本发明涉及转基因植物，具体地说，涉及一种删除转基因大豆筛选标记的方法。
背景技术：
大豆原产中国，是世界上重要油料作物之一。大豆是最早开展转基因研究的作物之一。据报道通过转基因技术已成功转入了抗旱、抗除草剂、抗病虫、耐盐碱等基因，为培育具有优良性状的转基因大豆新品种提供了基础。但由于转基因植物的安全性等问题限制了转基因大豆的推广应用。
目前，转基因技术可能存在的潜在安全风险问题受到公众的广泛关注，而转基因技术中标记基因的安全性问题已成为当今基因工程研究的热点。选择标记基因是目前阻碍转基因植物发展的因素之一。选择标记基因编码一种正常植物细胞不存在的酶，能在转化体中有效表达并易于检测或定量分析。其功能是在某种选择压力下，将转化体筛选出来。常用的选择标记基因包括抗生素基因和除草剂基因。抗生素基因主要包括nptⅱ、cat、spt等；除草剂抗性基因有抗草丁膦和双丙膦的bar和pat及抗草甘膦的epsps基因等。这些选择标记基因虽然方便、廉价，但是，当获得转基因植株后，筛选标记基因就失去价值，其继续表达的产物也会带来安全隐患，从而引起人们转基因植物安全问题的担忧，极大地阻碍了转基因作物商业化的发展。国内外大量的学者认为删除选择标记基因是必要的。综合以上情况，消除选择标记，培育无选择标记的转基因植物，对推动转基因作物的商业化发展意义重大。当前用于剔除筛选标记基因的方法有共转化法(co-transformation)、位点特异性重组法(site-specificrecombination)、转座子法(transposon)、染色体同源重组法(intra-chromosomalrecombination)。例如张秀春(2006)利用双t-dna载体、叶兴国(2007)利用三t-dna载体转化方法获得无筛选标记转基因大豆，标记基因删除效率分别为5.6％和7.6％。
目前位点特异性重组是删除选择标记基因的一种有效途径，已经广泛应用于不同植物的转基因体系中。其中来自噬菌体p1的cre/loxp系统在所有位点特异性重组系统中应用的最广、最完善、具有较高可控性的转化系统。其原理如下：cre/loxp位点特异性重组系统中的cre重组酶专一性地识别由34个碱基对组成的特异序列(loxp位点)，使2个loxp位点片段发生重组，2个loxp位点之间的基因或dna序列从而被剔除。李茂福等(2016)构建载体的cre受热激启动子调控，对转基因植株进行37℃热激处理3d获得无选择标记转基因苹果植株(李茂福等，loxp系统的构建及无选择标记转基因苹果植株的获得[j].园艺学报，2016，(02):205-217.)。zuo等(2000)构建了一种化学诱导与特异性位点重组相结合的高效dna切除载体px6-gfp，在px6-gfp载体中，cre基因的表达受“雌激素受体反式激活因子”xve的严格控制，而xve受β-雌二醇诱导。px6-gfp将“loxp-xve-nptii(标记基因)-cre-loxp”三个串联的转录单元位构建于2个loxp位点之间。因此，当用β-雌二醇诱导xve表达后，cre被xve激活，loxp序列之间的3个转录单元被剔除。zuo等在转基因操作的拟南芥芽诱导的培养基中添加β-雌二醇(2μmol/l)，诱导cre酶表达，删除了标记基因(zuoj，niuqw，mollersg，etal.chemical-regulated，site-specificdnaexcisionintransgenicplants.[j].naturebiotechnology，2001，19(2):157-161.)。
