本发明属于微生物肥料领域，具体地说，涉及一种兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂及其制备方法。
背景技术：
作物青枯病的防治一直是一个世界性难题。早期，针对作物青枯病的防治，国内外专家在抗病品种选育、化学防治、农业措施等方面进行了大量的研究，但仍存在一些问题，如品种抗病性能低，抗性易丧失；化学防治药剂后期防效差，病菌易产生抗药性，且环境负面效应明显；农业措施易受受地域条件限制，难于大面积推广，等等。目前，随着可持续、生态农业观念的不断深入，生物防治越来越受到人们的重视。尤其是微生物肥料快速发展的今天，越来越多的专家学者将微生物肥料与作物病虫害防治联合起来研究，具有抗病虫害功能的微生物肥料也越来越多。
微生物肥料是以微生物的生命活动导致作物得到特定肥料效应的一种制品，其含有大量有益微生物，可以改善作物营养条件、固定氮素和活化土壤中一些无效态的营养元素，创造良好的土壤微生态环境来促进作物的生长。微生物肥料中含有的有益微生物能产生大量糖类物质，且该糖类物质占土壤有机质的0.1％，当微生物肥料施入到土壤中后，与植物粘液，矿物胚体和有机胶体结合在一起，可改善土壤团粒结构，增强土壤物理性能和参与腐殖质形成。
可见，研究开发抗病、促生等多功能微生物菌剂，是当前微生物肥料重点研究的内容之一，可以达到防治作物病害和提高土壤肥力的双重目的，符合当今生态农业的发展方向。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂及其制备方法，该菌剂由多种有益微生物复合构建而成，不仅可改善土壤微生物群体结构，增强作物养分吸收能力，而且还能有效防治作物青枯病害的发生，是生物防治作物青枯病害发生的有效途径之一。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂，按照体积比由以下组分构成：枯草芽孢杆菌菌悬液1份、地衣芽孢杆菌菌悬液1份、凝结芽孢杆菌菌悬液1.5份-3份、侧孢芽孢杆菌菌悬液1.5份-3份、多粘芽孢杆菌菌悬液1份。
进一步地，所述枯草芽孢杆菌菌悬液、地衣芽孢杆菌菌悬液、凝结芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液的浓度大于1×108cfu/ml。
进一步地，所述枯草芽孢杆菌菌悬液、地衣芽孢杆菌菌悬液、凝结芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液通过以下方法制备得到：在无菌条件下，将保存在-4℃环境下的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌种分别接种至tsa平板培养基上，28-30℃下培养48h，其中凝结芽孢杆菌培养温度为45℃；之后分别挑取各菌单菌落接种至tsa液体培养基中，28-30℃，200-220r/min下振荡培养24h，即得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液。镜检，确保各菌菌悬液浓度大于1×108cfu/ml。
进一步地，所述tsa培养基为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，ph值7.3；灭菌条件为：压强0.1-0.15mpa，温度121℃，时间30min。
本发明公开了一种兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备枯草芽孢杆菌菌悬液、地衣芽孢杆菌菌悬液、凝结芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液：在无菌条件下，将保存在-4℃环境下的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌种分别接种至tsa平板培养基上培养；之后分别挑取各菌单菌落接种至tsa液体培养基中振荡培养，即得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液；
步骤2、称量：按照体积比称量以下组分：枯草芽孢杆菌菌悬液1份、地衣芽孢杆菌菌悬液1份、凝结芽孢杆菌菌悬液1.5份-3份、侧孢芽孢杆菌菌悬液1.5份-3份、多粘芽孢杆菌菌悬液1份；
步骤3、将称量好的枯草芽孢杆菌菌悬液、地衣芽孢杆菌菌悬液、凝结芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液混合均匀，制备得到兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂。
进一步地，步骤1中的所述枯草芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液的浓度均大于1×108cfu/ml。
进一步地，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌菌种在tsa平板培养基上的培养条件为：温度28-30℃，时间48h；凝结芽孢杆菌菌种在tsa平板培养基上的培养条件为：温度45℃，时间48h。
进一步地，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌单菌落在tsa液体培养基中的培养条件为：温度28-30℃，转速200-220r/min，时间24h。
进一步地，tsa培养基为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，ph值7.3。
进一步地，步骤1中的tsa培养基灭菌条件为：压强0.1-0.15mpa，温度121℃，时间30min。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明的复合菌剂含有大量有益菌类，具有无毒害、无污染、活性高等优点，能改善土壤微生物群体结构，增强作物对氮磷钾等养分的吸收及利用，对土壤改良和肥力提升有一定效果。
2)本发明的复合菌剂已经番茄盆栽试验验证，其番茄青枯病的防治效果最高可达67.84％，预防及防治效果较好。
3)本发明复合菌剂由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌构建而成，芽孢类杆菌易于发酵生产，不仅可降低菌剂生产成本，也可丰富对作物青枯病有防治作用的功能菌品种。
4)本发明复合菌剂由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌构建而成，不仅可有效防治作物青枯病害的发生，而且还对土壤理化性状的改善及质地改良起到一定作用。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明公开了一种兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂，按照体积比由以下组分构成：枯草芽孢杆菌菌悬液1份、地衣芽孢杆菌菌悬液1份、凝结芽孢杆菌菌悬液1.5份-3份、侧孢芽孢杆菌菌悬液1.5份-3份、多粘芽孢杆菌菌悬液1份。
