一种脂肽-高岭土复合生防制剂及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于微生物源农药制备领域，提供一种脂肽-高岭土复合生防制剂及其制备方法和应用。该复合生防制剂由脂肽、剥片高岭土和水组成，其中，脂肽和剥片高岭土的质量百分比分别为0.1％、2％。该脂肽-高岭土复合生防制剂的制备过程包括：(1)脂肽粉末制备(2)剥片高岭土制备(3)脂肽-高岭土复合生防制剂获得。本发明提供的脂肽-高岭土复合生防制剂中，剥片高岭土与脂肽的结合提高了脂肽的稳定性，延长了脂肽的作用时间，有效地提高防治番茄青枯病的防治效果，促进了番茄植株生长。解决了现有技术中脂肽生产成本高、产量低、稳定性差、发挥效果时间短，其有效开发利用受限制等问题，提高了由生物复合材料制成的番茄青枯病防治剂效果。
CGMCC No.4160
2010.09.14
【专利说明】一种脂肽-高岭土复合生防制剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物源农药制备领域，涉及一种脂肽-高岭土复合生防制剂及其制 备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 番爺青枯病是由爺科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum)引起的一种全世界广 泛分布的细菌性土传病害。发病初期，植株下部叶片的叶柄出现下垂，而后叶片渐次枯萎， 同时茎部出现不定根，植株快速萎蔫并逐渐枯死。轻则减产20%?40%，严重时达60%以 上甚至绝收。茄科雷尔氏菌存在较大的遗传变异，目前尚无有效的化学防治方法。常用的 防治措施如抗性育种、田间清除、作物轮作、综合管理等由于青枯病病害系统的复杂性而成 效甚微。
[0003] 芽孢杆菌（Bacillus spp.)具有复杂的生理学性质多样性和底物多样性，能够产 生高耐性芽孢和各种抑菌物质如多肽类和脂肽类及细菌素类抗生素。脂肽类表面活性剂作 为一种生物表面活性剂（biosurfactant)，能够改变细胞膜通透性，具有广谱的抗真菌和抑 制部分细菌的活性，研究表明，某些脂肽类物质对立枯丝核菌和青枯菌表现出很好的拮抗 活性，可以利用其防治青枯病，但是其化学不稳定性，物理和酶不稳定性，限制了脂肽类表 面活性剂相关产品的开发和应用。同时，较高的生产成本和较低的产量也限制了脂肽的工 业化生产。
[0004] 近年来，生物材料与有机膜、有机颗粒、无机粘土材料之间相互作用制备复合材 料，在学术界已经引起了相当大的兴趣，特别是无机纳米亚微米级材料结构丰富新颖、热稳 定性优良、表面活性可调节、价格低廉，生物材料和无机纳米材料的有效复合，能够很好维 持生物大分子的结构，并且有可能会赋予生物物质新的优异特性。高岭土属于1 : 1型的 硅铝酸盐粘土矿物，其晶架结构都有一层硅氧片和一层水铝片重叠而成，高岭土可用作化 月巴、农药、杀虫剂的载体，因为其颗粒表面具有微细孔隙，有一定的吸附性。但是，普通高岭 土的比表面积不够大，虽具有粘土矿物特有吸附性、分散性、流变性、多孔性和表面酸性，但 没有纳米亚微米级材料的表面效应，活性中心不够多，相应的吸附性、分散性、流变性会差 很多，因此，与生物材料不能有效复合，形成的复合材料效果会大打折扣。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是解决现有技术中脂肽生产成本高、产量低、稳定性差、发挥效果时 间短，其有效开发利用受到限制的问题，同时，也是为了解决生物复合材料复合程度不高， 由生物复合材料制成的番茄青枯病防治剂效果不好的问题，提供一种通过农业废弃物固体 变温发酵生产脂肽，以剥片高岭土为无机载体，开发研制出一种防治番茄青枯病的新型生 防制剂的制备方法及该种生防制剂。
[0006] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007] 1.本发明提供一种脂肽-高岭土复合生防制剂，该生防制剂由脂肽、剥片高岭土 和水组成。
[0008] 2.上述1提供的脂肽-高岭土复合生防制剂，该生防制剂中脂肽的质量百分比为 〇. 1 %、剥片高岭土的质量百分比为2%，其余为水。
[0009] 3.上述2提供的脂肽-高岭土复合生防制剂，其中，脂肽由农业废弃物固体变温发 酵所得，对番茄青枯病病原菌具有抑制作用。