众多转基因研究工作者在此载体基础上加以改造，在px6-gfp载体上插入目的基因转化植物，利用px6-gfp的删除原理获得无筛选标记的转基因植物。赵艳(2011)等利用cre/loxp系统删除水稻，在抗性愈伤组织培养的预分化前、预分化和分化阶段添加雌激素est(5μmol/l)诱导表达重组酶cre均能成功切除标记基因序列，标记基因剪切成功率为6.82％～46.64％。马连杰等(2011)对获得的含抗性标记基因的马铃薯植株茎段进行再次的组织培养，经过愈伤诱导和芽分化阶段添加3μmol/l(β-雌二醇)删除诱导剂，获得无筛选标记的马铃薯，标记基因删除成功率为8.8％。在公开的cre/loxp系统删除的技术中，薛静等发明的“删除转基因植物中抗生素标记基因的系统及其应用”(cn102337292a)利用分别含有loxp位点和cre的两个载体获得的转基因植株进行杂交，在后代中获得删除抗生素标记基因的植株。贾桂霞发明的：“一种删除选择标记基因的百合转基因方法”(cn102559741a)，将转基因的百合小鳞茎转入分化培养基，通过4℃低温诱导12h将标记基因删除。诸葛强等发明的“一种删除转基因杨树选择标记基因的方法”(cn102181476a)利用培养基中添加β-雌二醇，诱导转基因植株茎段形成愈伤至植株再生过程删除选择标记基因。以上技术均是在转基因组培苗再生阶段进行β-雌二醇诱导。
目前应用cre/loxp系统进行大豆筛选标记删除技术的报道有：芦晓晶(2007)利用cre/loxp系统删除大豆转基因苗中的筛选标记基因，具体方法是当大豆转化不定芽伸长到约1厘米左右时转移到含β-雌二醇(5μmol/l)的诱导培养基上，培养半个月后检测到选择性标记被剔除的转化芽，但是β—雌二醇对转化芽有抑制作用，幼苗长势皆不佳，而且都具白化趋势，最终未获得成熟大豆转化植株。
综上所述，每种植物乃至不同器官对“px6-基因”的删除系统中的删除剂β-雌二醇的敏感性不同。尤其是大豆本身遗传转化效率就低，在转基因操作的芽诱导的培养基添加β-雌二醇来删除标记基因(芦晓晶，无选择标记植物表达载体的构建及转基因大豆的获得[d].东北师范大学，2007)，使大豆转化不定芽受到删除剂的严重抑制，生长缓慢，获得的幼苗弱，甚至不能获得有效大豆转化植株及后代。
由此可见，删除剂的使用浓度、处理时间和操作方式是影响获得无筛选标记转基因大豆的三个关键因素。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种删除转基因大豆筛选标记的方法，通过优化筛选剂的使用浓度、处理时间以及对转基因大豆的处理方式提高删除转基因大豆筛选标记的有效率和转基因大豆的成活率。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
一种删除转基因大豆筛选标记的方法，将含有筛选标记的转基因大豆种子(利用含cre/loxp位点特异性重组系统载体“px6-目的基因载体”获得的转基因大豆种子)在含有β-雌二醇的育苗基质中播种培养，记为0d，在大豆种子萌发出苗阶段和大豆幼苗生长期间进行β-雌二醇处理诱导，待幼苗生长至21～42d时，筛选能够表达目的基因、且无筛选标记的转基因大豆植株，正常管理直到结荚成熟，收获无筛选标记的转基因大豆种子。
所述标记基因通过含cre/loxp位点特异性重组系统载体，伴随目的基因一同转入大豆中，所述标记基因位于两个loxp位点之间。
所述标记基因包括但不限于新霉素磷酸转移酶ⅱ基因(nptⅱ)、潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草丁膦n－乙酰转移酶基因(bar)等。
进一步地，在大豆种子萌发出苗阶段浇一定浓度的删除诱导剂β-雌二醇水溶液，在大豆幼苗生长期间直接浇灌一定浓度的删除诱导剂β-雌二醇霍格兰氏全营养液。
进一步地，所述方法具体包括如下步骤：
(1)、将育苗基质混拌均匀，装入营养钵中，浇入含有6～14μmol/lβ-雌二醇的水溶液。
所述育苗基质为本领域常规使用的材料，例如从市场购买的蔬菜、花卉育苗基质。
所述营养钵为本领域常规使用的培养装置，例如选择规格为15×15×20cm的营养钵。