本发明还提供一种兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备各菌菌悬液：在无菌条件下，将保存在-4℃环境下的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌种分别接种至tsa平板培养基上，28-30℃下培养48h，其中凝结芽孢杆菌培养温度为45℃。之后分别挑取各菌单菌落接种至tsa液体培养基中，28-30℃，200-220r/min下振荡培养24h，即得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液。镜检，确保各菌菌悬液浓度大于1×108cfu/ml。
其中tsa培养基为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，ph值7.3。在0.1-0.15mpa，121℃条件下灭菌30分min，备用。
步骤2、配制：
将步骤1中制备得到的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液，按体积比1:1:1.5-3:1.5-3:1混合均匀，制备得到兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂。
实施例1
一种兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备各菌菌悬液：在无菌条件下，将保存在-4℃环境下的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌种分别接种至tsa平板培养基上，29℃下培养48h，其中，凝结芽孢杆菌培养温度为45℃。之后分别挑取各菌单菌落接种至tsa液体培养基中，29℃，210r/min下振荡培养24h，即得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液。镜检，确保各菌菌悬液浓度大于1×108cfu/ml。
其中tsa培养基为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，ph值7.3。在0.12mpa，121℃条件下灭菌30min，备用。
步骤2、配制：
将步骤1中制备得到的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液，按体积比1:1:2:2:1混合均匀，制备得到兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂。
实施例2
一种兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备各菌菌悬液：在无菌条件下，将保存在-4℃环境下的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌种分别接种至tsa平板培养基上，28℃下培养48h，其中，凝结芽孢杆菌培养温度为45℃。之后分别挑取各菌单菌落接种至tsa液体培养基中，28℃，220r/min下振荡培养24h，即得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液。镜检，确保各菌菌悬液浓度大于1×108cfu/ml。
其中tsa培养基为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，ph值7.3。在0.1mpa，121℃条件下灭菌30min，备用。
步骤2、配制：
将步骤1中制备得到的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液，按体积比1:1:1.5:1.5:1混合均匀，制备得到兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂。
实施例3
一种兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备各菌菌悬液：在无菌条件下，将保存在-4℃环境下的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌种分别接种至tsa平板培养基上，30℃下培养48h，其中，凝结芽孢杆菌培养温度为45℃。之后分别挑取各菌单菌落接种至tsa液体培养基中，30℃，220r/min下振荡培养24h，即得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液。镜检，确保各菌菌悬液浓度大于1×108cfu/ml。
其中tsa培养基为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，ph值7.3。在0.15mpa，121℃条件下灭菌30min，备用。
步骤2、配制：
将步骤1中制备得到的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液，按体积比1:1:3:3:1混合均匀，制备得到兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂。
下面结合具体的实验来说明本发明复合菌剂对番茄青枯病防治效果：
(1)青枯病菌接菌方法
首先将供试土壤曝晒2天，消毒后装盆，每盆钵装土6kg，后接青枯病菌菌液(菌悬液浓度大于1×108cfu/ml)200ml/盆，搅拌均匀，保湿培养5天，备用。
(2)功能菌接菌方法
选取长势一致的4-6叶番茄幼苗移栽到预处理过青枯菌的盆钵中，移栽时用处理1的功能菌液蘸根10min，之后分别在移栽后第7、20天进行功能菌液灌根处理，各功能菌(菌悬液浓度大于1×108cfu/ml)接种量60ml/每盆。
(3)试验设计
ck1：只接青枯病菌
ck2：不接任何菌
处理1：实施例1制备的复合菌剂+青枯病菌
处理2：实施例2制备的复合菌剂+青枯病菌
处理3：实施例3制备的复合菌剂+青枯病菌
试验共设3个处理，每处理3个重复，每个重复10盆，每盆1株番茄苗。试验期间正常水分管理。另外，为满足番茄生长需求，在装土时每盆追施尿素2.06g，过磷酸钙0.94g，硫酸钾2.72g。移栽40天后，记录番茄发病情况，计算其病情指数及青枯病抑制率，测定土壤中ph、有机质、碱解氮、矿化氮、速效磷、速效钾含量，统计结果见表1-4。
番茄青枯病病情调查分级标准采用5级标准法，即0级：无病；1级：植株有1-2片叶凋萎；2级：植株有3-5片叶凋萎；3级：植株大部分叶片凋萎；4级：植株凋萎枯死或即将枯死。
病情指数＝[σ(病级株数×病害级数)/(该处理盆栽苗总和×发病最重级的代表数值)]×100。
抑制率(％)＝(对照发病指数-处理病情指数)×100/对照发病指数。
表1原始土壤基本理化性状
表2番茄盆栽40天后土壤基本理化性状变化
表3盆栽40天后番茄青枯病发病情况统计
表4盆栽40d对青枯病菌的抑制效果
由表1、表2可知，本发明实施例1-3处理过的土壤ph、有机质、碱解氮、矿化氮、速效磷、速效钾含量基本上均高于原始土壤、不接菌处理(ck1)和只接青枯菌处理(ck2)，只有有机质含量稍微低于只接青枯菌处理(ck2)，可能是由于青枯病菌的接入导致植物根系病变，根系部分断裂进入土壤，增加了该处理的土壤有机质含量。说明接菌本发明复合菌剂可在一定程度上改良土壤基本理化性状，提高土壤肥力。
由表3、表4可知，在同时接种番茄青枯病菌的基础上，本发明复合菌剂处理番茄后，青枯病病情指数较低，抑制率最高可达67.84％，说明本发明复合菌剂在一定程度上对番茄青枯病有一定的防治效果。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。