一种调控中山杉耐水淹特性的Thadh4基因及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控中山杉耐水淹特性的thadh4基因及其应用。

背景技术：

中山杉是江苏省中国科学院植物研究所从落羽杉×墨杉杂交组合中选育出来的优良无性系，具有速生，耐水淹，耐盐碱，抗病虫害等优点。由于其突出的耐水淹能力，近年来已在云南滇池、安徽巢湖和三峡库区等地区的湿地生态系统构建中发挥着重要作用。重庆万州三峡库区消落带的试验表明：经过最长149d基部淹水，最长122d没顶淹水，最大没顶深度达12m，中山杉仍能获得90%的造林保存率，树木年平均胸径和树高生长量分别达1.3cm/a和0.60m/a，因而中山杉可以作为一种研究木本耐水淹特性的优良材料。前期关于植物耐水淹机制研究主要集中在草本模式植物拟南芥以及粮食作物水稻中，中山杉的耐水淹特性研究也主要集中在形态学和生理学方面，无法深入揭示其耐淹机理。因而挖掘出中山杉响应水淹胁迫的关键基因对于探究其耐水淹特性及揭示木本植物耐淹机制均具有重要意义。

植物在水淹胁迫下可诱导糖酵解发生进而适应缺氧环境，整个过程既可以为植物体提供能量又可以减少低氧对植物毒害。因而糖酵解途径相关的基因被广泛分离、鉴定，其中乙醇脱氢酶编码基因adh备受关注。水稻中过量表达adh1虽没有对植株水淹耐受力产生明显影响，但是adh1一旦突变或缺失，植物的厌氧耐受力就大大降低。玉米和拟南芥adh无效突变体以及水稻rda（低活性的adh）突变体内发酵能力显著降低，根细胞胞质ph值迅速下降，突变体明显早于野生型死亡。将水稻的adh1基因转入烟草中，烟草转基因植株耐淹能力显著增强，且adh1酶的活性也随淹水时间增加而升高。中山杉水淹胁迫的转录组测序结果也显示，水淹程度越高，adh基因的rpkm值也会随之升高。综上可知：adh基因对于草本植物响应低氧胁迫发挥着重要的作用，而木本植物中研究较少，在中山杉中尚未有相关报道。

技术实现要素：

发明目的：针对现在技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种调控中山杉耐水淹特性的thadh4基因。本发明的另一目的是提供上述调控中山杉耐水淹特性的thadh4基因的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种调控中山杉耐水淹特性的thadh4基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

含有所述的调控中山杉耐水淹特性的thadh4基因的载体。

所述的调控中山杉耐水淹特性的thadh4基因的表达蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述的调控中山杉耐水淹特性的thadh4基因在植物育种中的应用。

所述的调控中山杉耐水淹特性的thadh4基因在植物抗涝中的应用。

本发明以中山杉406叶片为材料，通过race技术克隆了中山杉thadh4。同时，采用通路克隆技术构建其过量表达载体ph35gs-thadh4，该基因位于启动子p35s之后，在启动子p35s的驱动下，thadh4在杨树中高效表达，并伴随着表型出现变异，转基因植株生长速率加快，节间明显变长。

有益效果：与现有技术相比，本发明通过将thadh4基因转入木本模式植物杨树中，过量表达thadh4的转基因杨树，生长速率加快，节间明显变长，且水淹胁迫下，基因的表达量呈几百倍上升。说明thadh4基因是植物响应水淹胁迫的重要基因，在林木基因工程领域有重要的应用价值。

附图说明

图1是植物过表达载体ph35gs示意图；

图2是过量表达thadh4转基因杨树与未转基因杨树整体表型对比图，图中左为未转基因杨树，图中右为转基因杨树；

图3是过表达thadh4转基因植株在水淹胁迫下的基因表达变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行。

实施例1通过race技术克隆thadh4基因

1）rna的提取及cdna的反转

以中山杉406叶片为材料，使用rneasyplantminikit（qiagen公司），中山杉总rna的提取，由于叶片内含有较多的酚类化合物，对操作步骤进行了改良。在进行提取rna操作前，所有的枪头，离心管，研钵均应用0.1%depc水浸泡过夜，高压灭菌40min后烘干。所有溶液均应采用0.1%depc水配制。用nanodrop1000进行总rna浓度和纯度的测定。用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行总rna的分离，一个完整性较好的rna应当可以观测到三条清晰的条带，其中5.8srna稍暗，而28srna的条带亮度约为18srna的两倍左右，表明rna没有被降解，后采用clontech公司的smarter™pcrcdnasynthesiskit，advantage®2pcrkit进行反转录。

