与玉米耐盐性相关的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及作物分子标记辅助育种技术领域，特别是涉及玉米成熟期耐盐主效qtl以及与其紧密连锁的与玉米耐盐性状相关的snp分子标记及其应用。

背景技术：

玉米是全球重要的粮食、饲料兼经济农作物，也是我国种植面积最广、总产量最高的第一大作物。玉米生产与中国粮食可持续稳定发展密切相关。然而，玉米为盐敏感植物，其可忍受的土壤盐浓度范围为0.3-0.7％。土壤盐害会造成玉米出芽率低、苗弱、枯萎甚至死亡，最终导致减产及品质下降。全球有9.5438亿公顷盐碱地，占世界总陆地面积7％以上及可耕地面积20％以上。中国有9913.3万公顷盐碱地，在世界盐碱地面积排行榜中占第三位(张建峰等，2008，水土保持研究15:74-78)。随着可耕地面积的急剧减少，开发和利用盐害土地十分迫切及必要。目前，耐盐种质资源的利用是解决这一问题的重要手段。

利用传统育种手段进行耐盐玉米种植资源的选育存在选择率低、周期长等问题。分子标记辅助育种是解决这一问题的有效手段。利用分子标记提高玉米耐盐性的前提是获得与耐盐性紧密连锁的实用分子标记。因此，开展田间玉米成熟期耐盐qtl定位及分子标记开发研究，对加速耐盐玉米种植资源的选育，促进我国玉米生产可持续发展具有重要意义。

qtl定位是一种准确的用于检测数量性状如耐盐性的遗传基础的统计方法。前人已对多种农作物的耐盐qtl进行定位研究，以期鉴定耐盐控制因子应用于分子标记辅助育种。前人已对大豆(guan等,2014,thecropjournal2:358-365)、大麦(ahmadi-ochtapeh等,2015,biologiaplantarum59:283-290)等作物的耐盐qtl相关进行定位分析，而且，在qtl定位结果的指导下，进一步成功鉴定到水稻(ren等，2005，naturegenetics37:1141-1146)及小麦(munns等,2012,naturebiotechnology30:360-364)耐盐基因并应用到作物遗传改良中。

相较其它作物，玉米耐盐遗传和分子机制的研究报道相对较少，利用snp标记构建高密度的遗传连锁图谱，结合株高表型数据对田间玉米成熟期耐盐qtl进行定位及分子标记开发极为必要，可以为分子标记辅助育种提供切实有效的耐盐连锁标记。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供与玉米耐盐性状相关的主效qtl。

本发明的第二个目的是提供与玉米耐盐主效qtl紧密连锁的snp分子标记，及扩增该分子标记的特异性引物对。

本发明的第三个目的是提供上述snp分子标记的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

基于以上目的，申请人以240个dh系为材料，利用snp标记构建高密度的遗传连锁图谱，结合株高表型数据，对田间玉米成熟期耐盐qtl进行定位。具体为240份以先玉335(母本：ph6wc,耐盐性；父本：ph4cv,盐敏感)为基础材料经诱导加倍获得的dh系和及其父母本ph6wc和ph4cv在北京市通州区试验基地(盐害地)和昌平区试验基地(正常土壤)连续3年春播种植。每年试验采用随机区组设计，进行两次独立性重复。到玉米材料生理成熟期，用株高测量仪从天穗顶端第一花稃向下量至地平面，计为成熟期株高。

利用精选的几百份代表性玉米品种，根据位点重复、信号强度、缺失率、多态性、均匀分布等原则对美国illumina公司maizesnp50k芯片中的56110个snp位点进行筛选、评估，最终确定3072个核心snp位点定制成snp芯片产品maizesnp3072(美国illumina公司)(tian等,2015,molecularbreeding35:136)。240个dh系的叶片用tiangen公司的植物dna提取试剂盒提取dna，之后根据abi公司的标准实验步骤进行dna的杂交和芯片扫描，使用joinmap4软件的kosambi功能模块构建高密度遗传连锁图谱。