[0010] 4.上述3提供的脂肽-高岭土复合生防制剂，其中，所述农业废弃物为黄豆粉和秸 杆。
[0011] 5.本发明还提供上述1-4任一项提供脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法，该 制备方法包括如下步骤：（1)脂肽粉末制备：发酵种子液制备；发酵基质准备；接种发酵种 子液；发酵；从发酵后基质中获得脂肽粉末；（2)剥片高岭土制备：高岭土与水、尿素混合， 加热同时快速搅拌，得处理好的高岭土 -尿素插层复合物；将高岭土-尿素插层复合物加入 稀硫酸溶液中，混合均匀后进行超声处理，离心分离后用无水乙醇清洗，干燥，研磨得剥片 商岭土；（3)脂肤-商岭土复合生防制剂获得：将上述获得的脂肤粉末和剥片商岭土进行混 合均匀，摇床振荡，得到脂肽-高岭土复合生防制剂。
[0012] 6.上述5提供的脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法，具体包括如下步骤 (1)脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株 XZ-173(保藏号CGMCC NO. 4160)划线于LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种 于LB液体培养基，扩大培养，获得发酵种子液；称取4. 5?6kg黄豆粉，3?4. 5kg結杆， 0. 15?0. 2kg淀粉和0. 15?0. 2kg酵母提取物，放入发酵罐中，加入1?2L无机盐溶液， 调节
[0013] 基质pH为7?8,保证含水率为40%?60%，充分混匀基质，灭菌待用；待发酵罐 内温度冷却并保持稳定后，在无菌条件下按5%?25% (v/w)的量接入种子液，搅拌均匀， 调节罐内相对湿度大于80%，通气量0. 1?0. 5vvm和罐压0. 01?0. 05Mpa，前24h温度设 为25?40°C进行发酵，24h后将温度设为28?40°C发酵16?24h ;称取发酵后的基质与 水混合，室温振荡1?2h，离心去除不溶物质，调节上清液pH为1?3,出现白色絮状沉淀， 低温静置过夜，然后离心收集沉淀，沉淀用有机溶剂进行抽提，旋转蒸发去除有机溶剂，残 留物用水溶解并调PH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；
[0014] (2)剥片高岭土制备：将过200目筛的高岭土分别加入其重量4%?15%的水 和其重量4%?15%的尿素，然后在90?KKTC下加热同时快速搅拌1?24h，获得高岭 土 -尿素插层复合物；取处理好的高岭土 -尿素插层复合物按〇. 25%?4% (w/v)的量加 到稀硫酸溶液中，混合均匀后用超声波清洗器进行超声处理，处理过程温度为60?80°C， 持续时间为10?30min，离心后沉淀用无水乙醇清洗数遍，干燥后研磨即得剥片高岭土；
[0015] (3)脂肽-高岭土复合生防制剂获得：向水中依次加入脂肽和剥片高岭土，搅拌摇 匀后在摇床上以20?40°C，150?250rpm振荡10?30h，即得到脂肽-高岭土复合生防制 剂。
[0016] 解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株 XZ-173,在 2010 年 9 月 14 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC 4160,地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0017] 7.进一步地，上述6提供的脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法，该制备 方法具体包括如下步骤⑴脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株XZ-173划线于LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种于 LB液体培养基，在30°C，170rpm的条件下培养24h，获得发酵种子液；称取5. 67kg黄豆粉， 3. 67kg秸杆，0. 17kg淀粉和0. 18kg酵母提取物，放入50L发酵罐中，加入IL无机盐溶液， 调节基质pH为7. 