2）thadh4基因目的片段的获得

根据中山杉转录组测序结果进行筛选thadh4的unigene序列，使用oligo6设计特异性的引物扩增thadh4基因的目的片段，其中，thadh4目的片段的正向引物为：5’-gaagtgatgagaagagcaggtt-3’，5’-aggcctggtataatacgttggtat-3’。pcr反应体系：takaralataq(5u/μl)0.5μl，10×lapcrbuffer(mg²⁺free)5.0μl，mgcl2（25mm）5.0μl，dntpmixture（2.5mmeach）8.0μl，forwardprimer(10μm)2.0μl，reverseprimer(10μm)2.0μl，cdnatemplate1.0μl，milli-qwater26.5μl。反应程序为：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，35cycles；72℃10min；4℃forever。对产物进行测序，获得的thadh4基因目的片段序列如seqidno.3所示。

依据上述thadh4基因目的片段分别设计3’race和5’race扩增，pcr筛选后进行克隆测序，最后将获得3’race片段及5’race片段进行拼接。

3）3’race

3’race反转录：以总rna为模板，反应体系如下：totalrna1μg（xμl），5×m-mlvbuffer2μl，dntpmixture（10mmeach）1μl，3'raceadaptor（5′-ctgatctagaggtaccggatcc-3′）（5μm）1μl，reversetranscriptasem-mlv(rnaseh)(200u/μl)0.25μl，rnaseinhibitor（40u/μl）0.25μl，rnasefreeh2o5.5-xμl，总体积10μl。反应程序为：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，30cycles；72℃10min；4℃forever。获得3’racecdna4℃储存，进入下一个步骤。

3’race巢氏pcr：3’race巢氏pcr分为3’raceouterpcr和3’raceinnerpcr两轮，在获得10μl3'race反转录产物后，可以进行适当的稀释，一般是稀释到30μl用于后续反应。

3'raceouterpcr是反应体系如下：稀释过的反转录反应液2μl，3'raceouterprimer（10μm）2μl，genespecificouterprimer（10μm）2μl，10×extaqbufferii（mg²⁺free）5μl，mgcl2（25mm）4μl，dntpmixture（10mmeach）4μl，extaqpolymerase0.3μl，ddh2o30.7μl，总体积50μl。反应程序为：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，30cycles；72℃10min；4℃forever。反应产物取5μl稀释适当倍数后用于innerpcr反应，其余的用于琼脂糖凝胶电泳检测。

引物序列如下：thadh43'raceouterprimer：5'-taccgtcgttccactagtgattt-3'；genespecificouterprimer：5'-cctcaaagataataggaataga-3'。

3'raceinnerpcr是反应体系如下：稀释过的3'raceinnerpcr产物2μl，3'raceinnerprimer（10μm）2μl，genespecificouterprimer（10μm）2μl，10×extaqbufferii（mg²⁺free）5μl，mgcl2（25mm）4μl，dntpmixture（10mmeach）4μl，extaqpolymerase0.3μl，ddh2o30.7μl，总体积50μl。反应程序为：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，32cycles；72℃10min；4℃forever。

引物序列如下：thadh43'raceinnerprimer：5'-cagcttcgaatgcattggaaatacca-3'，genespecificinnerprimer：5'-cgcggatcctccactagtgatttcactatagg-3'。

pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的片段，利用切胶试剂盒回收后，连接于takara公司的pmd19-tsimplevector，转化takara公司的top10大肠杆菌感受态，通过含有amp的lb筛选培养板进行筛选，将筛选出的单克隆菌落pcr检测后送至金斯瑞公司测序鉴定。

4）5’race

5’race反转录：去磷酸化反应是5’race的第一步反应，由alkalinephosphatase催化完成的。反应体系如下：totalrna2-5μg（xμl），10×alkalinephosphatasebuffer（mgcl2free）5μl，alkalinephosphatase（calfintestine）（16u/μl）0.6μl，rnaseinhibitor（40u/μl）1μl，rnasefreedh2o43.4-xμl，总体积50μl。50℃反应1h，向上述反应液加入20μl的3mch3coona（ph5.2），130μl的rnasefreedh2o后充分混匀，加入200μl的酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后13000g室温离心5min，将上层水相转移至新的1.5ml的离心管中，加入200μl的氯仿，充分混匀后13000g室温离心5min，将上层水相转移至新的1.5ml的离心管中，加入2μl的nacarrier后均匀混合，再加入200μl的异丙醇，充分混匀后，-40℃放置2h以上，4℃13000g离心20min，弃上清，加入500μl的75%的预冷乙醇漂洗，4℃，13000g离心5min，弃上清后干燥，加入7μl的depc水溶解沉淀，得到ciap-treatedrna。