(2)、在(1)所述的营养钵中，播种转基因大豆种子(利用含cre/loxp位点特异性重组系统载体“px6-目的基因载体”获得的转基因大豆种子)，覆盖育苗基质1cm，然后覆盖一层塑料薄膜，按照常规的光照和温度条件培养。期间根据育苗基质的干湿情况补浇含有6～14μmol/lβ-雌二醇的水溶液。待其子叶出土并展开后揭开覆盖的薄膜。
作为优选，每钵播种一粒转基因大豆种子。
(3)、上述(2)中揭开所覆盖薄膜以后的幼苗，根据育苗基质的干湿程度浇灌含有6～14μmol/lβ-雌二醇的霍格兰氏全营养液，以保证大豆苗正常生长所需要的水分和营养。其余按照常规的光照和温度条件培养。如此管理直到大豆幼苗生长至21～42d。
所述霍格兰氏全营养液为本领域常规使用的试剂，也称作hoagland营养液或霍格兰德营养液，例如，根据霍格兰氏配方配制，或者从一般的化学试剂公司购买。
(4)、将上述(3)中的大豆幼苗去掉育苗钵，连同育苗基质一起移栽定植到土壤，或者转移到装有土壤的大培养容器中。
(5)、将(4)中移栽的大豆植株用pcr方法对目的基因及标记基因扩增，检测标记基因的删除情况。
(6)、保留含目的基因而标记基因被剔除了的转基因植株，正常管理直到结荚成熟，收获无筛选标记的转基因大豆种子。
进一步地，对于前述β-雌二醇的水溶液和含有β-雌二醇的霍格兰氏全营养液，本发明优选所含β-雌二醇的浓度为8～12μmol/l，更优选为10μmol/l。
进一步地，使用β-雌二醇处理转基因大豆的天数优选为28～42天，更优选为35天。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种删除转基因大豆筛选标记的新方法，克服了传统组培方法需要无菌操作，且不定芽受到删除剂的严重抑制，无法获得有效大豆转化植株及后代的缺点。
本发明直接将删除剂添加在日常浇灌的水和营养液中，通过直接浇灌的方法，处理包含筛选标记基因的大豆幼苗，达到删除标记基因的目的。所述方法可以显著提高转基因大豆标记基因的删除率，删除率可达到50％以上。且所述方法操作简单，应用常规大豆营养钵育苗的方法育苗，只需进行正常的育苗操作和日常管理，免去了技术复杂的组培的无菌操作，培养的大豆幼苗生长健壮，有效提高了转基因大豆的成活率，成活率达到97％以上，大豆生长发育良好，结实率高，可以获得大量的无标记基因的转基因大豆，对推动转基大豆因商业化有重要的理论及实践意义。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本发明提供的这种转基因大豆删除的方法，具体包括以下几个步骤：
选取包含标记基因的转基因大豆种子播种于含有β-雌二醇水溶液的育苗基质中，覆膜；出苗后揭膜；根据基质的干湿情况继续用β-雌二醇处理，适时浇灌霍格兰氏全营养液；去掉育苗钵，连同育苗基质一起移栽定植到土壤或转移到大的培养容器中；利用pcr技术检测标记删除情况；保留相应标记删除了的植株，直至生长成熟收获种子。
实施例2
本发明提供的这种转基因大豆删除的方法，具体包括以下几个步骤：
(1)、将育苗基质混拌均匀，装入15×15×20cm营养钵中，浇入含有10μmol/lβ-雌二醇的水溶液。
(2)、在(1)所述的营养钵中，每钵中播种一粒转基因大豆种子(转入cre/loxp位点特异性重组系统载体，如px6-目的基因载体的大豆种子)，然后覆盖一层塑料薄膜，按照常规的光照和温度条件培养。期间根据育苗基质的干湿情况补浇含有10μmol/lβ-雌二醇的水溶液。待其子叶出土展开后揭开覆盖的薄膜。
(3)、上述(2)中揭开所覆盖薄膜以后的幼苗，根据育苗基质的干湿程度浇灌含有10μmol/lβ-雌二醇的霍格兰氏全营养液，以保证大豆苗正常生长所需要的水分和营养。其余按照常规的光和照温度条件培养。如此管理直到大豆幼苗生长至35d。
(4)、将上述(3)中的大豆幼苗去掉育苗钵，连同育苗基质一起移栽定植到土壤，或者转移到大的、装有土壤的培养容器中。
(5)、将上述(4)中移栽的植株用pcr方法对目的基因及标记基因扩增，检测标记基因的删除情况。
