一株异养硝化‑好氧反硝化节杆菌及其应用的制作方法

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株异养硝化-好氧反硝化节杆菌以及其在去除污水的氮中的应用。

背景技术：

氮素给环境造成的污染问题近年来日益突出，其危害性也日益被人们认识和重视。如氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮有可能转化为致癌、致突变和致畸的亚硝胺；又如氮素流入水体造成水体富营养化，引起水质恶化以至湖泊退化。生物脱氮具有处理效果好、处理过程稳定可靠、操作管理方便等的优点而得到广泛应用。传统的生物脱氮由自养硝化菌的硝化作用和厌氧反硝化菌的反硝化作用完成。

20世纪80年代，robertson和kuenen在除硫和反硝化处理系统中分离出thiosphaerapantotropha(现更名为脱氮副球菌paracoccusdenitrifications)，它能够同时利用硝酸盐和氧作为终端电子受体呼吸，他们称之为好氧反硝化。经过30多年国内外学者的大量研究，现已肯定了好氧反硝化菌的存在，且大多数好氧反硝化菌表现异氧硝化的特性。与自养型硝化菌比较,异养硝化菌的生长速率快,细胞产率高，需要的溶解氧浓度低,能耐受酸性环境且活性高，且能够代谢各种形态的氮化合物,同时提高cod的去除率。好氧反硝化和异养硝化的发现打破了传统的生物脱氮理论，使得同步硝化和反硝化成为可能，不仅可以降低运行成本,减少工艺上繁琐的操作,还可以扩大自养硝化菌所不能处理的水质范围，为废水的生物除氮提供了新思路。

国内外许多学者从不同生态环境中分离出许多异养硝化-好氧反硝化菌，研究了其除氮特性和应用潜力。其中具有低排放no、n2o能力的异养硝化-好氧反硝化菌被认为是是否具有实际应用潜力的首要问题。大多数好氧反硝化菌，反硝化的最后两步即no→n2o→n2对氧气是敏感的，因此较大量的no和n2o会在好氧硝酸盐/亚硝酸盐还原阶段被释放出来。当然，也有分离获得低排放no、n2o能力的异养硝化-好氧反硝化菌的报道。如maoshengzheng等从处理含氮高达200mg/l的垃圾渗滤液的实验室规模曝气生物滤池中分离到1株在好氧反硝化阶段排放低量的no和n2o的pseudomonasstutzeripcn-1，在合成废水中，可以硝酸盐、亚硝酸盐、n2o为良好的反硝化作用底物，三者的平均脱氮速率分别为11.66mg/l/h、12.80mg/l/h和9.67mg/l/h；以硝酸盐为底物进行好氧反硝化的no和n2o积累分别低于0.003％和0.33％；以亚硝酸盐为底物进行好氧反硝化的no和n2o积累分别低于0.006％和0.29％；进一步的研究发现反硝化基因nirs、cnorb和nosz的协同表达引起了低no和n2o排放量(maoshengzheng,etal,bioresourcetechnology,2014,162:80-88)。再如zhuangshi等从海底污泥中分离获得的异养硝化-好氧反硝化paracoccusversutuslym，可在有氧条件下将超过95％的硝态氮(约400mg/l)经过亚硝酸盐再转变成气态脱硝产物，最大去除率达33mg/l/h；在以铵为唯一氮源时，平均去除速率和去除率分别为11.4mg/l/h和75.4％，其他氮化合物如羟胺、亚硝酸盐、硝酸盐仅有少量积累，其最大积累量分别为0.045mg/l、0.048mg/l和4mg/l；好氧反硝化阶段中n2为主要产物，没有检测到任何作为温室气体和臭氧层消耗物的氮氧化物的存在(zhuangshi,etal,bioresourcetechnology,2013,148:144-148)。

至今为止，异养硝化-好氧反硝化主要还停留在实验室探索阶段，用于废水氮处理实践的报道不多。鉴于不同生态环境获得的异氧硝化-好氧反硝化菌，其生理生态特性各异，除氮特性和除氮能力也不同，寻找除氮能力强、低排放no、n2o的优良的异氧硝化-好氧反硝化菌种质资源仍然为异氧硝化-好氧反硝化最终应用于废水氮处理实践的重要环节。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供一株异养硝化-好氧反硝化菌，其特点为该菌株为采用常规分离方法从采自浙江温州东片污水处理厂的活性污泥中分离获得，经16srdna序列测定并将测序结果通过genbankblast进行比对分析，属于arthrobacter属，与尿酸氧化节杆菌(arthrobacteruratoxydans)的同源性为99.28％，编为arthrobactersp.wzuf01。

