一株防病促生的白黑链霉菌及其代谢产物的制备与应用的制作方法

本发明属于微生物农药
技术领域：
，具体涉及一株防病促生的白黑链霉菌及其代谢产物的制备与应用。
背景技术：
：由半知菌亚门真菌灰葡萄孢(botrytiscinera)侵染所致的灰霉病在多种果蔬作物栽培中发生普遍且严重。该病害可危害植物的茎、叶、花和果实，在潮湿多雨及温室大棚环境中发生尤为严重。我国果蔬灰霉病的防治目前主要依靠化学药剂，但是长期大量使用化学药剂存在农药残留、病原菌容易产生抗药性以及环境污染等问题。探索新型高效、广谱、低毒、环保的植物病害防治技术是当今农业生产研究的难点和热点。生物防治具有安全无污染、病原菌不易产生抗药性等特点，是果蔬病害绿色防控的有效途径。国内外目前已有关于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、多粘芽孢杆菌(bacilluspolymyxa)、木霉菌(trichodermaspp.)等微生物对果蔬作物灰霉病防治效果的研究。由于灰霉病病原菌种内变异大，病害发生后传播速度快、有效防治困难，合理开发现有微生物资源，创制新型生防制剂、增添微生物农药种类，对于果蔬病害绿色防控和无公害农产品生产具有重要意义。放线菌(actinomycete)广泛存在于土壤、海洋等不同的自然生态环境中，具有种类繁多、代谢功能各异等特点，是一类具有实际应用价值的微生物种群。从微生物中发现的生物活性物质中有70％来自放线菌，其中约50％是链霉菌属的代谢产物。筛选具有拮抗植物病原真菌活性的放线菌资源，开发可逐步替代化学农药的新型微生物农药产品对于果蔬作物灰霉病绿色防控具有重要意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何抑制果蔬作物病原菌并促进果蔬作物生长。为解决以上技术问题，本发明提供了一株白黑链霉菌。本发明所提供的白黑链霉菌，是菌株号为t22的白黑链霉菌(streptomycesalboniger)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmccno.14190。下文简称白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22。白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22具有序列表中序列1所示的16srdna序列，白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22在高氏一号培养基上气生菌丝白色，无可溶性色素或日久产生淡黄色色素(图1)。显微镜下可观察到白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22气生菌丝直至柔曲，孢子成链，卵圆形(图2)。白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的培养物也属于本发明的保护范围。白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的培养物是将白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22在微生物液体发酵培养基中培养得到的物质。为解决以上技术问题，本发明提供了病原菌抑制剂。本发明所提供的病原菌抑制剂，含有白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22和/或白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的代谢物。上述病原菌抑制剂的活性成分可为白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22和/或白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的代谢物，上述病原菌抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述病原菌抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病原菌的抑制效果确定。上述病原菌抑制剂中，所述病原菌抑制剂可对下述至少一种病原菌具有抑制作用：a、灰霉病菌；b、核果褐腐病菌；c、辣椒炭疽病菌；d、枯萎病菌；e、马铃薯早疫病菌；f、小麦纹枯病菌；g、茄子青枯病菌；h、黄瓜角斑病菌。为解决以上技术问题，本发明提供了病害抑制剂。本发明所提供的病害抑制剂，含有白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22和/或白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的代谢物。上述病害抑制剂的活性成分可为白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22和/或白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的代谢物，上述病害抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述病害抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病害的抑制效果确定。上述病害抑制剂中，所述病害为下述至少一种：a、灰霉病；b、核果褐腐病；c、辣椒炭疽病；d、枯萎病；e、马铃薯早疫病；f、小麦纹枯病；g、茄子青枯病；h、黄瓜角斑病。白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22和/或白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的代谢物的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：1)在抑制病原菌中的应用；2)在制备病原菌抑制剂中的应用；3)在抑制病害中的应用；4)在制备病害抑制剂中的应用。上述应用中，所述病原菌可为下述至少一种：a、灰霉病菌；b、核果褐腐病菌；c、辣椒炭疽病菌；d、枯萎病菌；e、马铃薯早疫病菌；f、小麦纹枯病菌；g、茄子青枯病菌；h、黄瓜角斑病菌。所述病害可为下述至少一种：a、灰霉病；b、核果褐腐病；c、辣椒炭疽病；d、枯萎病；e、马铃薯早疫病；f、小麦纹枯病；g、茄子青枯病；h、黄瓜角斑病。