本发明属于基因检测领域。
背景技术：
：脑小血管一般被认为是脑的穿支动脉(100～500μm)和小动脉(＜100μm)、毛细血管及小静脉。它们构成了脑组织血供的基本单位，对脑功能的维持起重要作用。其主要功能包括血液运输、血管舒缩调节、构成血脑脊液屏障的核心部位、细胞间液生成及回流。当脑小血管发生病变时，一方面使脑血管舒缩调节的效应器丧失，导致脑血流调节障碍，出现低灌注及缺血，进而发展为脑白质病变和腔隙性脑梗死；另一方面血管内血浆及细胞成分溢出，血脑屏障损害，导致微出血及血管周围间隙扩大，同时加重脑白质病变和脑梗死。脑小血管疾病(cerebralsmallvesseldisease，csvd)是泛指上述小血管的各种病变所导致的临床、认知、影像学及病理表现的综合征。临床习惯上多指小的穿支动脉和小动脉病变所导致的临床和影像学表现，通常累及直径＜300μm的动脉血管。其病理学特点为小血管呈纤维素样变性、淀粉样变性、出血和狭窄或闭塞，而非粥样硬化性改变。临床特点为隐袭性起病，持续性、进展性病程，主要临床表现为卒中发作，腔隙状态综合征，认知功能障碍综合征等，常伴发其他器官功能损害，约占缺血性卒中总数的1％左右。脑小血管病是隐袭性脑血管病，其临床表现存在“寂静”现象，所以容易被患者及医务工作者忽视。目前，脑小血管病的诊断和确诊主要通过神经影像学材料，但是该方法的操作复杂，费时且价格昂贵，并且对于脑小血管病的筛查及预防不具备普遍的意义。通过对遗传性脑小血管病患者进行基因检测，可明确诊断，对脑血管病患者早期个体化防治提供有力证据。传统基因检测方法基于sanger测序，需先明确想要检测的基因，通过聚合酶链式扩增技术(pcr)将目标区段扩增出来，再使用双脱氧终止法(sanger测序)进行测序确定致病突变。该方法通量低、效率差、成本高、且检出率不理想，目前已经报道过的检出率为1％-7％。技术实现要素：二代测序技术(ngs)以其通量高、成本低、可检测突变范围广的特点，已经发展为重要的临床基因分析技术，而结合目标区域捕获技术(targetregioncapturetechnology)可进一步富集目标区段，提高检测效率降低成本，但目前没有一种产品或技术可以组合性检测所有脑血管病致病基因。本发明通过前期文献检索，自主科研结果确定了12个与遗传性脑小血管病相关的基因，并通过杂交探针原理合成捕获探针，对目标基因一次性在二代测序平台进行测序，结合自建专病数据库对测序数据进行解读，确定患者的致病基因和突变。本方法对12个基因全部外显子区的1x覆盖率达100％，可检测12个基因编码区的所有已知致病snp位点和未知snp位点。前期通过对100个临床上疑似脑小血管病的患者样本采用本方法进行检测，检出率达39％，其中未被报道过的致病snp有50％，使用此方法可以不断完善新的snp位点，并简化新的待检测样本的解读流程。通过对omim以及相关文献的查找，确定心脑血管相关致病基因组合，该组合包括12个基因，根据人类基因组hg19，选取上述12个基因的外显子序列以及侧翼±30bp区域设计探针组合，本组合中探针对目标区域覆盖度达99％。该探针可富集12个基因的外显子区及两侧序列，富集的dna在二代测序平台上进行高深度测序。根据每个变异的变异类型，正常人群频率，疾病数据库频率，所关联疾病，遗传模式，所处位点保守性进行致病性判断，如果正常人群频率大于0.05，则认为该突变为良性不致病突变；如正常人群频率小于0.01，且在疾病数据库中被报道过，则认为该突变为已知致病突变；如正常人群频率小于0.01，且是移码，无义，剪切突变，或已知的可破坏蛋白功能的突变类型，则认为是疑似致病突变；如正常人群频率大于0.01，位点不保守，则判断为疑似良性突变；其余不满足上述条件的均判断为临床意义不明。上述突变如果符合遗传模式，且临床症状与受检人相符，则认定其为受检人的致病突变。