本发明提供的一株异养硝化-好氧反硝化节杆菌，该菌株为节杆菌(arthrobactersp.)wzuf01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为cgmccno.14012。

本发明还提供上述的节杆菌的应用，所述节杆菌wzuf01用于去除氮污水的氮：将节杆菌wzuf01接种于氮污水中以除去氮。

所述节杆菌wzuf01用于去除氮污水的氮的方法，包括如下步骤：

1)保藏菌株节杆菌wzuf01接种于活化培养基中，培养，离心，得菌体，菌体用无菌水洗涤后制成od600为0.9～1.0的菌悬液；

2)将步骤1)所得菌悬液接种于氮污水中培养以除氮；

其中，所述氮污水为含有nh4⁺、no3^-和no2^-的一种或其组合的污水。

优选地，步骤1)所述活化培养基组成为：蛋白胨10g、酵母粉5g、nacl5g、h2o1000ml、ph7.0～7.2；

步骤1)的培养时间为10～14h，温度为25～30℃，在转速150～160r/min下培养。

优选地，步骤2)为将步骤1)所得菌悬液接种于氮污水中，并加入碳源，碳源中所含的碳与氮污水中所含的氮的质量比为4:1～10:1。

优选地，所述碳源为柠檬酸钠、乳酸钠、醋酸钠、丁二酸钠的其中一种或其任意组合。

优选地，步骤2)中去除氮污水的氮的培养温度为15～40℃，优选为20～35℃，以naoh或hcl调ph为5～9。

优选地，步骤2)中，将步骤1)所得菌悬液接种于氮污水中在转速150～200r/min下培养以除氮。

本发明能够达到以下技术效果：

1、本发明提供的异养硝化-好氧反硝化的尿酸氧化节杆菌(arthrobacteruratoxydans)wzuf01为国内首次报道。

2、本发明提供的异养硝化-好氧反硝化节杆菌(arthrobactersp.)wzuf01去除氮污水的氮的适宜的碳氮质量比、温度和ph分别为4～10:1、20～35℃和5～9，有比较广的ph和温度适应范围以及比较低的碳氮质量比，且能耐受比较高的溶氧。。

3、本发明提供的异养硝化-好氧反硝化节杆菌(arthrobactersp.)wzuf01能耐受高浓度的铵，在适宜条件下，其对nh4⁺-n浓度达600mg/l的人工氮污水的nh4⁺-n去除率和去除速率分别为95.78％和24.10mg/l/h。以之处理nh4⁺-n浓度超过300mg/l的厌氧消化后养殖场废水，处理结果符合畜禽养殖业污染物排放标准(gb18596-2001)，且最终产物为氮气。

4、本发明提供的异养硝化-好氧反硝化节杆菌(arthrobactersp.)wzuf01硝化铵的终产物为氮气，不形成任何氮氧化物温室气体。

5、本发明提供的异养硝化-好氧反硝化节杆菌(arthrobactersp.)wzuf01具有良好的聚集能力，其聚集能力等级为3～4之间，表面疏水性为59.46％。

总之，本发明提供的异养硝化-好氧反硝化节杆菌(arthrobactersp.)wzuf01在实际废水的氮去除中具有很大的应用潜力。

附图说明

图1是arthrobactersp.wzuf01在硝酸盐培养基中生长和除氮进程。

图2是arthrobactersp.wzuf01在亚硝酸盐培养基中生长和除氮进程。

图3是arthrobactersp.wzuf01在铵培养基中生长和除氮进程。

图4是arthrobactersp.wzuf01的个体形态。

图5是采用mega4.1软件，邻位连接法显示菌株wzuf01与相关种的16srdna序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示bootstrap值大于50％数值。

图6是arthrobactersp.wzuf01除添加醋酸钠的厌氧消化后养殖场废水tn、nh4⁺-n和生长的进程。图中(1)：对照组；(2)：处理组。

图7是arthrobactersp.wzuf01除添加醋酸钠的厌氧消化后养殖场废水no3^--n、no2^--n和cod进程。图中(1)：对照组；(2)：处理组。