5,保证含水率为55%，将转速设为50?70rpm搅拌60?80min充分混 匀基质，灭菌；其中，无机盐溶液包括（g/L) =KH2PO4 1. 0, MgSO4 · 7H20 0. 5, KCl 0. 5, L-苯 丙氨酸2父10-3，]?1^045\1(^，(^04 0.16\1(^^6504 0.15\1(^;待发酵罐内温度冷却并 保持稳定后，在无菌条件下按10% (v/V)的量接入种子液，搅拌均匀，调节罐内相对湿度大 于80%，通气量0. 1?0. 5vvm和罐压0. 01?0. 05Mpa，前24h温度设为30°C进行发酵，24h 后将温度设为37°C发酵20h ;称取一定量发酵后的基质与水按I : 10 (w/v)的比例混合，室 温振荡Ih，离心去除不溶物质，在上清液中添加 HCl至pH为2. 0,出现白色絮状沉淀，4°C静 置过夜，再以IOOOOrpm离心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烷进行抽提，旋转蒸发去除有机 溶剂，残留物用水溶解并调PH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；
[0018] (2)剥片高岭土制备：将过200目筛的高岭土分别加入其重量10%的水和其重量 10%的尿素，然后在95°c下加热同时快速搅拌lh，获得高岭土-尿素插层复合物；取处理好 的高岭土-尿素插层复合物Ig加入100ml lmol/L的硫酸溶液中，混合均匀后用超声波清 洗器进行超声处理，处理过程温度为80°C，持续时间为15min，离心后沉淀用无水乙醇清洗 2?3遍，60°C干燥后，研磨即得剥片高岭土；
[0019] (3)脂肽-高岭土复合生防制剂获得：向水中依次加入脂肽和剥片高岭土，搅拌摇 匀后在摇床上以30°C，170rpm振荡24h，即得到脂肽-高岭土复合生防制剂。
[0020] 8.本发明还提供上述1-4任一项提供的脂肽-高岭土复合生防制剂在防治番茄青 枯病上的应用。
[0021] 9.本发明还提供一种防治番茄青枯病的防治剂，包括上述1-4任一项提供的脂 肽-高岭土复合生防制剂。
[0022] 10.本发明还提供由上述5-7任一项所述方法制备的脂肽-高岭土复合生防制剂 在防治番茄青枯病上的应用。
[0023] 本发明的有益效果：
[0024] 1.本发明制备脂肽-高岭土复合生防制剂的原料之一，即剥片高岭土是将高岭土 经过插层剥离后形成的，其比表面积增大，既具有粘土矿物特有吸附性、分散性、流变性、 多孔性和表面酸性，又具有纳米亚微米级材料的表面效应，出现许多活性中心。经过红外光 谱检测，剥片高岭土与脂肽有效结合在一起，很好地维持了脂肽结构，并且更好地发挥了脂 肽的生物特性。经过试验，本发明提供的脂肽-高岭土复合生防制剂对番茄青枯病的防治 效果均明显高于单独使用脂肽溶液或者高岭土-脂肽复合液，说明脂肽-高岭土复合生防 制剂中剥片高岭土与脂肽的结合能够更好地提高脂肽的稳定性，延长脂肽的作用时间，该 脂肽-高岭土复合生防制剂能有效地提高番茄青枯病的防治效果。
[0025] 2.本发明制备的脂肽-高岭土复合生防制剂经过试验，可以促进番茄植株地上部 和地下部的生长，与未经处理的对照组CK相比具有显著差异，说明该脂肽-高岭土复合生 防制剂在防治番茄青枯病的同时能够促进番茄植株生长。
[0026] 3.本发明制备脂肽-高岭土复合生防制剂原料之一脂肽类物质是利用固体发酵 农业废弃物来生产的，本发明采用黄豆粉和秸杆混合物作为主要固体发酵基质，有效提高 了脂肽类物质的产量，节约了生产成本，降低了环境压力并提高了资源的利用率。
[0027] 4.本发明生产的脂肽-高岭土复合生防制剂具有环境污染小，低毒、安全，生产成 本低，防治效果好的优点，适合番茄种植区域大面积使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1高岭土扫描电镜（SEM)图
[0029] 图2剥片高岭土扫描电镜（SEM)图
[0030] 图3样品红外光谱（FT-IR)图，图中a代表脂肽-高岭土复合生防制剂离心干燥 后的粉末，b代表剥片1?岭土粉末
[0031] 图4脂肽-高岭土复合生防制剂对番茄青枯病病原菌的抑菌效果图
[0032] 图5温室防治试验各处理病情指数（DI)变化图
[0033] 图6温室防治试验各处理植株株高，不同小写字母表示显著差异（p < 0. 05)
[0034] 图7温室防治试验各处理地上部鲜重，不同小写字母表示显著差异（p < 0. 05)
