本发明属于地下水微生物检测技术领域，具体涉及煤层气田地下水微生物检测方法。
背景技术：
煤层气(coalbedmethane，cbm)俗称瓦斯，是指以吸附态为主、游离态为辅，赋存于煤层中以甲烷为主要成分的一种自生自储的非常规天然气。煤层气产业的发展，不仅是新能源开发利用的必然趋势，能够改善能源供给结构，有效缓解化石能源供应不足的能源危机，同时也是煤矿安全开采和环境保护的客观要求，具有重大经济、社会和环境意义。近年来，世界上各产煤大国相继加入到煤层气开发利用当中，美国已实现煤层气的大规模商业化开发。中国煤层气的井下抽采和地面开采利用也非常活跃，煤层气产量逐年增大。煤层气开发在山西柳林、山西晋城、河北大城、陕西韩城、鄂南等地都先后取得重大突破，特别是煤层气勘探的热点地区鄂尔多斯盆地和沁水盆地。
煤层气不仅存在热成因，同样存在生物成因。生物成因气通常被认为是在微生物的作用下，通过降解煤来产生的。生物成因气的提出对煤层气开采起到了巨大的推动作用，通过激活煤层原位微生物可以促进煤层气的再生，从而增加煤层气储量，延长煤层气田的开采年限；同时微生物降解煤能够增加煤层的渗透性，提高煤层气的回采率；而且煤层微生物能够将回注的二氧化碳转化为甲烷被再次利用，使得能源循环利用成为可能。因而，研究、检测煤层气田地下水微生物具有很重要的意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种煤层气田地下水微生物检测方法，该检测方法具体包括以下步骤：
(1)采集煤层气田地下710～800m左右的地下水，盛装于充满氮气的厌氧瓶中，将厌氧瓶放置于-22～-25℃冰盒内保存；
(2)在厌氧环境下，将上述采集到的地下水过滤到0.22μm的滤膜上，提取地下水中的基因组dna；
(3)采用引物对地下水中的细菌进行pcr扩增，并使用16srdnav3区通用引物进行嵌套pcr扩增，然后使用dgge对扩增产物进行分离；
(4)采用引物对地下水中的古菌进行pcr扩增，并使用16srdnav3区通用引物进行嵌套pcr扩增，然后使用dgge对扩增产物进行分离；
(5)利用imagej对dgge胶进行数字化，获得条带的位置及其亮度的信息后，使用matlab对数据做pca分析，用于解析地下微生物种群信息。
其中，煤层气田地下水微生物检测方法步骤(3)中所述引物为27f和1492r。
其中，煤层气田地下水微生物检测方法步骤(4)中所述引物为8f和1958r。
其中，煤层气田地下水微生物检测方法步骤(3)和(4)中所述的pcr扩增，是指：进行嵌套pcr扩增和pcr扩增，分别得到细菌和古菌的16srdnav3片段和pcr扩增产物。
其中，煤层气田地下水微生物检测方法步骤(3)和(4)中所述的pcr扩增的扩增程序为：a、预变性96℃4.5min；b、96℃20s、65℃25s、70℃30s，骤循环40次；c、70℃延伸8min。
其中，煤层气田地下水微生物检测方法步骤(3)和(4)中所述的使用dgge对扩增产物进行分离是指：变性剂梯度为45～60％的聚丙烯酰胺胶(浓度为6.8～7.8％)被用于16srdnav3片段和pcr扩增产物进行分析。
本发明的有益效果是：本方法利用16srdna基因文库、引物pcr扩增和dgge相结合的技术获得煤层气田地下水样品微生物指纹图谱，提供了对地下水样品中存活尚不可培养的微生物的检测方法，能够准确、有效地分析地下水中细菌和古菌的群落结构，为研究煤层气的生物生成途径、机理奠定了基础。
具体实施方式
本发明提供了煤层气田地下水微生物检测方法，该检测方法具体包括以下步骤：
(1)采集煤层气田地下710～800m左右的地下水，盛装于充满氮气的厌氧瓶中，将厌氧瓶放置于-22～-25℃冰盒内保存；
(2)在厌氧环境下，将上述采集到的地下水过滤到0.22μm的滤膜上，提取地下水中的基因组dna；