菌株保藏

本发明的arthrobactersp.wzuf01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为cgmccno.14012，保藏起始日期为2017年4月11日。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明提供一株异养硝化-好氧反硝化菌，其特点为该菌株为采用富集培养、初筛、复筛等过程从采自浙江温州东片污水处理厂曝气池的活性污泥中分离获得，经16srdna序列测定并将测序结果通过genbankblast进行比对分析，属于arthrobactersp.，与尿酸氧化节杆菌(arthrobacteruratoxydans)的同源性为99.28％，编为arthrobactersp.wzuf01

实施例一：异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01的分离

(1)初筛

取采自温州东片污水处理厂曝气池的活性污泥5ml接种于装有100ml富集培养基(丁二酸钠5g、nano31g、kh2po41g、k2hpo41g、(nh4)2so40.25g、mgso4·7h2o0.2g、酵母粉1g、h2o1000ml、ph7.0～7.2)的250ml锥形瓶中，在25℃、150rpm下振荡培养3天；取10ml富集培养液转接到新鲜的富集培养基中在相同条件下培养，如此重复5次；取富集培养液经适当稀释后涂布接种于溴百里酚蓝(bromothymolblue)平板(丁二酸钠5g、nano31g、kh2po41g、k2hpo41g、mgso4·7h2o1g、cacl2·2h2o0.2g、feso4·7h2o0.05g、天冬酰胺1g、溴百里酚蓝1ml(用1％乙醇配制)、琼脂18g、h2o1000ml、ph7.0～7.2)上，在25℃下培养2-3天，挑选具有蓝色光环的单菌落划线转接溴百里酚蓝(bromothymolblue)平板在相同条件下培养，直至经镜检为纯培养物后转接lb斜面培养后在4℃下保藏。初筛共获得20株纯培养物。

(2)复筛

取初筛获得的20株纯培养物的斜面保藏菌分别接种于装有100mllb培养基(蛋白胨10g、酵母粉5g、nacl5g、h2o1000ml、ph7.0-7.2)的250ml锥形瓶中，在25℃、150rpm下培养12h，在5000rpm下离心15min后收集菌体，用无菌蒸馏水洗涤3次后配制成od600＝0.9～1.0的菌悬液，每株纯培养物的菌悬液均各取10ml分别接种于装有200ml硝酸盐培养基、亚硝酸盐培养基和铵培养基的500ml锥形瓶中，在25℃、160r/min下振荡培养。培养基的基本组成为：丁二酸钠5g、kh2po41g、k2hpo41g、mgso4·7h2o1g、cacl2·2h2o0.2g、feso4·7h2o0.05g、h2o1000ml、ph7.0～7.2，硝酸盐培养基加入nano30.91g/l(以硝酸盐为基质的反硝化作用)，亚硝酸盐培养基加入nano20.73g/l(以亚硝酸盐为基质的反硝化作用)，铵培养基加入nh4cl0.57g/l(以氯化铵为基质的硝化作用)，硝酸盐培养基、亚硝酸盐培养基和铵培养基中氮均为150mg/l，c和n的质量比均为10:1。定时取样测定生物量以及硝酸盐、亚硝酸盐、铵、羟胺、蛋白和丁二酸的浓度变化。

依20株初筛获得的纯培养物分别在硝酸盐培养基、亚硝酸盐培养基中氧化no3^-、no2^-和中间产物类型和浓度变化确定其好氧反硝化性，在铵培养基中氧化nh4⁺、中间产物的类型和浓度变化以及琥珀酸的浓度变化确定其异养硝化性，结果筛选到5株no3^-、no2^-、nh4⁺去除率均大于80％的异养硝化-好氧反硝化菌。其中生物量测定od600，no3^--n、no2^--n和nh4⁺-n的测定分别采用酚二磺酸法分光光度法、n-(1-萘基)-乙二胺光度法和纳氏试剂比色法，蛋白测定采用folin-酚法，羟胺测定采用其与过量的8-羟基喹啉形成稳定的5,8-喹啉醌-5-(8-羟基-5-喹啉酰亚胺)的定量分光光度法(freards,anal.chem.,1955,27:1664-1665)，琥珀酸盐测定采用ksucc琥珀酸测定试剂盒(michalgh,anal.chem.,1976,279:137-138)，