[0035] 图8温室防治试验各处理地下部鲜重，不同小写字母表示显著差异（p < 0. 05)
[0036] 解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株 XZ-173,在 2010 年 9 月 14 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC 4160,地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段。
[0038] 黄豆粉和秸杆，先在60°C烘箱中烘12h去除大部分水分，磨样、粉碎，过20目筛，过 筛后的样品再放入烘相中60°C烘48h至恒重，保存待用。
[0039] 实施例1
[0040] 脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法：（1)脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀 粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株 XZ_173(保藏号 CGMCCN0. 4160)划线于 LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，在30°C，170rpm的条件 下培养24h，获得发酵种子液；称取4. 5kg黄豆粉，3kg結杆，0. 15kg淀粉和0. 15kg酵母提 取物，放入50L发酵罐中，加入IL无机盐溶液，调节基质pH为7,保证含水率为40%，将转 速设为50rpm搅拌60min充分混匀基质，灭菌；其中，无机盐溶液包括（g/L) =KH2PO4 1. 0， MgSO4 · 7H20 0· 5, KCl 0· 5, L-苯丙氨酸 2X 1(Γ3, MnSO4 5X 1(Γ3, CuSO4 0· 16X 1(Γ3, FeSO4 0.15Χ KT3;待发酵罐内温度冷却并保持稳定后，在无菌条件下按5% (v/w)的量接入种子 液，搅拌均匀，调节罐内相对湿度大于80%，通气量0. Ivvm和罐压0. OIMpa，前24h温度设 为25°C进行发酵，24h后将温度设为28°C发酵16h;称取发酵后的基质与水按I : 10(w/v) 的比例混合，室温振荡lh，离心去除不溶物质，在上清液中添加 HCl至pH为1，出现白色絮 状沉淀，低温静置过夜，再以IOOOOrpm离心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烧进行抽提，旋 转蒸发去除有机溶剂，残留物用水溶解并调PH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；
[0041] (2)剥片高岭土制备：将过200目筛的高岭土分别加入其重量4%的水和其重量 4%的尿素，然后在90°C下加热同时快速搅拌lh，获得高岭土-尿素插层复合物；取处理好 的高岭土-尿素插层复合物按0.25% (w/v)的量加到稀硫酸溶液中，混合均匀后用超声波 清洗器进行超声处理，处理过程温度为60°C，持续时间为lOmin，离心后沉淀用无水乙醇清 洗数遍，60°C干燥后，研磨即得剥片高岭土；
[0042] (3)脂肽-高岭土复合生防制剂获得：向水中依次加入脂肽和剥片高岭土，搅拌摇 匀后在摇床上以20°C，150rpm振荡10h，即得到脂肽-高岭土复合生防制剂。
[0043] 实施例2
[0044] 脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法：（1)脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉 芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株XZ-173划线于LB平板上，置于培养箱内活 化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，在30°C，170rpm的条
