以人CYP2C19*2基因681位点GG型为模板的阳性参考品的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种以人cyp2c19*2基因681位点gg型为模板的阳性参考品，该阳性参考品用于验证cyp2c19*2基因型检测试剂盒在应用于样本检测时样本是否为阳性的辅助判断。

背景技术：

质控品是指用于体外诊断的质量控制物质，其具有已知浓度含量的目标检测物，为使人们确信某一产品或服务质量能满足规定的质量要求所必须的产品。质控品的使用目的是为了验证整个pcr反应过程具有准确性、有效性和特异性，并监控检测系统的状态。仪器在正式投入使用后，应定期对其校准，避免由于仪器原因导致的实验偏差。再次，在收到每批新试剂后，应首先对其进行预实验，确证新试剂质量后，再用于对临床标本的检测。

但是据申请人了解，目前在检测未变异人cyp2c19*2基因质量控制方面没有阳性参考品。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种以人cyp2c19*2基因681位点gg型为模板的阳性参考品，用于验证被检样本中是否含有人cyp2c19*2基因681位点gg型这一检测结果是否准确，解决了人cyp2c19*2基因的质量检测问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种以人cyp2c19*2基因681位点gg型为模板的阳性参考品，该阳性参考品是一种以碱基序列为主要成分的试剂，该碱基序列包含人cyp2c19*2基因片段，所述人cyp2c19*2基因片段为5’-ttacaaccagagcttggcatattgtatctatacctttattaaatgcttttaatttaataaattattgttttctcttagatatgcaataattttcccactatcattgattatttcccgggaacccataacaaattacttaaaaaccttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagta-3’，其中，带有下划线的碱基位点是人cyp2c19*2基因的681位点，所述681位点用于表征人cyp2c19*2基因的gg型可突变为人cyp2c19*2基因的aa型的位置。

上述技术方案中的有关内容解释如下：

1、上述方案中，所述阳性参考品中还含有缓冲试剂，该缓冲试剂选自ph为7.6的tris-hcl缓冲液或ph为7.6的te缓冲液。

2、上述方案中，所述阳性参考品中含有的人cyp2c19*2基因序列是构建到质粒载体上保存，根据现有技术即可得到，质粒构建过程如下：

引物设计——pcr扩增——割胶回收dna片段——构建载体——转化培养——阳性克隆鉴定——37℃摇床培养——质粒抽提——测序确认碱基序列。

抽提后的质粒再配制成所述阳性参考品，配制方法如下：

（1）配制稀释液：加入50%配方量的纯化水→加入tris-hcl缓冲液（ph7.6）→加入剩余的纯化水（涡旋震荡3次，每次5秒）→得0.002mol/l的tris-hcl（ph7.6）稀释液；

（2）人cyp2c19*2基因681位点gg纯合载体质粒预稀释：加入50%配方量的所述稀释液→加入人cyp2c19*2基因681位点gg纯合载体质粒溶液→加入剩余的所述稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→得到x拷贝/微升人cyp2c19*2基因681位点gg纯合质粒溶液（x代表质粒浓度的具体数值）；

（3）得到阳性参考品：加入50%配方量的稀释液→加入x拷贝/微升人cyp2c19*2基因681位点gg纯合质粒溶液→加入剩余的稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→得到阳性参考品。

本发明的特点以及有益效果是：所述阳性参考品实质是事先设计好的、当做已知浓度及碱基序列的样本，和其他被检样本（即人全血）一起利用相关的cyp2c19*2基因型检测试剂盒进行检测，从而验证被检样本检测结果的准确性。也就是说，在利用cyp2c19*2基因型检测试剂盒检测被检样本时，本发明的阳性参考品相当于是一种已知浓度的阳性样本，用于验证cyp2c19*2基因型检测试剂盒的检测结果是否真实、有效，解决了人cyp2c19*2基因的质量检测问题。

附图说明

附图1为人cyp2c19*2基因的681位点为gg型时的荧光定量pcr扩增熔解曲线图，横坐标是温度，纵坐标是荧光微分值；

附图2为人cyp2c19*2基因的681位点为aa型时的荧光定量pcr扩增熔解曲线图，横坐标是温度，纵坐标是荧光微分值；

附图3为人cyp2c19*2基因的681位点为ga型时的荧光定量pcr扩增熔解曲线图，横坐标是温度，纵坐标是荧光微分值；

附图4为空白对照时的荧光定量pcr扩增熔解曲线图，横坐标是温度，纵坐标是荧光微分值。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例：一种以人cyp2c19*2基因681位点gg型为模板的阳性参考品