将筛选到的5株异养硝化-好氧反硝化菌进行氮平衡试验，方法为将5株异养硝化-好氧反硝化菌分别接种于装有100mllb培养基(蛋白胨10g、酵母粉5g、nacl5g、h2o1000ml、ph7.0-7.2)的250ml锥形瓶中，在25℃、150r/min下培养12h，在5000rpm下离心15min后收集菌体，用无菌蒸馏水洗涤3次后配制成od600＝0.9～1.0的菌悬液，每株异养硝化-好氧反硝化菌的菌悬液均各取10ml分别接种于装有200ml硝酸盐培养基、亚硝酸盐培养基和铵培养基的500ml锥形瓶中，然后用纯氧气通10min后用橡胶隔片密封锥形瓶，在25℃、150r/min下密封培养18h。培养基的基本组成为：丁二酸钠5g、kh2po41g、k2hpo41g、mgso4·7h2o1g、cacl2·2h2o0.2g、feso4·7h2o0.05g、h2o1000ml、ph7.0～7.2，硝酸盐培养基加入nano30.91g/l(以硝酸盐为基质的反硝化作用)，亚硝酸盐培养基加入nano20.73g/l(以亚硝酸盐为基质的反硝化作用)，铵培养基加入nh4cl0.57g/l(以氯化铵为基质的硝化作用)，硝酸盐培养基、亚硝酸盐培养基和铵培养基中氮均为150mg/l，c和n的质量比均为10:1。分析培养前后培养基氮、菌体氮和顶部空间氮气和氧气的变化，以确定去除的no3^-、no2^-、nh4⁺是否转变为顶部空间的氮化合物，筛选最终产物为氮气的异养硝化-好氧反硝化菌。结果获得1株no3^-、no2^-、nh4⁺去除率均大于90％、终产物为氮气的异养硝化-好氧反硝化菌，编为wzuf01。其中密封培养的顶部气体中的氧气和氮气含量采用gc-14b气相色谱仪测定，菌体氮采用微量凯氏定氮法测定。

图1、图2和图3分别为复筛过程中菌株wzuf01在硝酸盐培养基、亚硝酸盐培养基和铵培养基中生长和氮浓度变化的实验结果，表1和表2为菌株wzuf01氮平衡试验结果。

表1菌株wzuf01密闭培养18h的氮平衡试验结果(mg/l)

表2菌株wzuf01密闭培养18h顶部空间氮气和氧气变化(％)

结合图1可看出，菌株wzuf01在硝酸盐培养基中培养18h后no3^--n去除率达97.57％，no3^--n去除速率为8.21mg/l/h，且主要发生在对数期，与生长是同步的；亚硝酸盐从6h开始积累，12h达到最大(21.89±2.15mg/l)，至24h降为零；整个过程没有检测到铵、羟胺和蛋白；结合表1的氮平衡分析表明，培养18h后培养基和菌体总氮丧失54.17％，结合表2的的密闭培养18h顶部空间氮气和氧气变化，表明硝酸盐被菌株wzuf01好氧反硝化为亚硝酸盐直至氮气。

结合图2可知，菌株wzuf01在亚硝酸盐培养基中的情况与在硝酸盐培养基中相似，亚硝酸盐去除主要发生在对数期，与生长是同步的，整个过程没有检测到铵、羟胺、蛋白和硝酸盐；培养18h后no2^--n降至4.35±0.55mg/l，no2^--n去除速率和去除率分别为8.04mg/l/h和97.08％，结合表1和表2的氮平衡分析可知，其中52.11％氮被转化为顶部空间的氮气。

结合图3看出，菌株wzuf01在铵培养基中氧化铵形成羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐，同时随着细菌的生长丁二酸浓度逐渐降低，表明菌株wzuf01的异养性；18h后nh4⁺-n降至2.97mg/l，nh4⁺-n的去除率和去除速率分别为98.03％和8.22mg/l。硝化产物羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐分别在3h、6h和6h开始出现，至24h均降为零，表明发生异养硝化-好氧反硝化；结合表1和表2的氮平衡分析，表明铵除了用于菌体增加外，其余46.46％被异养硝化-好氧反硝化为顶部空间的氮气。