(3)采用27f、1492r引物对地下水中的细菌进行pcr扩增，并使用16srdnav3区通用引物进行嵌套pcr扩增，得到细菌的16srdnav3片段和pcr扩增产物，然后使用dgge对扩增产物进行分离；
(4)采用8f、1958r引物对地下水中的古菌进行pcr扩增，并使用16srdnav3区通用引物进行嵌套pcr扩增，得到古菌的16srdnav3片段和pcr扩增产物，然后使用dgge对扩增产物进行分离；
(5)利用imagej对dgge胶进行数字化，获得条带的位置及其亮度的信息后，使用matlab对数据做pca分析，用于解析地下微生物种群信息。
其中，煤层气田地下水微生物检测方法步骤(3)和(4)中所述的pcr扩增的扩增程序为：a、预变性96℃4.5min；b、96℃20s、65℃25s、70℃30s，骤循环40次；c、70℃延伸8min。
其中，煤层气田地下水微生物检测方法步骤(3)和(4)中所述的使用dgge对扩增产物进行分离是指：变性剂梯度为45～60％的聚丙烯酰胺胶(浓度为6.8～7.8％)被用于16srdnav3片段和pcr扩增产物进行分析。
以下结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明，但并不因此限制本发明的保护范围。
实施例
煤层气田地下水微生物检测方法，该检测方法具体包括以下步骤：
(1)以湖北宜昌五峰煤矿为例，采集煤层气田地下750m左右的地下水，盛装于充满氮气的厌氧瓶中，将厌氧瓶放置于-25℃冰盒内保存；
(2)在厌氧环境下，将上述采集到的地下水过滤到0.22μm的滤膜上，提取地下水中的基因组dna；
(3)采用27f、1492r引物对地下水中的细菌进行pcr扩增，并使用16srdnav3区通用引物进行嵌套pcr扩增，pcr扩增程序为：a、预变性96℃4.5min；b、96℃20s、65℃25s、70℃30s，骤循环40次；c、70℃延伸8min；得到细菌的16srdnav3片段和pcr扩增产物，然后使用dgge对扩增产物进行分离：变性剂梯度为55％的聚丙烯酰胺胶(浓度为7.0％)被用于16srdnav3片段和pcr扩增产物进行分析；
(4)采用8f、1958r引物对地下水中的古菌进行pcr扩增，并使用16srdnav3区通用引物进行嵌套pcr扩增，pcr扩增程序为：a、预变性96℃4.5min；b、96℃20s、65℃25s、70℃30s，骤循环40次；c、70℃延伸8min；得到古菌的16srdnav3片段和pcr扩增产物，然后使用dgge对扩增产物进行分离：变性剂梯度为55％的聚丙烯酰胺胶(浓度为7.0％)被用于16srdnav3片段和pcr扩增产物进行分析；
(5)利用imagej对dgge胶进行数字化，获得条带的位置及其亮度的信息后，使用matlab对数据做pca分析，用于解析地下微生物种群信息。
结果显示，五峰煤层气田的古菌只有产甲烷古菌，以methanosaeta和methanosarcina为主；同时检测到丰富的细菌，以rheinheimera和hydrogenophaga为主。methanosaeta和methanosarcina是自然界中常见的两种产甲烷菌，能够利用多种简单底物产生甲烷，如乙酸盐、甲酸盐、甲醇、h2等。煤层气田地下厌氧的环境为产甲烷菌的生存提供了有利条件。同时，细菌中还检测到丰富的发酵类细菌，能够将煤层中的大分子化合物降解为简单小分子，为产甲烷菌的代谢提供底物。
以上所述为本发明的优选实施例，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应当视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和本专利的实用性。