在高密度遗传连锁图谱构建的基础上，结合盐害地株高表型数据，应用windowsqtlcartographer软件，采用复合区间作图法对田间玉米成熟期耐盐主效qtl进行定位和开发紧密连锁的分子标记。得到一个主效qtl，发现与其紧密连锁的分子标记与玉米耐盐性相关。该主效qtl命名为qsph1，位于玉米第1号染色体上，lod为22.4。

进一步地，本发明提供了与玉米耐盐性状相关的snp分子标记，其为pze101094436，该snp的多态性是g/a，由核苷酸序列如seqidno.1-3所示的引物对pcr扩增获得。

本发明提供了上述分子标记在作物分子辅助育种中的应用。

本发明提供了上述分子标记在选育耐盐能力高的作物中的应用。

本发明提供了上述分子标记在筛选耐盐玉米品种中的应用。

本发明提供了上述分子标记在预测玉米耐盐能力中的应用。

本发明提供了用于检测与玉米耐盐性相关的snp分子标记的特异性引物对，由3条引物组成，其核苷酸序列分别如seqidno.1-3。

本发明提供了上述特异性引物对在玉米种质资源改良中的应用。

本发明提供一种鉴定高耐盐能力玉米的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测玉米的基因组dna；

(2)以步骤(1)中提取的dna为模板，利用seqidno.1-3所示的特异性引物对进行pcr扩增反应；

(3)当采用seqidno.2-3所示引物时，若扩增产物第19bp的碱基为g，则待测玉米耐盐能力高，或当采用seqidno.1、3所示引物时扩增产物第20bp的碱基为a，则待测玉米耐盐能力低。

本发明的有益效果在于：首次公开玉米耐盐主效qtl(如图1所示)及与其紧密连锁的snp分子标记，该分子标记可用于玉米耐盐性状的早期预测、筛选，以及用于进行分子辅助育种，以筛选耐盐种质资源。

附图说明

图1利用不同年份及三年平均值的株高数据定位得到的主效qtl其在1号染色体上的位置及lod值。图中sph(2014/2015/2016):(2014/2015/2016)年盐害地株高；sphmean：盐害地株高三年平均值。

图2pze101094436snp标记对13个玉米样品的snp位点基因型分析结果。根据laboratoryofthegovernmentchemist(lgc)公司的标准实验步骤进行kasp法检测snp基因位点，数据用kraken软件分析并导出。左上角：snp位点的碱基为g，右下角：snp位点的碱基为a，左下角：阴性对照。每个样品进行两次重复。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明实施例中所用的240个玉米dh系及其父母本材料等玉米种质资源均来自北京市农林科学院玉米研究中心玉米种质资源库。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1玉米耐盐相关主效qtl定位

1、土壤成分分析

根据5点取样法(zhai等2016,advancejournaloffoodscience&technology11:88-94)，取通州和昌平地内5个代表性位置的土壤进行成分分析。利用残渣烘干法测定全盐浓度(wüst等，2000，journalofarchaeologicalscience27:1161-1172)。采用hach公司的ph计测定土壤ph值。采用perkinelmer公司的火焰发射光谱仪对土壤内na⁺浓度进行测定。在测定0-20cm和20-40cm深度土壤成分后，利用t检验对测定数据进行统计分析。结果发现，在0-20cm和20-40cm深度通州土壤的全盐浓度和na⁺浓度显著性高于昌平对照土壤。而ph值在两个位置土壤中没有显著性差别。表明通州土壤ph值正常，其土壤主要存在盐害。

2、玉米成熟期株高测定

240个玉米dh系及其父母本材料于2014、2015和2016年分别在北京通州盐害地(tz,n39°41′49.70″,e116°40′50.75′)和昌平正常地(cp,n40°10′50.38″,e116°27′15.40″)进行种植。每年试验采用随机区组设计，进行两次独立性重复。对于每个重复，每个dh玉米系种植一排，每排种植20株。每排长5m，排间距为60cm。在玉米成熟期，测定dh系及父母本株高。对测量数据分析发现，dh系母本株高受盐胁迫的抑制程度显著低于dh系父本，盐害地株高，正常地株高的遗传力均较高，分别为74.7％和86.4％；并且发现，盐害地株高与正常地株高的相关性较低，相关系数为0.397。