为了更进一步地证明菌株wzuf01是进行好氧反硝化，通过改变摇床转速以改变溶氧的方法检测溶氧对菌株wzuf01反硝化的影响，当摇床转速分别为0、50、100和150和200r/min时，其相应的溶氧水平为2.35、3.55、4.94、6.18和7.35mg/l，溶氧水平用orion-3-star310d-01氧电极测量。菌株wzuf01在与前述条件相同的亚硝酸盐培养基中培养时，no2^--n去除率分别为10.62％、21.89％、64.2％、98.74％、和97.45％，表明菌株wzuf反硝化在好氧条件下进行且能容忍比较高的溶氧水平。

为了实现获得的异养硝化-好氧反硝化菌具有实际应用潜力，测定了菌株wzuf01的聚集能力和表面疏水性。经测定，菌株wzuf01的聚集能力等级为3-4之间，表面疏水性为59.46％。

聚集能力的测定方法：在硝酸盐培养基、亚硝酸盐培养基或铵培养基中25℃、150r/min下培养24h的培养液，经5000r/min15min离心后用蒸馏水洗涤菌体3次，用蒸馏水配成od600为1.5的菌悬液，然后转移到石英管中涡旋0.5min、轻轻滚动1min，然后静置目测聚集能力；聚集能力等级判断依据为：0，悬浮液没有聚集；1，浑浊液中有小的均匀聚集体；2，浑浊液中有容易可见的聚集体；3，清晰可见的聚集，出现清晰的上清液；4，几乎瞬间出现大的絮状聚集体，留下清晰的上清液(richardah,appl.environ.microbiol.,2002,68:3644-3650)。

表面疏水性的测定方法：在硝酸盐培养基、亚硝酸盐培养基或铵培养基中25℃、150r/min下培养24h的培养液，经5000r/min15min离心后用蒸馏水洗涤菌体3次，用ph7.4的磷酸缓冲液配成od6001.0的菌悬液，分别取1.2ml菌悬液和0.8ml菌悬液(加0.4ml十六烷)转移至用5ml酸洗涤过的玻璃试管中涡旋2min，两相分离15min后测定低水相的od600，表面疏水性依十六烷处理后的细菌悬液对原细菌悬液od600的百分比减少来计算(rosenberg,femsmicrobiol,1980,9:29-33)。

实施例二：异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01的鉴定

菌株wzuf01幼龄细胞为不规则杆状，常呈v型排列，在生长过程中杆状断裂为小球状，具明显杆、球周期变化，g⁺(见图4)；好氧，接触酶阳性。

以细菌基因组dna为模板扩增16srdna，扩增采用一对通用引物：上游引物(p1)：5’-agagtttgatcctggtcagaacgaacgct-3’，下游引物(p6)：5’-tacggctaccttgttacgacttcacccc-3’，pcr、pcr产物的纯化和测序由中国工业微生物菌种保藏管理中心完成，测序结果通过genbankblast进行比对分析。

wzuf01菌株的16srdna由1594bp碱基组成，如seqidno.1所示；通过genbankblast进行比对分析，与genbank中的节杆菌属(arthrobacter)的16srdna序列具有很高同源性，与尿酸氧化节杆菌(arthrobacteruratoxydans)的同源性为99.28％。采用mega4.1软件，邻位连接法显示异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01与相关种的16srdna序列系统发育树见图5。

节杆菌(arthrobactersp.)wzuf01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏中心登记入册编号为cgmccno.14012，保藏起始日期为2017年4月11日。

实施例三：异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01除氮特性

保藏的异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01(1.5ml冷冻管融化菌液)接种于装有100mllb培养基(蛋白胨10g、酵母粉5g、nacl5g、h2o1000ml)的250ml锥形瓶中，在25℃、150r/min下培养12h，在5000r/min下离心15min后收集菌体，用无菌蒸馏水洗涤3次后配制成od600＝0.9～1.0菌悬液。

取5ml接种于装有100ml培养基的250ml锥形瓶中，在一定温度和转速(基础温度和转速分别为25℃、150rpm)下振荡培养24h，然后在5000r/min下离心10min得上清液，对上清液进行相关测定分析。

基本培养基的组成为：丁二酸钠5g、kh2po41g、k2hpo41g、mgso4·7h2o1g、cacl2·2h2o0.2g、feso4·7h2o0.05g、h2o1000ml、ph7.0～7.2，分别加入nano30.91g/l(以硝酸盐为基质的好氧反硝化作用)和nh4cl0.57g/l(以氯化铵为基质的异养硝化作用-好氧反硝化作用)，使培养基中氮均为150mg/l，c和n的质量比为10:1。

nh4⁺-n(或no3^--n)的去除率/％＝(培养前上清液nh4⁺-n(或no3^--n)浓度(mg/l)-培养后上清液nh4⁺-n(或no3^--n)浓度(mg/l)/培养前上清液nh4⁺-n(或no3^--n)浓度(mg/l)。