[0045] 件下培养24h，获得发酵种子液；称取6kg黄豆粉，4. 5kg結杆，0. 2kg淀粉和0. 2kg 酵母提取物，放入50L发酵罐中，加入2L无机盐溶液，调节基质pH为8,含水率为60 %，将 转速设为70rpm搅拌80min充分混匀基质，灭菌；其中，无机盐溶液包括（g/L) =KH2PO4 1.0， MgSO4 · 7H20 0· 5, KCl 0· 5, L-苯丙氨酸 2X 1(Γ3, MnSO4 5X 1(Γ3, CuSO4O. 16X 1(Γ3, FeSO4 0. 15ΧΚΓ3 ;待发酵罐内温度冷却并保持稳定后，在无菌条件下按25% (v/w)的量接入种子 液，搅拌均匀，调节罐内相对湿度大于80%，通气量0. 5vvm和罐压0. 05Mpa，温度设为40°C 发酵48h;称取发酵后的基质与水按I : 10(w/v)的比例混合，室温振荡2h，离心去除不溶 物质，在上清液中添加 HCl至pH为3,出现白色絮状沉淀，低温静置过夜，再以IOOOOrpm离 心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烷进行抽提，旋转蒸发去除有机溶剂，残留物用水溶解并 调PH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；
[0046] (2)剥片高岭土制备：将过200目筛的高岭土分别加入其重量15%的水和其重量 15%的尿素，然后在KKTC下加热同时快速搅拌24h，获得高岭土-尿素插层复合物；取处理 好的高岭土-尿素插层复合物按4% (w/v)的量加到稀硫酸溶液中，混合均匀后用超声波清 洗器进行超声处理，处理过程温度为80°C，持续时间为30min，离心后沉淀用无水乙醇清洗 数遍，60°C干燥后，研磨即得剥片高岭土；
[0047] (3)脂肽-高岭土复合生防制剂获得：向水中依次加入脂肽和剥片高岭土，搅拌摇 匀后在摇床上以40°C，250rpm振荡30h，即得到脂肽-高岭土复合生防制剂。
[0048] 实施例3
[0049] 脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法：（1)脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉 芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株XZ-173划线于LB平板上，置于培养箱内 活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，在30°C，170rpm的条件下培养24h，作为发酵种子 液；称取5. 67kg黄豆粉，3. 67kg秸杆，0. 17kg淀粉和0. 18kg酵母提取物，放入50L发酵罐 中，加入IL无机盐溶液，调节基质pH为7. 5,含水率为55 %，将转速设为70rpm搅拌60min 充分混匀基质，灭菌；其中，无机盐溶液包括（g/L) =KH2PO4 1. 0, MgSO4 · 7H20 0. 5, KCl 0. 5， L-苯丙氨酸 2 X 1(T3, MnSO4 5 X 1(T3, CuSO4 0.16 X 1(T3, FeSO4 0.15 X KT3;待发酵罐内温度 冷却并保持稳定后，在无菌条件下按10% (v/V)的量接入种子液，搅拌均匀，调节罐内相对 湿度大于80%，通气量0. 3vvm和罐压0. 03Mpa，前24h温度设为30°C进行发酵，24h后将温 度设为37°C发酵20h;称取发酵后的基质与水按I : 10(w/v)的比例混合，室温振荡lh，离 心去除不溶物质，在上清液中添加 HCl至pH为2. 0,出现白色絮状沉淀，4°C静置过夜，再以 IOOOOrpm离心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烧进行抽提，旋转蒸发去除有机溶剂，残留物 用水溶解并调PH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；
[0050] (2)剥片高岭土制备：将过200目筛的高岭土分别加入其重量10%的水和其重量 10%的尿素，然后在95°C下加热同时快速搅拌lh，获得高岭土-尿素插层复合物；取处理好 的高岭土-尿素插层复合物Ig加入100ml lmol/L的硫酸溶液中，混合均匀后用超声波清 洗器进行超声处理，处理过程温度为80°C，持续时间为15min，离心后沉淀用无水乙醇清洗 3遍，60°C干燥后，研磨即得剥片高岭土；
