用于植物基因表达载体构建的质粒载体及其应用的制作方法

本发明涉及植物基因领域，具体涉及一种用于植物基因表达载体构建的质粒载体及其应用。

背景技术：

植物基因工程技术的迅速发展和广泛应用为植物的遗传改良开拓了广阔的前景。该技术克服了植物有性杂交的限制，可将来源于不同物种甚至人工合成的基因导入植物，从而改良植物性状，培育优质高产作物新品种。在植物基因克隆、基因功能分析以及基因转化等分子生物学的研究与应用过程中，需要构建植物基因表达载体。但是，目前常用于植物基因表达载体构建的质粒，如pbin19(bevan，1984)、pbi121(jefferson，1987)、pig121-hm(ohtaetal.，1999)、pmsisgfp(kawasakietal.，1999)等，由于其t-dna领域中限制性内切酶位点有限，目的基因难于插入和连接，而且目的基因在植物体内表达还需要启动子、终止子、筛选标记等功能元件，需要构建多个中间载体，操作比较麻烦。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种用于植物基因表达载体构建的质粒载体pnulpge200及其应用方法。经pcr等方法克隆得到的目的基因可以多种方式很方便地连接到该质粒载体的35s启动子与nos终止子之间的多个克隆酶切位点mcs，使目的基因能够在植物体内稳定表达，该质粒载体还具有独立表达的卡那霉素nptii耐性基因和sgfp绿色荧光蛋白报告基因，能够显著提高转基因植物细胞的选拔效果。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

利用现有的经大肠杆菌(escherichiacoli)质粒puc18(yanisch-perronetal.，1985)改造的pkafcr1和经双核农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)ti(tumerinducing)质粒pbi121改造的pkafcr100两种质粒，在pkafcr1的35s启动子(cauliflowermosaicvirus35spromoter)和nos终止子(nopalinesynthaseterminator)之间，引入多个克隆酶切位点mcs(multiplecloningsite)。然后将包含35s-mcs-nos片段切下连接到pkafcr100，使其成为一个用于构建植物基因表达的质粒载体pnulpge200；目的基因可以多种方式很方便地连接到该质粒载体的35s启动子与nos终止子之间的多个克隆酶切位点mcs。

质粒载体pnulpge200的构建，包括如下步骤：

s1、在pkafcr1质粒(图1)的35s启动子和nos终止子之间引入多克隆酶切位点mcs

s11、利用限制性内切酶xbai和saci，对pkafcr1质粒进行双酶切处理，切除其原有的xbai到saci部分；

s12、将双酶切后的pkafcr1经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过常规的凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒(如qiagenqiaquickgelextractionkit)获得已切除xbai和saci部分的pkafcr1；

s13、人工合成以下两条单链dna：

cr1mcsin-s：

5’-ctagagttaacttaattaacccgggaggcctggtaccctcgaggagct-3’；

cr1mcsin-a：

5’-cctcgagggtaccaggcctcccgggttaattaagttaact-3’；

然后采用温度梯度退火法，使两条单链dna构成一条双链dna双链，该片段含有xbai、hpai、paci、xmai(smai)、stui、kpni、xhoi和saci等多个克隆酶切位点mcs；反应条件为94℃3sec，95℃5min，95℃至25℃温度梯度0.1℃/sec，25℃15min；

s14、利用t4-dna连接酶或质粒连接用试剂盒(如toyoboligationhighkit)将已切除xbai和saci部分的pkafcr1与人工合成dna片段进行连接，连接后的重组质粒利用热激法转化到大肠杆菌dh5α菌株的感受态细胞中；

s15、将转化后的大肠杆菌平涂于含有25mg/l青霉素的lb固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落pcr鉴定，筛选含有mcs重组质粒的阳性菌落；

s16、阳性菌落经25mg/l青霉素的lb液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒(如qiagenqiaprepspinminiprepkit)提取重组质粒dna并进行测序验证，该重组质粒命名为pkafcr1’；

s2、pnulpge200质粒的构建

s21、利用限制性内切酶hindiii和pvuii，对pkafcr1’进行双酶切处理，通过凝胶电泳分离、回收获得包含35s-mcs-nos片段；

s22、利用限制性内切酶hindiii和stui对pkafcr100(图2)进行双酶切处理，通过凝胶电泳分离、回收获得双酶切后的pkafcr100；

s23、利用t4-dna连接酶或质粒连接用试剂盒(如toyoboligationhighkit)将35s-mcs-nos片段与酶切后的pkafcr100进行连接，连接后的重组质粒利用热激法转化到大肠杆菌dh5α菌株的感受态细胞中；

s24、将转化后的大肠杆菌平涂于含有50mg/l卡那霉素的lb培养基培养，挑取单独菌落进行菌落pcr鉴定，筛选含有35s-mcs-nos重组质粒的阳性菌落；

s25、将阳性菌落经50mg/l卡那霉素的lb培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒(如qiagenqiaprepspinminiprepkit)提取重组质粒载体dna，该重组质粒载体命名为pnulpge200(图3)；