(6)、保留含有目的基因而标记基因被剔除了的转基因植株，正常管理直到结荚成熟，收获无筛选标记的转基因大豆种子。
说明：针对上述实施例给出步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中的β-雌二醇，对其浇灌的β-雌二醇的浓度还可进行相应的调整，如选取β-雌二醇的浓度为6μmol/l、8μmol/l、12μmol/l、或14μmol/l，其方法均按照上述方案，获得无筛选标记的转基因大豆种子。
实施例3
转基因大豆育苗步骤按实施例2中步骤(1)、(2)所述方法进行；
按实施例2中步骤(3)进行幼苗生长期间的管理，如此管理直到大豆幼苗生长至35d。
按随后的操作步骤均同实施例2中(4)、(5)、(6)相关步骤。
说明：针对大豆幼苗生长天数还开进行相应的调整，如(21天、25天、28天、42天)，其方法均按照实施例2的方案，获得无筛选标记的转基因大豆种子。
试验例1
本试验例用于说明本发明中不同β-雌二醇浓度对大豆幼苗生长和标记基因删除效果的影响。
β-雌二醇是标记基因删除的诱导剂，高浓度有利于标记基因的删除，但是同时对大豆生长具有抑制作用，浓度越高抑制作用越大，致使大豆生长发育不正常。本试验以施用单一的β-雌二醇，测定不同浓度的β-雌二醇对大豆幼苗生长的影响以及对标记基因删除效果的影响。本试验中见实施例2方法，在营养钵中浇灌的β-雌二醇浓度当不超过0～8μmol/l时，大豆的幼苗均能正常成活，成活率为100％；当β-雌二醇浓度达到10μmol/l时，大豆幼苗受到轻微的抑制，根系和株高下降不显著，当β-雌二醇浓度高于12μmol/l时，大豆幼苗生长受到明显的抑制，其存活率显著下降，从而影响了标记基因删除率。综合上述分析，在应用营养钵育苗方法进行转基因大豆标记基因删除时，β-雌二醇适宜浓度为10μmol/l，此浓度既能保证大豆正常生长发育及生存率，又能最大限度的发挥β-雌二醇的诱导删除作用。
表1不同浓度的β-雌二醇大豆幼苗生长的影响
注：正常成苗率＝成活幼苗/播种数×100；变化幅度(％)＝(测定数值－对照值)/对照值×100，正值为增幅，负值为降幅。
表2不同β-雌二醇浓度对大豆标记基因删除的影响
删除率＝删除的株数/播种数×100
试验例2
本试验例用于说明本发明中β-雌二醇处理天数对标记基因删除效果的影响。
本发明提供的转基因大豆标记基因的删除方法，使用试验例1所确定适宜的β-雌二醇浓度10μmol/l，进行β-雌二醇的处理天数对标记基因删除率的影响试验，删除天数在21～42d范围内，删除率达到12.4-53.2％。β-雌二醇的处理天数与删除率有关，处理天数越长，删除率越高，但是随着大豆苗在营养育苗钵内处理时间延长，对幼苗的生长产生不利影响，直至移栽后的大豆不能正常生长发育。本试验中42天处理由于豆苗细弱，严重影响种子产量。因此以35d为最优的β-雌二醇处理天数，成功的获得了大量的无筛选标记基因转基因大豆种子(表3)。
表3β-雌二醇处理天数对标记基因删除的影响
本发明用先获得包含标记基因的大豆种子为中间材料，在其后代种子萌发时删除标记基因，但是为克服组培方法的操作繁琐与缺点，本发明直接将删除剂添加在日常浇灌的水和营养液中，通过直接浇灌的方法，处理大豆幼苗，达到删除标记基因的目的。本方法操作简单，只需进行正常的育苗操作和日常管理，免去了技术复杂的组培的无菌操作，培养的大豆幼苗生长健壮，移栽成活率高，可以获得大量的无标记基因的转基因大豆，删除率可达到50％以上，删除效果相比已被报道的其他方法具有显著的提高。
综上所述，本发明提供的转基因大豆标记基因的删除方法，通过先行获得包含标记基因的转基因大豆，在其后代种子育苗阶段进行β-雌二醇诱导，达到删除标记基因的目的。这种方法操作简便，删除效率高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。