白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22和/或白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的代谢物的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：h、在促进植物种子萌发中的应用；i、在促进植物种子胚轴和/或胚根生长中的应用；j在提高植物种子发芽势中的应用。上述应用中，所述植物可为下述任一种植物：p1)番茄；p2)番茄属植物；p3)茄科植物。上文中，白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的代谢物可从白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的发酵液中获得。所述白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的代谢物可为白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的无菌代谢物。白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备：在液体培养基中培养白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22，过滤除去液体培养物(发酵液)中的白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22即得到白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的无菌代谢物。本申请中，所述灰霉病菌可为番茄灰霉病菌、葡萄灰霉病菌和/或草莓灰霉病菌；所述核果褐腐病菌可为桃褐腐病菌；所述枯萎病菌可为黄瓜枯萎病菌、甘蓝枯萎病菌和/或棉花枯萎病菌。所述灰霉病可为番茄灰霉病、葡萄灰霉病和/或草莓灰霉病，所述核果褐腐病可为桃褐腐病；所述枯萎病可为黄瓜枯萎病、甘蓝枯萎病和/或棉花枯萎病。上文中，所述病原菌抑制剂和病害抑制剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述病原菌抑制剂和病害抑制剂中，白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22可以孢子、菌丝或含有孢子和/或菌丝的培养物的形式存在。所述病原菌抑制剂和病害抑制剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。根据需要，所述病原菌抑制剂和病害抑制剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。本发明以果蔬病害病原真菌为靶标，从青藏高原特殊生境土壤中分离筛选获得一株兼具防病促生作用的微生物菌种-白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22，对包括灰霉病菌在内的多种植物病原真菌具有良好的广谱拮抗活性，其无菌发酵滤液能够有效促进番茄种子发芽，并对番茄灰霉病具有良好的离体防效，因此可应用于果蔬真菌病害尤其是灰霉病的绿色防控，为制备微生物农药新产品提供新资源。白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22对果蔬作物灰霉病菌、桃褐腐病菌及辣椒炭疽病菌等均具有抑制作用(表3，图4)。白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液能够有效抑制草莓灰霉病菌、番茄灰霉病菌及黄瓜枯萎病菌菌丝生长(图5)。同时白黑链霉菌t22能够通过产生纤维素酶和几丁质酶在产酶活性检测培养基上形成水解圈(图6)。说明白黑链霉菌t22能够通过产生抗生素类活性物质和水解酶类物质抑制植物病原真菌。白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液适当稀释后可显著促进番茄胚轴和/或胚根伸长，增强番茄种子发芽势。与对照相比，白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液100倍稀释液显著增加了番茄胚轴、胚根长度，提高了番茄种子发芽势，增幅分别高达15.1％、29.7％和43.9％；白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液200倍稀释液处理的番茄种子，其胚轴、胚根长度和种子发芽势较对照增加了8.8％、18.1％和32.3％(表4)。白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌代谢物(无菌发酵滤液)喷施处理番茄离体叶片能够明显降低番茄灰霉病病斑直径，白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌代谢物(无菌发酵滤液)处理对番茄灰霉病离体防效达到55.1％(表5)。说明白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液喷施处理对番茄离体叶片灰霉病具有良好的防治效果(图7)。白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22能够人工培养，培养条件简单、产孢良好，制成生防菌剂适于工业化生产，具有良好的开发应用前景。保藏说明菌种名称：白黑链霉菌(streptomycesalboniger)菌株编号：t22保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：cgmcc地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2017年05月25日保藏中心登记入册编号：cgmccno.14190附图说明图1为菌株t22在高氏一号琼脂培养基上的菌落形态。图2为菌株t22在40倍光学显微镜下的菌丝和孢子形态。图3为基于菌株t2216srdna序列构建的系统进化树，其中菌株t22与白黑链霉菌streptomycesalboniger菌株(nr043228、ab184331)聚在同一分支上，相似性达99％。图4为菌株t22对病原真菌的平皿拮抗效果，其中a、b、c分别为菌株t22对番茄灰霉病菌、桃褐腐病菌、辣椒炭疽病菌的抑制作用。