5’race的第二步反应是去帽子反应，用tobaccoacidpyrophosphatase去掉mrna的5’帽子结构，并保留一个磷酸基团。反应体系：ciap-treatedrna7μl，10×tapreactionbuffer1μl，tobaccoacidpyrophosphatase（0.5u/μl）1μl，rnaseinhibitor（40u/μl）1μl，totalvolume10μl。37℃反应1h，取5μl用于5’raceadaptor连接反应，剩余的5μl保存于-80℃。5’adaptor的连接反应体系如下：ciap/tap-treatedrna5μl，5’raceadaptor（15μm）1μl，rnasefreedh2o4μl，65℃反应5min后冰上放置2min，加入下列试剂：5×rnaligationbuffer8μl，40%peg600020μl，t4rnaligase1μl，rnaseinhibitor（40u/μl）1μl，总体积40μl，16℃反应1h，4℃过夜。向上述反应液中加入20μl的3mch3coona（ph5.2），140μl的rnasefreedh2o后，充分混匀，加入200μl的苯酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后13000g室温离心5min，将上层水相转移至新的1.5ml的离心管中，加入200μl的氯仿，充分混匀后13000g室温离心5min，将上层水相转移至新的1.5ml的离心管中，加入2μl的nacarrier后充分混匀；再加入200μl的异丙醇，-40℃放置2h，加入500μl的75%的预冷乙醇漂洗，4℃，13000g离心5min，弃上清后再离心1min后彻底吸干溶液后干燥，加入7μl的rnasefreedh2o溶解沉淀，得到ligatedrna。

ligatedrna反转录反应，反应体系：ligaterna6μl，5×m-mlvbuffer2μl，dntp（10μmeach）1μl，random9mers（50μm）0.5μl，reversetranscriptasem-mlv（rnaseh）（200u/μ）0.25μ，rnaseinhibitor（40u/μ）0.25μ，总体积10μl。反应程序：30℃10min；42℃1h；70℃15min；4℃forever。获得5’racecdna4℃储存，进入下一个步骤。

5’race巢氏pcr也分为5’raceouterpcr和5’raceinnerpcr两轮，反应体系，反应条件与3’race巢氏pcr一致。

引物序列如下：thadh45’raceouterprimer：5'-acacaagcataatccacgactgtata-3'，genespecificouterprimer：5'-cgcggatccatggctacatgctgacagccta-3'。thadh45’raceinnerprimer：5'-tggtacaccggcttcccacccaaaga-3'，genespecificinnerprimer：5'-cgcggatccacagcctactgatgatcagtcgatg-3'。

pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的片段，利用切胶试剂盒回收后，连接于takara公司的pmd19-tsimplevector，转化takara公司的top10大肠杆菌感受态，通过含有amp的lb筛选培养板进行筛选，将筛选出的单克隆菌落pcr检测后送至金斯瑞公司测序鉴定。

将测序获得的3'race及5’race产物利用bioedit软件进行拼接，获得含有1506bp碱基的目的基因，blast确认目的基因和水稻/拟南芥adh4基因高度同源，命名为thadh4基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其包含一个1212bp的完整编码阅读框，其所编译表达蛋白序列如seqidno.2所示。

实施例2thadh4基因植物表达载体构建

利用gateway定向克隆技术，将目的基因片段转移到目的表达载体上，包含bp反应和lr反应两部分。本实施例所用的载体图如图1所示。

1）bp反应的目的是将基因片段转移到入门载体上，反应体系：vectorthadh4orf片段10-20ng，saltsolution1μl，pcrtm8/gw/topotmvector（入门载体）1μl，加nuclease-freewater至总体积6μl，轻轻混匀，22℃反应60min后转移至冰上；将前步6μl反应产物转化到top10感受态细胞中，涂于lb筛选培养平板，挑取单克隆进行菌液pcr检测，所用引物为基因特异性上游引物和载体上的t7引物，检测后的阳性克隆进一步测序验证。

