照品结果图；

图23为实施例1mthfr基因rs1801131位点检测阴性对照品结果图；

图24为实施例1mthfr基因rs1801131位点检测待测样本结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明所述检测方法及流程，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1、核酸dna提取

1.1在1.5ml离心管中依次加入200ul待测全血样本、20ul蛋白酶k、400ul裂解液，漩涡震荡混匀后于56℃水浴或金属浴10min。

1.2加入400ul异丙醇，漩涡震荡10秒混匀后加入20ul磁珠，漩涡震荡10秒，室温静置10min。

1.3将离心管放到磁性分离架上，静置10s，至磁珠全部被吸附到离心管壁上(若离心管盖上有液体则保持离心管在磁性分离架上整体颠倒3-5次，使管盖上的磁珠也被吸附到管壁上)，小心地吸掉全部液体，注意不要碰到磁珠。

1.4取下离心管，加入750ul洗涤液ⅰ，涡旋数秒洗涤磁珠，再将离心管放到磁性分离架上，静置10s，至磁珠全部被吸附(若离心管盖上有液体则保持离心管在磁性分离架上整体颠倒3-5次，使管盖上的磁珠也被吸附到管壁上)，小心吸掉全部液体，注意不要碰到磁珠(尽可能的吸尽离心管底部液体)。

1.5重复步骤1.4一次。

1.6取下离心管，加入750ul洗涤液ⅱ，涡旋数秒洗涤磁珠，将离心管放到磁性分离架上，静置10s，至磁珠全部被吸附(若离心管盖上有液体则保持离心管在磁性分离架上整体颠倒3-5次，使管盖上的磁珠也被吸附到管壁上)，小心吸掉全部液体，注意不要碰到磁珠(尽可能的吸尽离心管底部液体)。

1.7重复步骤1.6一次。

1.8保持离心管在磁性分离架上，室温放置10-15min，晾干离心管中残余乙醇。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、pcr等)实验。

1.9取下离心管，向离心管中加入50ul洗脱液，涡旋震荡混匀磁珠，并于56℃水浴或金属浴中放置10min洗脱核酸。

1.10将离心管放到磁性分离架上，静置10s，至磁珠全部被吸附，溶液变澄清。小心地将管中液体全部转移到另一支离心管中，注意不要吸到磁珠。所得核酸溶液4℃暂存备用，若长期保存请置于-20℃条件下。

2、试剂准备

2.1从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温，各组分充分溶解。

2.2根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例(反应液19ul/人份+1ul/人份酶混合液)取相应量的反应液和酶混合液，充分混匀成pcr-mix，瞬时离心后备用。

3、pcr加样

将混匀备用的pcr-mix按20ul/人份分装到pcr反应管中，依次加入5ul/人份的待测样本dna、阳性对照品、阴性对照品，盖上管盖，瞬时离心后转移至pcr扩增区。

4、pcr扩增

4.1将pcr反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待检样本名称、阳性对照、阴性对照。

4.2检测荧光通道选择

以abi7500实时荧光pcr仪为例：1)选择fam通道检测野生型，2)选择vic通道检测突变型，3)选择rox通道检测内标，4)参比荧光选择none。设置samplevolume为25ul。

4.3循环参数设定

以abi7500实时荧光pcr仪为例：

设置完毕，保存文件，运行反应程序。

5、结果分析

根据实验结果图(图1-24)分析待检样本他汀类药物代谢各基因的基因型，可得如下结果：

sequencelisting

<110>宁波美晶医疗技术有限公司

<120>一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒

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