图5为菌株t22无菌发酵滤液对植物病原真菌的抑制作用，a、c、e分别为未加入菌株t22无菌发酵液pda培养基上黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌菌落，b、d、f分别为加入菌株t22无菌发酵滤液pda培养基上黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌菌落。图6为菌株t22产纤维素酶和几丁质酶情况，a、b分别为菌株t22在纤维素刚果红培养基和胶体几丁质刚果红培养基上产生的水解圈。图7为菌株t22无菌发酵滤液对番茄灰霉病的离体防效其中，a、b未接种液体培养基喷施+灰霉病菌，c、d菌株t22无菌发酵滤液喷施+灰霉病菌，e、f50％咯菌腈1000倍液喷施+灰霉病菌。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用到的病原菌公众可从野外采集，也可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验：番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)、黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、桃褐腐病菌(moniliniafructicola)、辣椒炭疽病菌(colletotrichumcapsici)、棉花枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)、甘兰枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.conglutinans)、小麦纹枯病菌(rhizoctoniacereali)、串珠镰刀病菌(fusariummoniliforme)、茄子青枯病菌(ralstoniasolanacearum)、大白菜黑腐病菌(xanthomonascampestrispv.campsetris)(王俊丽等.一株芽孢杆菌qd-10的鉴定及生防特性分析.中国生物防治学报,2014,30(4):564-572.)。马铃薯早疫病菌(alternariaalternata)(zheng,etal.characterizationofalternariaspeciesassociatedwithpotatofoliardiseasesinchina.plantpathology,2015,64:425-433.)。草莓灰霉病菌(botrytiscinerea)、葡萄灰霉病菌(botrytiscinerea)、黄瓜角斑病菌(pseudomonassyringaepv.lachrymans)(卢彩鸽等.一株甘兰枯萎病拮抗细菌的筛选、鉴定及其抑菌活性测定.华北农学报,2014,29(1):195-202.)。实施例1、白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的分离与鉴定1.1菌株分离该菌株从中国青海省青藏高原特殊生境土样中分离获得。菌株采用稀释平板法分离，具体操作方法如下：称取土壤样品10g，倒入装有小玻璃珠和90ml无菌水的三角瓶中，振荡30min后静置5min，依次稀释10倍，分别配制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的悬浮液，吸取不同浓度的悬浮液各0.1ml加到高氏一号培养基(加入终浓度为75mg/l的k2cro7)平板上，均匀涂布后置于28℃培养观察，5-7天后挑取不同的单菌落划线纯化。将纯化后的菌株转接到高氏一号斜面培养基上培养，4℃保存备用。取编号为t22的菌株(简称菌株t22)进行下述鉴定。1.2菌株鉴定1.2.1菌株形态观察将菌株t22接种于《链霉菌鉴定手册》推荐的培养基上，28℃培养7-10d观察菌株生长情况，记录气生菌丝的颜色、基内菌丝的颜色以及可溶性色素的有无及颜色。将菌株t22划线接种在高氏一号培养基上，以45度角斜插入无菌盖玻片，28℃培养7d后，取出盖玻片在光学显微镜下观察菌丝和孢子的形态特征。菌株t22在高氏一号琼脂、葡萄糖天门冬素琼脂、马铃薯琼脂、酵母膏麦芽膏琼脂、燕麦粉琼脂培养基上生长良好，气生菌丝白色；在蔗糖硝酸盐琼脂、无机盐淀粉琼脂培养基上气生菌丝白色至淡橄榄软皮黄色、淡绿灰黄色。菌株t22在高氏一号琼脂、蔗糖硝酸盐琼脂培养基上无可溶性色素，在葡萄糖天门冬素琼脂、马铃薯琼脂、酵母膏麦芽膏琼脂、燕麦粉琼脂、无机盐淀粉琼脂培养基上可溶性色素暗黄色至黑色(表1)。显微镜下可以观察到菌株t22气生菌丝直至柔曲，孢子成链，卵圆形(图2)。根据以上形态特征将t22初步鉴定为链霉菌属(streptomycessp.)。其中高氏一号琼脂：可溶性淀粉20.0g，nacl0.5g，kno31.0g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，feso40.02g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，ph7.2-7.4，121℃灭菌30min。蔗糖硝酸盐琼脂：蔗糖50.0g，kno30.2g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，ph7.2，121℃灭菌30min。葡萄糖天门冬素琼脂：葡萄糖10.0g，天门冬素0.5g，牛肉膏2.0g，k2hpo40.5g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，ph7.2，121℃灭菌30min。马铃薯琼脂：马铃薯浸汁200ml，蔗糖20.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，ph7.2-7.4，121℃灭菌30min。酵母膏麦芽膏琼脂培养基(isp2)：酵母膏4.0g，麦芽膏10.0g，葡萄糖4.0g，微量盐溶液1.0ml，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，ph7.2，121℃灭菌30min。燕麦粉琼脂(isp3)：燕麦片20.0g(加水1000ml煮沸20min后过滤并补水至1000ml)，微量盐溶液1.0ml，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，ph7.2，121℃灭菌30min。