具体流程参见图1。本发明提供了一种探针组，其特征在于，所述探针组中的探针能够特异性的识别如下基因：notch3，col4a1，col4a2，htra1，prnp，cst3，gla，trex1，ttr，app，itm2b，gsn。优选的，本发明提供的探针组包含seqidno：1-11所示的序列。进一步的，本发明提供的探针组包含seqidno：12-13所示的序列。进一步的，本发明提供的探针组包含seqidno：14所示的序列。进一步的，本发明提供的探针组包含seqidno：15所示的序列。进一步的，本发明提供的探针组包含seqidno：16所示的序列。进一步的，本发明提供的探针组包含seqidno：43所示的序列。进一步的，本发明提供的探针组包含seqidno：44所示的序列。进一步的，本发明提供的探针组包含seqidno：45所示的序列。进一步的，本发明提供的探针组包含seqidno：46所示的序列。进一步的，本发明提供的探针组包含seqidno：47所示的序列。进一步的，本发明提供的探针组包含seqidno：48所示的序列。进一步的，本发明提供的探针组包含seqidno：49所示的序列。本发明提供一种引物组，所述引物组用于扩增前述探针组。优选的，本发明提供的引物组包括seqidno：17-42和50-63所示的序列。本发明提供一种用于检测脑小血管病的试剂盒，所述试剂盒包括前述探针组和/或引物组。本发明进一步请求保护前述探针组和/或引物组的用途，所述用途为用于制备检测脑小血管疾病的试剂盒。本发明进一步公开了相关基因与脑小血管病相关的snp位点。所述snp位点可以采用上述探针组杂交或引物组扩增获得。具体的，seqidno：1所示的序列用于鉴定notch3基因的snp位点为：notch3：5764g＞t，对应的扩增引物为seqidno：17-18。seqidno：2所示的序列用于鉴定notch3基因的snp位点为：notch3：4654c＞t，对应的扩增引物为seqidno：19-20。seqidno：3所示的序列用于鉴定notch3基因的snp位点为：notch3：3091c＞t，对应的扩增引物为seqidno：21-22。seqidno：4所示的序列用于鉴定notch3基因的snp位点为：notch3：2901-2915＞del，对应的扩增引物为seqidno：23-24。seqidno：5所示的序列用于鉴定notch3基因的snp位点为：notch3：2129a＞g，对应的扩增引物为seqidno：25-26。seqidno：6所示的序列用于鉴定notch3基因的snp位点为：notch3：1759c＞t1630c＞t，对应的扩增引物为seqidno：27-28。seqidno：7所示的序列用于鉴定notch3基因的snp位点为：notch3：1630c＞t，对应的扩增引物为seqidno：27-28。seqidno：8所示的序列用于鉴定notch3基因的snp位点为：notch3：1279c＞t，对应的扩增引物为seqidno：29-30。seqidno：9所示的序列用于鉴定notch3基因的snp位点为：notch3：566a＞g，对应的扩增引物为seqidno：31-32。seqidno：10所示的序列用于鉴定notch3基因的snp位点为：notch3：328c＞t，对应的扩增引物为seqidno：33-34。seqidno：11所示的序列用于鉴定notch3基因的snp位点为：notch3：160c＞t，对应的扩增引物为seqidno：33-34。seqidno：12所示的序列用于鉴定col4a1基因的snp位点为：col4a1：4666a＞g，对应的扩增引物为seqidno：35-36。