gg型阳性参考品是一种以碱基序列为主要成分的试剂，该碱基序列包含人cyp2c19*2基因片段，所述人cyp2c19*2基因片段为5’-ttacaaccagagcttggcatattgtatctatacctttattaaatgcttttaatttaataaattattgttttctcttagatatgcaataattttcccactatcattgattatttcccgggaacccataacaaattacttaaaaaccttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagta-3’（如seqno:4所示），其中，带有下划线的碱基位点是人cyp2c19*2基因的681位点，所述681位点用于表征人cyp2c19*2基因的gg型可突变为人cyp2c19*2基因的aa型的位置。所述gg型阳性参考品中还含有缓冲试剂，该缓冲试剂为ph为7.6的tris-hcl缓冲液。

aa型阳性参考品是一种以碱基序列为主要成分的试剂，该碱基序列包含人cyp2c19*2基因片段，所述人cyp2c19*2基因片段为5’-ttacaaccagagcttggcatattgtatctatacctttattaaatgcttttaatttaataaattattgttttctcttagatatgcaataattttcccactatcattgattatttcccaggaacccataacaaattacttaaaaaccttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagta-3’（如seqno:5所示），其中，带有下划线的碱基位点是人cyp2c19*2基因的681位点，所述681位点用于表征人cyp2c19*2基因的gg型可突变为人cyp2c19*2基因的aa型的位置。所述aa型阳性参考品中还含有缓冲试剂，该缓冲试剂为ph为7.6的tris-hcl缓冲液。

ga型阳性参考品是通过所述gg型阳性参考品与aa型阳性参考品按等体积混合配制而成。所述gg型阳性参考品中含有gg纯合型dna序列的浓度为500拷贝/微升，所述aa型阳性参考品中含有aa纯合型dna序列的浓度为500拷贝/微升，那么，所述ga型阳性参考品中含有gg纯合型dna序列和aa纯合型dna序列的浓度均为500拷贝/微升。

所述gg型阳性参考品、aa型阳性参考品以及ga型阳性参考品作为cyp2c19*2基因型检测试剂盒中的一部分。

在本实施例中，cyp2c19*2基因型检测试剂盒包括koddna聚合酶、上游引物、下游引物、特异性靶向荧光探针、gg型阳性参考品、aa型阳性参考品以及ga型阳性参考品；

所述上游引物为针对人cyp2c19*2基因设计的上游引物，上游引物的序列为5’-accagagcttggcatattgtatctatacc-3’（如seqno:1所示）；

所述下游引物为针对人cyp2c19*2基因设计的下游引物，下游引物的序列为5’-ccaaaatatcactttccataaaagcaag-3’（如seqno:2所示）；

所述特异性靶向荧光探针是带有人cyp2c19*2基因的特异性配对序列的探针，其碱基序列为5’-ttgattatttcccaggaacc-3’（如seqno:3所示），荧光染料为氟硼二吡咯。

所述cyp2c19*2基因型检测试剂盒还包括阳性质控品，阳性质控品是一种以碱基序列为主要成分的试剂，阳性质控品是通过所述gg型阳性参考品与aa型阳性参考品按等体积混合配制而成，所述阳性质控品含有gg纯合型dna序列和aa纯合型dna序列的浓度均为1000拷贝/微升。

所述阳性质控品是事先设计好的、当做已知浓度及碱基序列的样本，和其他被检样本一起进行检测，它作为试剂盒的一部分，与其他试剂配套使用，用于用户验证检测结果的准确性。

在实际生产中，所述cyp2c19*2基因型检测试剂盒可以做成包含下列组分的试剂盒：

（1）聚合酶试剂[kodmix]：由koddna聚合酶、dntp等组成，规格为140μl×2支、140μl×4支或140μl×6支；

（2）引物・探针试剂[cyp2c19*2mix]：即由上游引物、下游引物以及特异性靶向荧光探针组成的混合试剂，规格为140μl×1支、140μl×2支或140μl×3支；

（3）gg型阳性参考品、aa型阳性参考品以及ga型阳性参考品，规格均为100μl×1支；

（4）阳性质控品，规格为150μl×1支。

其中，gg型阳性参考品、aa型阳性参考品以及ga型阳性参考品中的dna序列均是构建到载体质粒上保存，原始质粒购置于生工生物工程（上海）股份有限公司，载体质粒构建过程属于现有技术，具体过程如下：

引物设计——pcr扩增——割胶回收dna片段——构建载体——转化培养——阳性克隆鉴定——37℃摇床培养——质粒抽提——测序确认碱基序列。

抽提后的质粒再配制成所述gg型阳性参考品，配制方法如下：

（1）配制稀释液：加入50%配方量的纯化水→加入tris-hcl缓冲液（ph7.6）→加入剩余的纯化水（涡旋震荡3次，每次5秒）→得0.002mol/l的tris-hcl（ph7.6）稀释液；