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的用于植物基因表达载体构建的质粒载体pnulpge200，因为在35s启动子与nos终止子之间具有多克隆酶切位点mcs，利用pcr等方法克隆得到的目的基因可以很方便地连接到35s启动子与nos终止子之间，使目的基因的上游和下游分别加上启动子和终止子，在植物体内独立表达。目的基因在pcr扩增时，可以通过正反向引物的5’端引入与pnulpge200的mcs相匹配的酶切位点(xbai、hpai、paci、xmai(smai)、stui、kpni、xhoi和saci)，与经同样酶切后的pnulpge200进行连接；也可以利用有些dna聚合酶(如phusion高保真dna聚合酶)，在pcr扩增后能够产生平滑末端产物的特点，直接与经平滑末端酶切(hpai、smai或stui的其中一种)后的pnulpge200进行连接。但单一酶切连接或平滑末端连接后需要进行插入片段的方向判断。

该质粒载体还具有独立表达的卡那霉素nptii耐性基因和sgfp绿色荧光蛋白报告基因，前者可以利用添加有卡那霉素的培养基对转基因植物细胞进行选拔，后者可以利用荧光显微镜对转基因植物细胞进行判断和观察，显著提高转基因植物细胞的选拔效果。克服了目前常用于植物基因表达载体构建的质粒由于酶切位点有限，目的基因片段难于插入和连接，以及缺少在植物体内表达需要的启动子、终止子、筛选标记等功能元件的缺陷。

附图说明

图1为本发明实施例中的pkafcr1质粒示意图。

图2为本发明实施例中的pkafcr100质粒示意图。

图3位本发明实施例中pnulpge200植物基因表达载体示意图。

图4为本发明实施例中目的基因ppxyim+xyia连接至pnulpge200质粒后菌落pcr鉴定；

图中：m：dnamarker；1-3：菌落1-3的ppxyim+xyia基因pcr；4-6：菌落1-3的sgfp基因pcr；7-9：菌落1-3的nptii基因pcr。

图5为本发明实施例中pnulpge0401植物基因表达载体示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明的应用，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了质粒载体pnulpge200的应用方法：

实施例

假单胞菌质粒二甲苯单加氧酶编码基因的克隆与基因表达载体构建：

1.二甲苯单加氧酶基因的合成

根据ncbi等数据库公开的假单胞菌(pseudomonasputida)携带质粒(pwwo)的二甲苯单加氧酶(xyienemonooxygenase)编码基因(ppxyim+xyia，nc003350)序列，全长2312bp。利用optimumgene软件优化密码子后，进行人工合成(金斯瑞生物技术)。基因两端分别加入paci和kpni酶切位点。

2.pnulpge200质粒dna的提取

利用qiagenqiaprepspinminiprepkit试剂盒，从大肠杆菌dh5α中提取pnulpge200质粒dna，具体操作步骤按试剂盒的使用说明。利用narodrop2000测定其浓度。

3.目的基因与pnulpge200质粒的连接

(1)双酶切处理：使用限制性内切酶paci和kpni分别对ppxyim+xyia目的基因以及pnulpge200质粒进行双酶切处理。双酶切处理的反应条件为37℃4h，灭活80℃5min。

(2)目的片段回收：将经双酶切处理后的反应产物进行电泳，检测目的基因以及质粒的酶切效果，然后用qiagenqlaquickgelextractionkit试剂盒对目的片段进行胶回收，具体操作步骤按试剂盒的使用说明。

(3)连接反应：将相同酶切后经胶回收得到的ppxyim+xyia目的基因与pnulpge200进行连接，分别按目的基因片段125fmol、质粒25fmol的比例，经过65℃5min前处理以消除dna形成二级结构后，加入半量体积的toyoboligationhigh连接酶，在16℃12h条件下进行连接反应。

(4)大肠杆菌转化：取适量(＜10μl)已连接好的反应产物，利用热激发转化到大肠杆菌dh5α菌株的感受态细胞中。

(5)菌落pcr鉴定：将质粒转化后的大肠杆菌液(100μl)涂在固体lb抗生素培养基(卡那霉素50mg/l)上培养一晚，挑取单个菌落进行菌落pcr鉴定(图4)，pcr引物如下。将pcr阳性菌落置于液体lb抗生素培养基(卡那霉素50mg/l)培养一晚，再次pcr鉴定后，保存阳性菌液。目的基因ppxyim+xyia成功连接到pnulpge200的质粒命名为pnulpge0401(图5)。

ppxyim-s：5′-gccgttaattaatggatacacttagatac-3′

ppxyia-a：5′-atcggtaccttagcaaggaggtct-3′

4.农杆菌转化与利用

按上述同样方法从大肠杆菌dh5α提取pnulpge0401质粒dna，取适量(＜1μg)质粒dna，利用热激发转化到农杆菌eha105或lba4404等菌株的感受态细胞中，同样进行菌落pcr鉴定，保存阳性菌液；阳性菌液可以用于植物基因转化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。