seqidno：13所示的序列用于鉴定col4a1基因的snp位点为：col4a1：3212t＞c，对应的扩增引物为seqidno：37-38。seqidno：14所示的序列用于鉴定col4a2基因的snp位点为：col4a2：5054a＞g，对应的扩增引物为seqidno：39-40。seqidno：15所示的序列用于鉴定htra1基因的snp位点为：htra1：59c＞t，对应的扩增引物为seqidno：33-34。seqidno：16所示的序列用于鉴定prnp基因的snp位点为：prnp：538g＞a，对应的扩增引物为seqidno：41-42。seqidno：43所示的序列用于鉴定cst3基因的snp位点为：cst3：73g＞a，对应的扩增引物为seqidno：50-51。seqidno：44所示的序列用于鉴定gla基因的snp位点为：gla：911g＞c，对应的扩增引物为seqidno：52-53。seqidno：45所示的序列用于鉴定trex1基因的snp位点为：trex1：38c＞a，对应的扩增引物为seqidno：54-55。seqidno：46所示的序列用于鉴定ttr基因的snp位点为：ttr：157t＞a，对应的扩增引物为seqidno：56-57。seqidno：47所示的序列用于鉴定app基因的snp位点为：app：2149g＞a，对应的扩增引物为seqidno：58-59。seqidno：48所示的序列用于鉴定itm2b基因的snp位点为：itm2b：782a＞c，对应的扩增引物为seqidno：60-61。seqidno：49所示的序列用于鉴定gsn基因的snp位点为：gsn：640g＞a，对应的扩增引物为seqidno：62-63。附图说明图1多态性分析流程图图2突变位点分析流程图图3致病snp位点分析示意图具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1样本dna的制备用磁珠法提取标本dna，大片段dna进行超声打断，目前使用样品打断方法为covaris打断法，将样本放入超声打断仪中打断，打断程序为50％强度，超声3s停1s，共35min。样本需放于打断仪转盘外圈。每次打断样本采用10％凝胶电泳验证。片段大小集中在150-200bp为合格。将打断完成样本置于4℃冰箱保存。若打断效果不理想则需要进行重新打断。实施例2样本中snp位点的测定1文库制备1.1末端修复1.1.1将片段化的dna样本35μl加入0.2ml的pcr管中，按下表配制将dna修复液加入上诉pcr管中，注意枪头中不要有试剂残留，每次加完试剂后更换枪头，避免污染。所有操作必须在冰站上进行。1.1.2盖上管盖，轻微漩涡震荡，轻微离心。将样本放入pcr仪，运行dna修复程序，关闭热盖温度、20℃30min。反应结束后将样本从pcr仪中拿出。1.1.3将ampure磁珠充分颠倒混匀，向上述反应液中加入80μl磁珠，上下吹打混匀。1.1.4将pcr管放入恒温孵化仪中37℃静置2min(不需盖管盖)。将pcr管放入磁力架，室温静置，至磁珠全部吸附至磁力架侧壁。1.1.5小心将管中弃液吸出(此步弃液量大概为100μl)，注意不要将磁珠吸出。1.1.6不要将pcr管从磁力架上拿下，向管内加入200μl80％乙醇，不要混匀，静置30s。将管内液体全部吸出弃去。1.1.7再次加入200μl80％乙醇，静置30s，将管内液体弃尽，确定没有残留。1.1.8将pcr管放入恒温孵化仪37℃、静置5min，蒸干乙醇(固定时间)。1.1.9用15μlddh2o将管壁上干燥的磁珠重新混悬，注意更换枪头，洗脱后直接将pcr管放入pcr冰站。1.23’末端加“a”(a-tailing)1.2.1将下表试剂加入上述pcr管中，每管加入10μl。注意枪头中不要有试剂残留，每次加完试剂后更换枪头，避免污染。