无机盐淀粉琼脂(isp4)：可溶性淀粉10.0g，k2hpo42.0g，mgso4·7h2o1.0g，(nh4)2so42.0g，caco32.0g，微量盐溶液1.0ml，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，ph7.2，121℃灭菌30min。微量盐溶液：feso4·7h2o0.1g，mncl2·4h2o0.1g，znso4·7h2o0.1g，蒸馏水1000ml。表1菌株t22在不同培养基上的形态特征培养基气生菌丝基内菌丝可溶性色素高氏一号琼脂白色微黄至黄褐色无蔗糖硝酸盐琼脂白色至淡绿灰黄色白色无葡萄糖天门冬素琼脂白色黑灰色黑灰色马铃薯琼脂白色黄色暗绿黑色酵母膏麦芽膏琼脂(isp2)白色微黄色暗黄色燕麦粉琼脂(isp3)白色无色至微黄色暗黄色无机盐淀粉琼脂(isp4)白色至淡橄榄软皮黄色微黄色黑色1.2.2菌株生理生化特性检测生理生化特性主要检测菌株对主要碳源的利用情况以及产素活性。菌株t22能够利用d-葡萄糖、l-阿拉伯糖、d-甘露醇、肌醇、麦芽糖、棉子糖，不能利用l-鼠李糖、蔗糖、木糖、果糖。菌株t22牛奶胨化、淀粉水解、明胶液化阳性，不产生纤维素、黑色素、硫化氢(表2)。表2菌株t22生理生化特性碳源利用结果酶活结果d-葡萄糖+牛奶胨化+l-阿拉伯糖+淀粉水解+d-甘露醇+明胶液化+肌醇+纤维素-麦芽糖+黑色素-棉子糖+硫化氢-l-鼠李糖-蔗糖-木糖-果糖-注：“+”为阳性，“-”为阴性。1.2.3菌株分子生物学鉴定挑取菌株t22接种于高氏一号琼脂培养基上，28℃培养7d收集菌体。采用细菌基因组提取试剂盒提取菌株t22基因组dna后，利用细菌通用引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’和1492r：5’-tacggctaccttgttacgactt-3’进行菌株t22的16srdna序列pcr扩增。回收pcr扩增产物，经连接、转化、鉴定后，阳性克隆送北京博迈德生物技术公司测序，菌株t22具有序列表中序列1的16srdna序列。将所得序列采用blast软件在genbank进行同源性比较，clustalx软件进行多序列比对，mega5.0软件中neighbor-joining法构建系统进化树。blast分析比对，发现与菌株t22同源性较高的菌株均属于链霉菌属，选取相似性较高菌株的16srdna序列采用mega5.0软件构建系统发育树(图3)。结果表明，菌株与streptomycesalboniger(nr043228、ab184331)属于同一分支，相似性达到99％，并结合形态学特征和培养特征，将菌株t22鉴定为白黑链霉菌(streptomycesalboniger)。白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22已于2017年05月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.14190。下文称为白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22或菌株t22。实施例2、白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22的抑菌活性2.1琼脂块法：无菌移液管吸取5ml无菌水于供试靶标病原菌培养物斜面，用竹签将菌丝刮下制备病原菌悬液，用1ml无菌移液管吸取0.1ml菌悬液均匀涂布于pda(病原真菌)或lb(病原细菌)平板上。供试病原真菌为番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)、草莓灰霉病菌(botrytiscinerea)、葡萄灰霉病菌(botrytiscinerea)、桃褐腐病菌(moniliniafructicola)、辣椒炭疽病菌(colletotrichumcapsici)、交链格孢菌(alternariaalternata)、黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、棉花枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)、甘蓝枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.conglutinans)、小麦纹枯病菌(rhizoctoniacereali)、串珠镰刀菌(fusariummoniliforme)。供试病原细菌为茄子青枯病菌(ralstoniasolanacearum)、大白菜黑腐病菌(xanthomonascampestrispv.campsetris)、黄瓜角斑病菌(pseudomonassyringaepv.lachrymans)。打孔器切取高氏1号平板上培养7d的、直径为0.7cm的白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22琼脂块，接种于涂有病原菌的平板上。病原真菌25℃培养4d、病原细菌28℃培养2d后，测量拮抗圈直径。结果表明白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22对包括番茄灰霉病菌在内的多种植物病原菌表现出良好的皿内拮抗性(图4)，拮抗圈直径为12-26mm(表3)。表3白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22对供试病原菌的拮抗圈直径2.2生长速率法2.2.1白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液的制备接种环挑取平板上生长好的白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22接种到装有100ml液体发酵培养基的500ml三角瓶中，28℃摇床180rpm振荡培养7d，收集发酵液，10000rpm、4℃离心10min去除菌体，发酵液上清液采用0.22μm微孔滤膜过滤发酵液除去培养物中的白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22菌体，得到白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液(简称菌株t22无菌发酵滤液)。其中，液体发酵培养基为高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g，kno31g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso4·7h2o0.01g用蒸馏水定容到1000ml，121℃条件下灭菌20min，得液体发酵培养基。