2）lr反应的目的在于将已经重组入门载体的目标基因再克隆到目的载体中，反应体系：入门载体纯化后的质粒100ng，目的载体（100ng/μl）1.5μl，lrclonaseiienzymemix2μl，加1×te（ph8.0）至总体积8μl，涡旋后短暂离心，25℃温浴1h，加入1μlproteinaseksolution，混匀，37℃温浴10min以终止反应；取2μllr反应产物转化top10感受态细胞，涂于lb筛选培养平板，挑取单克隆进行菌液pcr检测，所用引物为thadh4基因特异性上游引物和载体上的35s引物，检测后的阳性克隆进一步测序验证。验证后，回收纯化lr反应后的重组载体，即得到目的基因的表达载体，-20℃保存备用。

实施例3thadh4基因的遗传转化

通过液氮冻融法将thadh4基因转化农杆菌，后用叶盘法转化杂种山新杨。操作步骤：在eha105感受态细胞中加入至少100ng回收纯化的表达载体，轻轻混匀，冰浴30min，液氮速冻1min，37℃热击3min，迅速置于冰上1-2min，加入800μllb培养基，28℃，100rmp复苏3h，4000rmp离心3min，吸掉800μllb培养基，混匀剩余菌液，涂抹于含有抗生素的lb平板，28℃倒置培养30-48h，pcr检测阳性克隆，将阳性克隆菌落扩繁，接种于120ml含相应抗生素的lb液体培养基中，28℃摇菌（220rmp）培养24h左右，至od600值约0.5，将菌液分装于50ml的离心管中，1400rcf离心10min，收集菌体，用一定体积的ms（不加蔗糖）溶液重悬菌体至od600值0.5，乙酰丁香酮（as）至终浓度为20μm，25℃温和振荡（90rmp）菌液45min，将生长势基本一致，4-6周的山新杨组培苗，取顶芽下的2-3片舒展的叶片，延叶的边缘剪出伤口，片剪成大小合适的不等边形，转入制备好的浸染液中25℃温和振荡30min（250ml的三角瓶，90rmp），取出叶盘，用滤纸吸干残余菌液，转入不含抗生素的ms1分化培养平板上暗培养48h，洗菌后转入不含抗生素的ms1分化培养平板上光培养1w，再将叶盘转入入含抗生素的ms1分化培养平板上，进行筛选培养，当叶盘边缘长出抗性不定芽时，将其转入含抗生素的ms2茎伸长培养平板上培养，当抗性不定芽在茎伸长培养基中生长至1cm左右时，将其剪下转入含有抗生素的ms培养平板上进行抗性植株生根筛选，从而获得完整植株，扦插抗性植株的苗干于ms培养基上，进行插条的表型观测。生长4w后，从图2可以看出，thadh4的过量表达对植株的表型产生了一定的影响，较对照植株，转基因植株生长速度变快，节间发生变异，节间长度明显长于对照植株。

实施例4转基因植株水淹胁迫后的分子检测

对筛选培养基上表型发生变异的转thadh4基因杨树及对照杨树进行没顶淹水实验，1w后对照杨树叶片呈现萎蔫、发黄，而转基因杨树未有明显变化，取样进行实时定量分子检测。实时定量引物采用oligo6.6软件设计，扩增产物长度156bp，引物tm值在60℃，引物序列：qadh4f:5'-cataatagagagcgtgg-3'qadh4r:5'-tgactgttctcatgatt-3'。实时定量pcr的内参基因采用已筛选出的18s基因。实时定量在abi7500realtimepcrsystems上完成，每反转录样品三次重复，数据提取分析采用7500systemsdssoftware。反应体系如下：sybrpremixextaqtm（2×）10μl，pcrforwardprimer（10μm）0.4μl，pcrreverseprimer（10μm）0.4μl，roxreferencedyeⅱ（50×）0.4μl，dna模板2μl，dh2o6.8μl，总体积20μl。反应程序：94℃30s；94℃5s，60℃34s，95℃15s，40cycles；60℃1min，95℃15s。实时定量结果如图3所示：水淹胁迫1w后，对照植株叶片呈现萎蔫状态，而转基因植株长势良好。thadh4基因的表达量在转基因植株中较对照高出220倍-506倍，说明中山杉thadh4基因和耐水淹特性密切相关，预测其在林木基因工程领域将有重要的应用价值。

sequencelisting

<110>江苏省中国科学院植物研究所

<120>一种调控中山杉耐水淹特性的thadh4基因及其应用

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