主要研究碳源、c/n、温度、ph、转速对节杆菌wzuf01除氮的影响。

1、碳源的选择

分别以表3中的不同碳源代替基本培养基中的丁二酸钠，使c和n的质量比均为10:1，其实验结果如表3所示。由表3看出，最适宜的碳源为醋酸钠、丁二酸钠和柠檬酸钠，其次为乳酸钠。

表3碳源选择实验结果

2、碳氮质量比(c/n)的选择

以醋酸钠代替基本培养基中的丁二酸钠，碳氮的质量比及实验结果如表4所示。由表4可知，适宜的碳氮质量比为4～10:1，表明异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01不需要较高的碳氮质量比。

表4碳氮质量比选择实验结果

3、培养温度的选择

以醋酸钠代替基本培养基的丁二酸钠，浓度为2.56g/l，使c和n的质量比为5:1，温度的选择及实验结果如表5。由表5看出，最适宜的温度为20-35℃，但15℃下仍有超过60％的去除率，表明异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01有很广的温度适应范围。

表5培养温度选择的实验结果

4、ph的选择

以醋酸钠代替基本培养基的丁二酸钠，浓度为2.56g/l，使c和n的质量比为5:1，温度25℃，培养基的ph选择及实验结果如表6。由表6可知，适宜的ph范围为5-9，表明异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01有很宽的ph适应范围。

表6ph选择的实验结果

5、培养转速的选择

以醋酸钠代替基本培养基的丁二酸钠，浓度为2.56g/l，使c和n的质量比为5:1，温度25℃，培养基的ph为7，摇床转速选择及实验结果如表7。由表7看出，适宜的转速为150-200r/min，表明异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01能耐受比较高的溶氧水平。

表7培养转速选择的实验结果

实施例四：最适条件下异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01除氨氮试验

保藏的异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01(1.5ml冷冻管融化菌液)接种于装有100mllb培养基(蛋白胨10g、酵母粉5g、nacl5g、h2o1000ml)的250ml锥形瓶中，在25℃、150r/min下培养12h，在5000r/min下离心15min后收集菌体，用无菌蒸馏水洗涤3次后配制成od600＝0.9～1.0菌悬液。

取10ml菌悬液接种于装有200ml培养基的500ml锥形瓶中，在25℃、150r/min下振荡培养，定时取样测定生物量，然后在5000r/min下离心10min后对上清液进行相关测定分析，结果如表8所示。

培养基的组成：醋酸钠、nh4cl、kh2po41g、k2hpo41g、mgso4·7h2o1g、cacl2·2h2o0.2g、feso4·7h2o0.05g、h2o1000ml、ph7.0～7.2，培养基中nh4⁺-n浓度分别为150、300、600、800、1000mg/l，c和n的质量比为5:1。

由表8计算得知，当nh4⁺-n浓度分别为150、300、600、800和1000mg/l时，异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01对nh4⁺-n的去除率分别为96.20％、97.25％、95.78％、90.58％和73.09％，去除速率分别为8.07、12.10、24.10、17.29和13.66mg/l/h，即随nh4⁺-n浓度增加，异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01对其去除速率随之提高，但超过600mg/l后，其去除速率又开始下降，表明过高浓度的nh4⁺-n对其表现出抑制效应；这与异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01在不同nh4⁺-n浓度下的生物量变化是一致的，且nh4⁺-n的去除与生长是同步的。

由表8也可知，当nh4⁺-n浓度小于600mg/l时，no2^--n几乎没积累(浓度＜0.1mg/l)，nh4⁺-n浓度超过600mg/l后no2^--n开始逐渐积累；而no3^--n浓度无论nh4⁺-n的浓度多大，要么没积累要么浓度≦1mg/l。