[0051] (3)脂肽-高岭土复合生防制剂获得：向水中依次加入脂肽和剥片高岭土，搅拌摇 匀后在摇床上以30°C，170rpm振荡24h，即得到脂肽-高岭土复合生防制剂。
[0052] 实施例4
[0053] 采用超纯水、高岭土（化学纯）、尿素（分析纯）按照实施例3的制备方法得到脂 肽、剥片高岭土和脂肽-高岭土复合生防制剂。
[0054] 1、结构表征
[0055] I. 1扫描电子显微镜（SEM)分析
[0056] 高岭土、剥片高岭土取少量待测粉末样品喷金处理后使用日本日立公司S-4800 场发射扫描电子显微镜观察样品的形貌尺寸。如图1、图2所示，高岭土颗粒堆垛现象严重， 片层较厚，经过插层剥离之后形成的剥片高岭土，颗粒堆垛现象没那么严重，小颗粒增多， 片层变薄，而且剥片高岭土的片层结构依然完好。
[0057] 1. 2红外光谱（FT-IR)分析
[0058] 脂肽-高岭土复合生防制剂离心分离后，用超纯水洗涤沉淀数次，直至洗出的溶 液中用HPLC未检测到脂肽，然后在60°C下干燥，研磨后将粉末及剥片高岭土粉末用KBr 压片，采用Thermo Fisher ISlO红外光谱仪分析主要官能团的变化，波数范围500? 4000CHT1。如图3所示，曲线（a)和（b)比较可知，脂肽-高岭土复合生防制剂经过处理之 后得到的粉末在1455cm \ 1540cm \ 1678cm、1740cm \3567cm 1处出现了一些新的小峰，分 别为脂肪酸链中C-H、N-H、酰胺结构中C = 0、羧酸中C = 0、氢键连接的O-H的特征吸收， 表明脂肽-高岭土复合生防制剂处理后得到的粉末为脂肽与剥片高岭土复合物，进一步表 明脂肽-高岭土复合生防制剂中脂肽与剥片高岭土结合在一起。
[0059] 2、脂肽-高岭土复合生防制剂对番茄青枯病病原菌的抑制活性检测
[0060] 2. 1番茄青枯病病原菌菌液制备
[0061] 在TTC平板上挑取病原菌菌株，接入液体NA培养基中，30°C，170rpm摇床培养至对 数期，用无菌水将菌悬液稀释至IO 6?l〇7cfu/ml，即制得试验用病原菌菌悬液。
[0062] 2. 2抑制活性检测
[0063] 将剥片高岭土 121°C，20min灭菌，脂肽溶液过0. 22μπι滤膜除菌后，加入无菌水在 无菌条件下制备脂肽-高岭土复合生防制剂。将病原菌菌悬液200 μ 1均匀涂布于NA培养 基平板上，然后吸取1〇〇μ 1生防制剂注入平板上牛津杯中，30°C培养24h，观察抑菌状况并 测量抑菌圈大小，重复3次，测定抑菌圈大小均在16. 37±0. 72 (mm)范围内。如图4所示， 该脂肽-高岭土复合生防制剂对番茄青枯病病原菌具有较强的抑制效果，抑菌圈明显，初 步说明该脂肽-高岭土复合生防制剂可以用来防治番茄青枯病。
[0064] 实施例5
[0065] 按照实施例3的制备方法得到脂肽、剥片高岭土和脂肽-高岭土复合生防制剂。
[0066] 1、高岭土-脂肽复合液的制备
[0067] 向水中依次加入脂肽和高岭土，搅拌摇匀后在摇床上以30°C，170rpm振荡24h，即 得到高岭土-脂肽复合液。该复合液中脂肽的质量百分比为0. 1%、高岭土的质量百分比为 2%，其余为水。
[0068] 2、脂肽-高岭土复合生防制剂对番茄青枯病的温室防治试验
[0069] 防治试验在江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室温室大棚内进 行，实验设7个处理，方案如下：（1)CK，番茄幼苗不做任何处理，作为对照；（2)A1，取Img/ mL的脂肽溶液均匀喷施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部，整个处理共喷施300mL ; (3)A2， 取IOmL lmg/mL的脂肽溶液灌入每株番茄幼苗根部；(4)BI，取高岭土 -脂肽复合液均匀喷 施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部，整个处理共喷施300mL ; (5)B2,取IOmL高岭土-脂肽 复合液灌入每株番茄幼苗根部；￠) Cl，取脂肽-高岭土复合生防制剂均匀喷施于每株番茄 幼苗的叶面和茎基部，整个处理共喷施300mL ; (7) C2,取IOmL脂肽-高岭土复合生防制剂 灌入每株番茄幼苗根部。每个处理30盆，每盆装2kg 土，施入等量氮、磷、钾化肥（包括：尿 素、过磷酸钙、氯化钾），每盆移栽1株番茄幼苗，