1.2.2盖上管盖，轻微漩涡震荡，轻微离心。将样本放入pcr仪，运行加a程序，37℃热盖，30℃30min。反应结束后将样本从pcr仪中拿出。1.2.3每管加入45μlpeg/naclsprisolution，上下吹打将磁珠重新混悬。室温静置3min，放入磁力架。1.2.4小心将管中弃液吸出(此步弃液量大概为55μl)，注意不要将磁珠吸出。1.2.5不要将pcr管从磁力架上拿下，向管内加入200μl80％乙醇，不要混匀，静置30s。将管内液体全部吸出弃去。1.2.6再次加入200μl80％乙醇，静置30s，将管内液体弃尽，确定没有残留。1.2.7将pcr管放入恒温孵化仪37℃、静置5min，蒸干乙醇(固定时间)。1.2.8用15μlddh2o将管壁上干燥的磁珠重新混悬，注意更换枪头，洗脱后直接将pcr管放入pcr冰站。1.3接头连接1.3.1将下表试剂加入上述pcr管中，每管加入10μl。注意枪头中不要有溶液残留，每次加完更换枪头。1.3.2盖上管盖，轻微漩涡震荡，轻微离心。将样本放入pcr仪，运行adapter连接程序，关闭热盖，20℃20min。反应结束后将样本从pcr仪中拿出。备注：为避免温度对酶的影响，可在样本离心时运行程序，待温度降至20℃后将样本放入pcr仪。1.3.3每孔加入45μlpeg/naclsprisolution，上下吹打将磁珠重新混悬。室温静置3min，放入磁力架。1.3.4小心将管中弃液吸出(此步弃液量大概为55μl)，注意不要将磁珠吸出。1.3.5不要将pcr管从磁力架上拿下，向管内加入200μl80％乙醇，不要混匀，静置30s。将管内液体全部吸出弃去。1.3.6再次加入200μl80％乙醇，静置30s，将管内液体弃尽，确定没有残留。1.3.7将pcr管放入恒温孵化仪37℃、静置5min，蒸干乙醇(固定时间)。1.3.8用25μlddh2o将干燥的磁珠重新混悬，室温静置2min，放入磁力架。1.4pcr反应1.4.1向已标记好的新pcr管中加入2μl对应barcode(即indexprimer)，向同一管内加入10μl上一步纯化好的adapter连接产物，并将pcr管转移至冰站。将下表试剂加入上述pcr管中，每管加入13μl。注意枪头中不要有残留。1.4.2盖紧管盖，轻微离心，将样本放入pcr仪，运行如下表格的barcodepcr程序。1.4.3反应完成后，每孔加入45μlampure磁珠，上下吹打混匀。室温静置3min，放入磁力架。1.4.4小心将管中弃液吸出(此步弃液量大概为55μl)，注意不要将磁珠吸出。1.4.5不要将pcr管从磁力架上拿下，向管内加入200μl80％乙醇，不要混匀，静置30s。将管内液体全部吸出弃去。1.4.6再次加入200μl80％乙醇，静置30s，将管内液体弃尽，确定没有残留。1.4.7将pcr管放入恒温孵化仪37℃、静置5min，蒸干乙醇(固定时间)。1.4.8用35μlddh2o将干燥的磁珠重新混悬，室温静置2min，放入磁力架。1.4.9用单枪吸取32μl洗脱液加入对应编号的1.5mlep管中(提前准备并贴好管壁标签)。2文库定量2.1准备500μlep管，在管盖上标记对应编号，每管中加入199μl配制好的缓冲液。2.2取1μl样本加入对应ep管中。注意更换枪头。充分漩涡震荡混匀。2.3另取两个新的500μlep管(madeinusa)，标记为“#1”“#2”，加入190μl配制好的缓冲液，并加入10μl对应qubitmarker。充分漩涡震荡混匀。2.4打开qubit仪器，在dsdna选项下选择highsensitive，按提示先后放入#1#2进行标准曲线校准。2.5选择加液量1μl，放入上述已经混匀的待测的样品，测定文库浓度。3文库混合和接头封闭3.1将文库按照捕获顺序，每一个捕获为一组，按顺序置于ep管架上。