2.2.2病原菌菌饼制备向已培养5d的黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)和草莓灰霉病菌(botrytiscinerea)斜面中各加入无菌水4ml，用竹签将菌丝刮下制备病原菌菌悬液。用1ml无菌移液管吸取0.1ml菌悬液涂布于pda平板上，28℃培养5d后，病原菌菌落长满pda平板，用无菌打孔器制成直径7mm圆形病原菌菌饼。2.2.3拮抗菌无菌发酵滤液抑菌率测定将白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液与冷却至50℃左右的pda培养基按体积比1:4混匀后倒平板,用灭菌竹签挑取上述供试病原菌菌饼于平板中央菌面朝上，每处理重复3次，以无菌水代替无菌发酵滤液为对照。25℃培养4d用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。抑菌率％＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照菌落直径×100。供试病原真菌在含有菌株t22无菌发酵滤液的pda平板上几乎不生长，而在无菌水对照pda平板上生长正常(图5)。菌株t22无菌发酵滤液对黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)和草莓灰霉病菌(botrytiscinerea)菌丝生长具有明显的抑制作用，抑菌率分别为79.1％、84.6％和85.5％。实施例3、白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22产纤维素酶和几丁质酶活性接种环挑取平板上生长好的白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22于产纤维素酶培养基和产几丁质酶培养基，28℃培养7d后，向平板中加入2g/l的刚果红染液5ml，染色30min后去离子水冲洗干净，再用1m的nacl溶液脱色，去离子水冲洗干净，观察菌落周围形成水解圈情况。产纤维素酶培养基：纤维素粉5.0g，(nh4)2so42.0g，kh2po41.0g，nacl0.5g，mgso4·7h2o0.5g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml。产几丁质酶培养基：胶体几丁质2.5g，k2hpo40.7g，k2hpo40.3g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o0.01g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml。结果表明白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22周围有水解圈形成，说明白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22能够产生纤维素酶和几丁质酶(图6)。实施例4、白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液对种子发芽的影响4.1白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液的制备接种环挑取平板上生长好的白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22接种到装有100ml液体发酵培养基的500ml三角瓶中，28℃摇床180rpm振荡培养7d，收集发酵液，采用0.22μm微孔滤膜过滤发酵液除去培养物中的白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22菌体，得到白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液。其中，液体发酵培养基为高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g，kno31g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso4·7h2o0.01g用蒸馏水定容到1000ml，121℃条件下灭菌20min，得液体发酵培养基。4.2白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液稀释液制备将步骤4.1的白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液分别用无菌水稀释10倍、100倍、200倍、500倍，得到白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液10倍稀释液、白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液100倍稀释液、白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液200倍稀释液和白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液500倍稀释液。4.3种子发芽试验选取颗粒饱满、大小一致的番茄(佳粉1号)种子，采用步骤4.2的白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液10倍稀释液、100倍稀释液、200倍稀释液和500倍稀释液浸泡种子，用等体积的步骤4.1的液体发酵培养基(无菌)作为对照。每个处理设三次重复，每次重复设10粒种子。28℃培养24h，收集种子，无菌水冲洗干净种子后，将其放在铺有两层无菌水浸湿滤纸的培养皿中，28℃保湿培养5d，统计发芽率，测量胚轴、胚根长度。实验结果表明，与对照相比白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液100倍稀释液显著增加了番茄胚轴、胚根长度，提高了番茄种子发芽势，增幅分别高达15.1％、29.7％和43.9％；白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液200倍稀释液处理的番茄种子，其胚轴、胚根长度和种子发芽势较对照增加了8.8％、18.1％和32.3％(表4)。