[0070] 移栽7天后在土中灌入番茄青枯病病原菌菌悬液，使病原菌浓度达到106cfu/g 土 以上，灌菌24h后对番茄幼苗按上述7个处理方案进行处理1次。
[0071] 在处理后第10天、20天、30天、40天按病情分级标准，记录发病情况，统计各处理 病情指数（DI)和防治效果，并统计处理40天后各处理植株株高和地上部地下部鲜重。
[0072] 病情分级标准及病情指数计算方法如下：
[0073] 0级：植株正常；
[0074] 1级：植株25%以下的叶片表现为萎蔫症状；
[0075] 2级：植株26%?50%的叶片表现为萎蔫症状；
[0076] 3级：植株51 %?75%的叶片表现为萎蔫症状；
[0077] 4级：植株76%以上叶片表现为萎蔫症状或植株死亡。
[0078] 病情指数（DI) = [ Σ (各病级植株数X各级代表数值）V (调查总株数X最高 级别数值）X 100%
[0079] 防治效果=(对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数X 100%
[0080] 3、结果与分析：
[0081] 如表1和图5所示，随着番茄植株的生长，与CK相比，其他各处理的病情指数都有 所降低，说明脂肽是防治番茄青枯病的良好物质。处理后第40天采取喷施和灌施脂肽-高 岭土复合生防制剂的病情指数很低，相对防治效果分别为87. 76 %和82. 32%，相较于其他 处理的防治效果具有显著差异，说明脂肽-高岭土复合生防制剂中剥片高岭土与脂肽的结 合能够更好地提高脂肽的稳定性，延长脂肽的作用时间，该脂肽-高岭土复合生防制剂能 有效地防治番茄青枯病。
[0082] 如图6、7和8所示，处理40天后，采取喷施和灌施脂肽-高岭土复合生防制剂的植 株株高，地上部和地下部鲜重均比其他处理高，且与CK相比具有显著差异，说明该脂肽-高 岭土复合生防制剂在防治番茄青枯病的同时能够促进番茄植株生长。
[0083] 表1不同处理对番茄青枯病的温室防治效果
【权利要求】
1. 一种脂肽-高岭土复合生防制剂，其特征在于：该生防制剂由脂肽、剥片高岭土和水 组成。
2. 权利要求1所述的脂肽-高岭土复合生防制剂，其特征在于：该生防制剂中脂肽的 质量百分比为〇. 1%、剥片高岭土的质量百分比为2%，其余为水。
3. 权利要求2所述的脂肽-高岭土复合生防制剂，其特征在于：脂肽由农业废弃物固 体变温发酵所得，对番茄青枯病病原菌具有抑制作用。
4. 权利要求3所述的脂肽-高岭土复合生防制剂，其特征在于：所述农业废弃物为黄 豆粉和秸杆。
5. 权利要求1-4任一项所述脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法，其特征在于：该 制备方法包括如下步骤：（1)脂肽粉末制备：发酵种子液制备；发酵基质准备；接种发酵种 子液；发酵；从发酵后基质中获得脂肽粉末；（2)剥片高岭土制备：高岭土与水、尿素混合， 加热同时快速搅拌，得处理好的高岭土-尿素插层复合物；将高岭土-尿素插层复合物加入 稀硫酸溶液中，混合均匀后进行超声处理，离心分离后用无水乙醇清洗，干燥，研磨得剥片 商岭土；（3)脂肤-商岭土复合生防制剂获得：将上述获得的脂肤粉末和剥片商岭土进行混 合均匀，摇床振荡，得到脂肽-高岭土复合生防制剂。
6. 权利要求5所述的脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法，其特征在于：该制备 方法具体包括如下步骤（1)脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌XZ-173,保藏号 CGMCC NO. 4160,菌株划线于LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种于LB液体培养 基，扩大培养，获得发酵种子液；称取4. 5?6kg黄豆粉，3?4. 5kg結杆，0. 15?0. 2kg淀粉 和0. 15?0. 2kg酵母提取物，放入发酵罐中，加入1?2L无机盐溶液，调节基质pH为7? 8,保证含水率为40 %?60%，充分混匀基质，灭菌待用；待发酵罐内温度冷却并保持稳定 后，在无菌条件下按体积/质量（v/V)为5%?25%的量接入种子液，搅拌均匀，调节罐内 相对湿度大于80%，通气量0. 1?0. 5vvm和罐压0. 01?0. 05Mpa，前24h温度设为25? 