3.2准备与捕获数量相同的block混合液。每1μg文库加入45μlblock混合液，管盖标记捕获号后两位。备注：当捕获杂交数＞＝4时，混入文库总量位2μg，当杂交数＜4时混入文库总量为1μg。文库混样量计算方法为：文库体积＝文库总量＊(单个项目数据量/该捕获内总数据量)/文库浓度。3.3将文库加入对应编号的混合液内。混好后轻微离心，放入真空干燥器中干燥。3.3.1先将真空干燥仪电源及加热键打开，使仪器预热至50℃，将混好的文库开盖放入(注意平衡)，盖上玻璃盖，关闭空气阀，打开离心键，确认仪器玻璃盖已盖严，开启真空泵，确认真空泵运转正常。注意：真空泵开启前必须确认空气阀为关闭状态(与出气口方向垂直)。3.3.2干燥结束后，先将真空泵关闭，再将空气阀打开，关闭离心，打开玻璃盖，将样本取出，关闭加热及电源键。待仪器冷却后盖上玻璃盖。注意：将干燥的样本从真空干燥器中小心取出，注意不要污染或损失样本，取出后立刻将管盖盖紧。3.4按下配制杂交buffer，用13μl上述杂交buffer反复冲洗离心管底部及壁上，使干燥的样本重新溶于溶液中。将洗脱液转移到pcr管内。盖紧管盖，标记为b管。4探针杂交4.1以下全部操作均需在-10℃以下冰站上进行。将放置探针的盒子从冰箱中拿出，直接在冰箱中操作，防止探针降解。4.2将探针轻微离心，确定探针聚集于管底，马上重新放回冰站。4.3取新的pcr管放于同一冰站上预冷。4.4按每个探针稀释后7μl的总量加入depch2o(如探针用量为2μl则depch2o用量为5μl)，用枪头轻微混匀，将稀释好的探针移入对应的新的pcr管中。加完后即刻盖上管盖，标记为c管。4.5将b管放入pcr仪中。运行如下程序，热盖105℃。温度时间95℃5min65℃forever4.6程序跳转至65℃2min后，更换程序为65℃forever，热盖75℃。等热盖降致75℃后，放入c管。4.7c管65℃预热2min。将pcr仪打开，用10μl枪，将对应编号的b管加入c管，然后迅速将c管管盖盖好，防止蒸发。此步操作需快速进行。将b管从pcr仪中去除，将pcr仪盖紧。杂交保温至少20h。5洗脱5.1磁珠准备5.1.1按照每个捕获50μl链霉亲和素磁珠(dynabeads)。将磁珠加入2mlep管中，放入磁力架，待磁珠全部吸附至侧壁，弃尽管中液体。5.1.2用1mlbindingbuffer重悬磁珠，再将ep管放入磁力架。待磁珠全部吸附至侧壁，弃去清液。重复两次，共三次。5.1.3按每个捕获200μl的量，用bindingbuffer再次重悬磁珠。不要放上磁力架。5.1.4将磁珠按每个捕获200μl的量分装入pcr管。5.1.5将磁珠放入pcr仪，65℃预热5min。5.2磁珠结合5.2.1将恒温混匀仪预热至65℃。5.2.2将磁珠加入杂交c管中(不要离开pcr仪)，加完后及时将管盖盖紧。5.2.3将pcr管放入预热至65℃的恒温混匀仪45min，每10min.取出颠倒混匀，防止磁珠沉底。(在此期间准备washbuffer)。5.2.4计时结束后将pcr管放入磁力架，待磁珠吸附至侧壁，弃尽上清。5.3washbuffer稀释5.3.1按下表准备washbuffer将washbuffer1(100μl)和stringentwashbuffer放入pcr仪中65℃预热。5.3.2用预热的washbuffer1(100μl)将磁珠重悬，放入磁力架，弃尽上清。5.3.3用预热的stringentwashbuffer重悬磁珠，盖上管盖，放入65℃恒温混匀仪5min，磁力架结合，弃尽上清。5.3.4重复5.3.3步骤。5.3.5加入washbuffer1(200μl)，漩涡震荡2min，磁力架结合，弃尽上清。5.3.6加入washbuffer2，漩涡震荡1min，磁力架结合，弃尽上清。