3、遗传连锁图谱构建和qtl定位

利用精选的几百份代表性玉米品种，根据位点重复、信号强度、缺失率、多态性、均匀分布等原则对maizesnp50k芯片(美国illumina公司产品)中的56110个snp位点进行筛选、评估，最终确定3072个核心snp位点定制成snp芯片产品maizesnp3072。240个dh系的叶片用tiangen公司的植物dna提取试剂盒提取dna，之后根据abi公司的标准实验步骤进行dna的杂交和芯片扫描，使利用joinmap4软件的kosambi功能模块进行遗传连锁图谱的构建。利用1317个在dh系父母本中具有多态性的snp所构建的遗传连锁图谱覆盖玉米基因组10条染色体共1462.05cm距离，snp间的间距大约为1.11cm。

随后根据表型和基因型数据信息，利用复合区间作图法对耐盐qtl进行定位。利用3年盐害地株高作为表型数据，定位到位于1号染色体上的一个主效qtl，命名为qsph1(lod为22.4)，能够解释31.24％的表型变异，其位于pze101094436和pze101150513snp标记之间。

同时，其在3个不同年份下都能定位得到，表明其作用非常稳定，不受环境因素的影响。基于正常地株高定位到的qtl分布在4号，5号，8号和9号染色体，与qsph1这个主效应qtl的位置完全不同，表明qsph1控制玉米耐盐性，而与株高无关。

实施例2与耐盐主效qtl紧密连锁的snp标记开发及应用

通过遗传定位，耐盐主效qtlqsph1位于pze101094436和pze101150513分子标记之间，故而，pze101094436为与其紧密连锁的分子标记。

选取13个实验室鉴定过耐盐性的玉米自交系，其中6个耐盐(京725、ph6wc、京724、91227、a9241、京464)，7个不耐盐(ph4cv、dh382、d9b、d9h、京4055、b547、mc01)(luo等,2017,maydica62:11)，利用pze101094436snp标记及结合kasp技术对以上材料的基因型进行分析，采用本发明设计的3条特异性引物，其核苷酸序列分别如seqidno.1-3所示，kasp法检测snp基因位点根据laboratoryofthegovernmentchemist(lgc)公司的标准实验步骤进行，当采用seqidno.2-3所示引物时，若扩增产物第19bp的碱基为g，则待测玉米耐盐能力高；当采用seqidno.1、3所示引物时扩增产物第20bp的碱基为a，则待测玉米耐盐能力低。

其主要试验步骤如下：(1)用tiangen公司的植物dna提取试剂盒提取dna后，用lgc公司的replikator孔板复制机将dna稀释到50ng/μl，并将每个样品的1.5μldna转移到384板材里(黑色384孔板)。(2)将引物(seqidno.1-3)、kasp2×mastermix、dnase/rnase-freedeionizedwater按一定比例混合，用lgc公司的merodian微量分液器加入384板内。(3)加好混合液的384板用lgc公司的kube热封膜仪封膜。(4)用lgc公司的hydrocycle水浴锅进行目标dna片段扩增，扩增体系为:94℃15min；94℃20s61-55℃1min(每个循环下降0.6℃)共10循环；94℃20s55℃1min26个循环。(5)将扩增好的样品用lgc公司的pherastar^plussnp扫描仪扫板，最后用kraken软件分析数据并导出如图2所示的结果。

结果发现，pze101094436标记可以将耐盐和不耐盐自交系区分开来，耐盐鉴定与snp结果一致。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

sequencelisting

<110>北京市农林科学院

<120>与玉米耐盐性相关的snp分子标记及其应用

<130>khp171113530.2

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ggagccgtggaagtgcgaga20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gagccgtggaagtgcgagg19

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gccaagatgctcgcaagtaccttat25