表4白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液对番茄种子发芽的影响实施例5、白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22发酵液对番茄灰霉病离体防治效果采用离体叶片法，选取30片大小一致的番茄植株顶端叶片，2％(w/v)次氯酸钠消毒3min，自来水冲洗晾干。试验设3组处理，每组处理10片叶片，包括未接种液体培养基喷施+灰霉病菌处理，菌株t22发酵液喷施+灰霉病菌处理，50％咯菌腈1000倍液喷施+灰霉病菌处理(图7)。1、菌株t22发酵液喷施+灰霉病菌处理：用实施例4的步骤4.1的白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液对番茄叶片进行喷施处理，直到布满叶片，24h后采用灭菌打孔器切取直径7mm的番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)菌饼接种于处理叶片中央。2、未接种液体培养基喷施+灰霉病菌处理：用实施例4的步骤4.1的液体发酵培养基(无菌)替换实施例4的步骤4.1的白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液，其它操作同步骤1。作为空白对照。3、50％咯菌腈1000倍液喷施+灰霉病菌喷施处理：用50％咯菌腈1000倍液替换实施例4的步骤4.1的白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液，其它操作同步骤1。作为化学药剂对照。7d后测量处理和对照番茄叶片病斑直径，根据公式：防效％＝(空白对照平均病斑直径—处理平均病斑直径)/空白对照平均病斑直径×100％，计算菌株t22发酵液对番茄灰霉病的离体防效。结果表明白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液(无菌代谢物)喷施处理番茄离体叶片能够明显降低番茄灰霉病病斑直径，白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液(无菌代谢物)处理番茄灰霉病的离体防效达到55.1％(表5)。表5、白黑链霉菌(streptomycesalboniger)t22无菌发酵滤液对番茄灰霉病离体防效处理病斑直径cm防效％未接种液体培养基喷施+灰霉病菌2.16±0.23-菌株t22发酵液喷施+灰霉病菌0.97±0.2155.1％50％咯菌腈1000倍液喷施+灰霉病菌0.84±0.0961.1％<110>北京市农林科学院<120>一株防病促生的白黑链霉菌及其代谢产物的制备与应用<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1310<212>dna<213>白黑链霉菌（streptomycesalboniger）<400>1agtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgcccttcactctgggacaagccctgg60aaacggggtctaataccggataacacctccactctcctgagtggaggttaaaagctccgg120cggtgaaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtgaggtaatggctcaccaaggcg180acgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccaga240ctcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgac300gccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgaaa360gtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgt420agggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgt480cgggtgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcattcgatacgggctagctagagtg540tggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaaca600ccggtggcgaaggcggatctctgggccattactgacgctgaggagcgaaagcgtggggag660cgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggaactaggtgttggcg720acattccacgtcgtcggtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggc780cgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggct840taattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatacaccggaaagcatcagag900atggtgccccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgt960gagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgttctgtgttgccagcatgccc1020ttcggggtgatggggactcacagaagaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggacg1080acgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggcaggtaca1140atgagctgcgataccgtgaggtggagcgaatctcaaaaagcctgtctcagttcggattgg1200ggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagttgctagtaatcgcagatcagcattgctgc1260ggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaag1310当前第1页12