（2）人cyp2c19*2基因681位点gg纯合载体质粒预稀释：加入50%配方量的所述稀释液→加入人cyp2c19*2基因681位点gg纯合载体质粒溶液→加入剩余的所述稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→得到x拷贝/微升人cyp2c19*2基因681位点gg纯合质粒溶液（x代表质粒浓度的具体数值）；

（3）得到gg型阳性参考品：加入50%配方量的稀释液→加入x拷贝/微升人cyp2c19*2基因681位点gg纯合质粒溶液→加入剩余的稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→得到gg型阳性参考品。

抽提后的质粒再配制成所述aa型阳性参考品，配制方法如下：

（1）配制稀释液：加入50%配方量的纯化水→加入tris-hcl缓冲液（ph7.6）→加入剩余的纯化水（涡旋震荡3次，每次5秒）→得0.002mol/l的tris-hcl（ph7.6）稀释液；

（2）人cyp2c19*2基因681位点aa纯合载体质粒预稀释：加入50%配方量的所述稀释液→加入人cyp2c19*2基因681位点aa纯合载体质粒溶液→加入剩余的所述稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→得到x拷贝/微升人cyp2c19*2基因681位点aa纯合质粒溶液（x代表质粒浓度的具体数值）；

（3）得到aa型阳性参考品：加入50%配方量的稀释液→加入x拷贝/微升人cyp2c19*2基因681位点aa纯合质粒溶液→加入剩余的稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→得到aa型阳性参考品。

检测方法包括以下步骤：

第一步，准备被检样本，以被检样本作为检测的对象，被检样本为人全血；用样本溶解液把采集的人全血稀释25倍后，作为所述被检样本；其中，所述样本溶解液是由缓冲液和纯化水组成，缓冲液与纯化水的体积比为1：99，缓冲液为ph为7.6的tris-hcl缓冲液；

第二步，以所述被检样本为模板基因链，利用所述试剂盒进行荧光定量pcr扩增反应，荧光定量pcr扩增反应的反应体系为：

上游引物0.1μmol/l，1.4μl；

下游引物0.1μmol/l，1.4μl；

特异性靶向荧光探针0.1μmol/l，1.0μl；

mgcl2*6h2o0.35g/l，1.4μl；

dntps0.02mm，0.4μl；

koddna聚合酶0.02u/μl，0.4μl；

kodbuffer3.2μl；

模板4μl；

在上述荧光定量pcr扩增反应的反应体系中，在各组分的使用浓度不变的前提下，各组分的体积用量最多可为上述数值的2倍，即上游引物的所用体积为2.8μl，下游引物的所用体积为2.8μl，特异性靶向荧光探针的所用体积为2.0μl，mgcl2*6h2o的所用体积为2.8μl，dntps的所用体积为0.8μl，koddna聚合酶的所用体积为0.8μl，kodbuffer的所用体积为6.4μl，模板的所用体积为8μl；

所述荧光定量pcr扩增反应的反应过程如下：

（1）94.0℃预变性30.0秒，

（2）97.0℃变性1.0秒，

（3）60.0℃退火3.0秒，

（4）63.0℃延伸5.0秒，其中，步骤（2）~（4）循环50次；

第三步，用高分辨率熔解曲线法进行检出，检出条件依次为：

（1）94.0℃，30.0秒，

（2）39.0℃，30.0秒，

（3）40.0~75.0℃，0.09℃/秒；

直接在全自动基因分析仪genecube（生产商为toyobo）上进行荧光定量pcr扩增反应和检测。具体步骤为：将被检样本4μl、聚合酶试剂[kodmix]4μl、引物・探针试剂[hpcmix]5.2μl混合后，调制成反应液。专用吸管吸取反应液到专用塑料毛细管中。进行扩增反应。进行检出，测定波长为510nm~550nm的荧光值。测定的荧光值由专用分析软件解析，转换成表示荧光变化量的荧光微分值。解析荧光微分值，在显示屏上显示测定结果。

第四步，检出结果通过阳性判断值来判断，阳性判断值的三种结果的判断依据为：

（1）cyp2c19*2基因的681位点为gg纯合子：荧光微分值≥7，并且熔解曲线峰值所在的熔解温度在48.7℃~54.1℃之间，参见附图1所示；

（2）cyp2c19*2基因的681位点为aa纯合子：荧光微分值≥5，并且熔解曲线峰值所在的熔解温度在56.3℃~60.7℃之间，参见附图2所示；

（3）cyp2c19*2基因的681位点为ga杂合子：荧光微分值≥7，并且熔解曲线峰值所在的溶解温度在48.7℃~54.1℃之间；同时，荧光微分值≥5，且熔解曲线峰值所在的溶解温度在56.3℃～60.7℃之间，参见附图3所示。

所述荧光微分值是指对检测到的目标物的荧光强度随温度变化的值做微分求导，得到荧光微分值。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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<110>踏石生物科技（苏州）有限公司

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