5.3.7加入washbuffer3，漩涡震荡30s，磁力架结合，弃尽上清6捕获后pcr及纯化洗脱6.1pcr用40μlddh2o重悬磁珠，并将其中20μl移入新的pcr管。剩余20μl磁珠留样保存。以下操作需在冰站上进行。将下表试剂加入上述pcr管中，盖紧管盖，混匀后轻微离心(不要将磁珠离心到管底)。6.2运行如下pcr程序6.3按每管80μl的量加入ampure磁珠(非捕获磁珠)，用移液器混匀，室温静置3min。6.4将pcr管放入磁力架，室温静置，至磁珠全部吸附至侧壁。6.5小心将管中上清液吸出弃去(此步弃液量大概为100μl)，注意不要将磁珠吸出。6.6不要将pcr管从磁力架上拿下，向管内加入200μl80％乙醇，不要混匀，静置30s。将管内液体全部吸出弃去。6.7再次加入200μl80％乙醇，静置30s，将管内液体弃尽，确定没有残留。6.8将pcr管放入37℃恒温孵化仪静置5min，蒸干乙醇(固定时间)。6.9用35μlddh2o将干燥的磁珠重新混悬，室温静置2min，放入磁力架。6.10用单枪吸取32μl洗脱液加入对应编号的0.5mlep管中。6.11取1μl进行qubit定量，记录下文库浓度，对文库质量进行caliper/2100和qpcr检测。7上机测序：本实验采用高通量测序平台边合成边测序的方法，对上述制备合格的文库进行上机测序。8信息分析：测序仪获取原始短序列；去除测序数据中的接头和低质量数据；短序列定位到人类基因组数据相应的位置上；统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；过滤低质量值和低覆盖度的单核苷酸；注释，确定突变位点发生的基因、坐标、氨基酸改变等生成突变数据列表流程如图2。9结果分析：共100个样本，检出致病snp位点23个，检出率39％。检测结果：突变分类方法：按图3所示流程将突变分为已知致病突变，疑似致病突变，临床意义不明，疑似良性，良性。对于判别为已知致病突变和疑似致病突变的snp，进行遗传模式的分析，常染色体隐性遗传模式杂合子即可致病，常染色体隐性遗传模式疾病必须纯合子或复合杂合子才满足致病关系。实施例3测试样本：100个临床影像学符合脑小血管病患者，年龄最小12岁，最大86岁样本dna的提取方法同实施例1。使用seqidno：16-41和49-62所示的引物序列对提取的dna进行扩增，对扩增结果测序后，按照实施例2表格中的结果判断方法对扩增的结果进行判定。整体检出情况：100例疑似脑小血管病患者，39例检出已知或疑似致病突变，检出率39％，远高于文献报道的检出率1％-7％(1，2，3)。参考文献1.hassana，markushs.geneticsandischaemicstroke.brain.2000；123(pt9)：1784-1812.doi：10.1093/brain/123.9.1784.2.ballabioe，bersanoa，bresolinn，candelisel.monogenicvesseldiseasesrelatedtoischemicstroke：aclinicalapproach.jcerebbloodflowmetab.2007；27：1649-1662.doi：10.1038/sj.jcbfm.9600520.3.bersanoa1，markushs1，quaglinis1，arbustinieetal.clinicalpregeneticscreeningforstrokemonogenicdiseases：resμltsfromlombardiagensregistry.stroke.2016jμl；47(7)：1702-9.doi：10.1161以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12