40°C进行发酵，24h后将温度设为28?40°C发酵16?24h ;称取发酵后的基质与水混合， 室温振荡1?2h，离心去除不溶物质，调节上清液pH为1?3,出现白色絮状沉淀，低温静 置过夜，然后离心收集沉淀，沉淀用有机溶剂进行抽提，旋转蒸发去除有机溶剂，残留物用 水溶解并调PH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末； (2) 剥片高岭土制备：将过筛的高岭土分别加入其重量4%?15%的水和其重量4%? 15%的尿素，然后在90?100°C下加热同时快速搅拌1?24h，获得高岭土-尿素插层复合 物；取处理好的高岭土-尿素插层复合物按质量/体积（w/v)0. 25%?4%的量加到稀硫酸 溶液中，混合均匀后用超声波清洗器进行超声处理，处理过程温度为60?80°C，持续时间 为10?30min，离心后沉淀用无水乙醇清洗数遍，干燥后研磨即得剥片高岭土； (3) 脂肽-高岭土复合生防制剂获得：向水中依次加入脂肽和剥片高岭土，搅拌摇匀后 在摇床上以20?40°C，150?250rpm振荡10?30h，即得到脂肽-高岭土复合生防制剂。
7. 权利要求6所述的脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法，其特征在于：该制备方 法具体包括如下步骤（1)脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌XZ-173菌株划线 于LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，在30°C，170rpm的条 件下培养24h，获得发酵种子液；称取5. 67kg黄豆粉，3. 67kg秸杆，0. 17kg淀粉和0. 18kg 酵母提取物，放入50L发酵罐中，加入IL无机盐溶液，调节基质pH为7. 5,保证含水率为 55%，将转速设为50?70rpm搅拌60?80min充分混匀基质，灭菌；其中，无机盐溶液包括： KH2PO4L Og/L，MgSO4 ? 7H20 0? 5g/L，KCl 0? 5g/L，L-苯丙氨酸 2 X l(T3g/L，MnS045 X l(T3g/L， CuSO4O. 16Xl(T3g/L，FeSO4O. 15Xl(T3g/L ;待发酵罐内温度冷却并保持稳定后，在无菌条件 下按体积/质量（v/V) 10 %的量接入种子液，搅拌均匀，调节罐内相对湿度大于80 %，通气 量0. 1?0. 5vvm和罐压0. 01?0. 05Mpa，前24h温度设为30°C进行发酵，24h后将温度设 为37°C发酵20h ;称取一定量发酵后的基质与水按质量/体积（w/v) 1:10的比例混合，室温 振荡Ih，离心去除不溶物质，在上清液中添加HCl至pH为2. 0,出现白色絮状沉淀，4°C静置 过夜，再以IOOOOrpm离心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烷进行抽提，旋转蒸发去除有机溶 齐U，残留物用水溶解并调PH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末； (2) 剥片高岭土制备：将过200目筛的高岭土分别加入其重量10%的水和其重量10% 的尿素，然后在95°C下加热同时快速搅拌lh，获得高岭土-尿素插层复合物；取处理好的高 岭土-尿素插层复合物Ig加入100ml lmol/L的硫酸溶液中，混合均匀后用超声波清洗器 进行超声处理，处理过程温度为80°C，持续时间为15min，离心后沉淀用无水乙醇清洗2? 3遍，60°C干燥后，研磨即得剥片高岭土； (3) 脂肽-高岭土复合生防制剂获得：向水中依次加入脂肽和剥片高岭土，搅拌摇匀后 在摇床上以30°C，170rpm振荡24h，即得到脂肽-高岭土复合生防制剂。
8. 权利要求1-4任一项所述脂肽-高岭土复合生防制剂在防治番茄青枯病上的应用。
9. 一种防治番茄青枯病的防治剂，其特征在于：该防治剂包括权利要求1-4任一项所 述的脂肽-高岭土复合生防制剂。
10. 采用权利要求5-7任一项方法制备的脂肽-高岭土复合生防制剂在防治番茄青枯 病上的应用。
【文档编号】A01N25/08GK104322562SQ201410473482
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】吴彥良, 冉炜, 朱震, 孙立飞, 余光辉, 沈其荣 申请人:南京农业大学