实施例五：异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01除厌氧消化后养殖场废水氮试验

保藏的异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01(1.5ml冷冻管融化菌液)接种于装有100mllb培养基(蛋白胨10g、酵母粉5g、nacl5g、h2o1000ml)的250ml锥形瓶中，在25℃、150r/min下培养12h，在5000r/min下离心15min后收集菌体，用无菌蒸馏水洗涤3次后配制成od600＝0.9-1.0菌悬液。菌悬液按5％体积比分别转接于装有200ml厌氧消化后养殖场废水以及添加醋酸钠的200ml厌氧消化后养殖场废水的500ml锥形瓶中，在25℃、150r/min下培养，并分别以不接入菌悬液的原废水在相同条件下培养为对照，定时取样测定生物量，并在8000r/min下离心10min得上清液进行相关检测计算，直至趋于稳定为止。同时进行氮平衡试验，方法为菌悬液按5％体积比分别转接于装有200ml厌氧消化后养殖场废水以及添加醋酸钠的200ml厌氧消化后养殖场废水的500ml锥形瓶中，然后用纯氧气通10min后用橡胶隔片密封锥形瓶，在25℃、150r/min下密封培养，分析培养前后培养基氮、菌体氮和顶部空间氮气和氧气的变化。

原废水组成：tn(总氮)402.89±4.69mg/l、nh4⁺-n329.34±5.58mg/l、no3^--n35.19±1.54mg/l、no2^--n34.58±1.15mg/l、cod378.42±5.87mg/l。

tn测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(gb-11894-89)，cod测定采用重铬酸钾法。

表9为异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01除厌氧消化后养殖场废水氮的效果，表10为异养硝化-好氧反硝化节杆菌wzuf01除添加6.89g/l醋酸钠使醋酸钠所含碳与总氮的质量比为5:1的厌氧消化后养殖场废水氮的效果，图6和图7为节杆菌wzuf01除添加醋酸钠的厌氧消化后养殖场废水氮的进程。表9节杆菌wzuf01除厌氧消化后养殖场废水氮的结果

表10节杆菌wzuf01除添加醋酸钠的厌氧消化后养殖场废水氮的结果

对比表9和表10可以看出，节杆菌wzuf01对添加醋酸钠的厌氧消化后养殖场废水的tn、no3^--n、no2^--n、nh4⁺-n的去除效果显著高于未添加醋酸钠的原厌氧消化后养殖场废水。由表11的氮平衡实验结果看出，没有添加醋酸钠的原厌氧消化后养殖场废水培养前后氮损失12.97％，而添加醋酸钠的厌氧消化-后养殖场废水培养前后氮损失63.09％。表明未添加醋酸钠的原厌氧消化后养殖场废水主要用于节杆菌wzuf01的生长，而添加醋酸钠后大大促进了异养硝化-好氧反硝化。结合表12的密闭培养后顶部空间氮气和氧气变化，表明厌氧消化后养殖场废水的氮被节杆菌wzuf01异养硝化-好氧反硝化为氮气。

表11节杆菌wzuf01除厌氧消化后养殖场废水氮的氮平衡实验结果

表12节杆菌wzuf01在厌氧消化后养殖场废水中密闭培养后顶部空间氮气和氧气变化(％)

由图6看出，在添加醋酸钠的厌氧消化后养殖场废水中接入节杆菌wzuf01培养72h后，tn和nh4⁺-n去除趋于稳定，且与菌体生长是同步的，而对照组tn和nh4⁺-n几乎没下降，nh4⁺-n的去除率和去除速率分别为90.24％和4.10mg/l/h，nh4⁺-n的去除率与最适条件下的浓度为300mg/l的人工培养基中的nh4⁺-n去除率接近，但去除速率降低。

由图7看出，在添加醋酸钠的厌氧消化后养殖场废水中接入节杆菌wzuf01培养72h后，no3^--n、no2^--n和cod去除趋于稳定，对照组同样几乎没下降，与nh4⁺-n和tn去除以及菌体生长趋于稳定的时间相同。结合表10看出，节杆菌对wzuf01对添加醋酸钠的厌氧厌氧消化后养殖场废水的no3^--n、no2^--n和cod的去除率分别为96.3％、98.12％和76.84％。

畜禽养殖业污染物排放标准(gb18596-2001)规定集约化畜禽养殖业污染最高容许日均排放浓度：cod400mg/l、氨氮80mg/l,对照表10节杆菌wzuf01处理添加醋酸钠的厌氧消化后养殖场废水后的tn、no3^--n、no2^--n、nh4⁺-n和cod浓度，已符合畜禽养殖业污染物排放标准。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

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