本发明涉及一种同时提高酿酒酵母细胞活力与多重抗逆性的方法及其用途。具体地，涉及到一种基因表达盒、插入该基因表达盒的表达载体、利用该表达载体转化至酵母细胞或者利用该表达盒插入酵母基因组实现制备具备多重抗逆性的高活力酵母菌株的方法及其应用，属于生物化工领域。
背景技术：
目前工业生物技术产品的年产值在逐年增长，在国民经济中占有非常高的比重，其中微生物发酵是工业生物技术的主要组成部分。工业微生物发酵的效益决定性因素之一是所应用微生物菌种，实际工业高密度微生物发酵过程中培养环境条件多变如高温、高渗透压、不适的ph、高乙醇浓度等胁迫都会抑制微生物的生存，生产。培养条件的人为调控会耗费大量人力，物力造成高成本。因此从源头出发提高所用发酵微生物的抗逆性，可以更好发挥其作用。
酿酒酵母是是生物产业领域非常重要的微生物细胞工厂，具有易培养、细胞生长周期短、遗传背景清晰等优点，是理想的真核生物模式菌种。作为工业生产的优良菌种，酿酒酵母能通过糖酵解途径将葡萄糖转化为乙醇。随着基因工程技术的发展，酿酒酵母被改造成工程菌用于生产各类天然产物，使酿酒酵母的应用性更为广泛。酿酒酵母是微生物发酵中应用最为广泛的模式微生物之一，提高酿酒酵母的鲁棒性，使其在多变的培养环境，较高的发酵温度下仍保持正常的生长代谢活力，成为改进酵母发酵工艺的重中之重。
环境胁迫会对酵母细胞产生多种影响，如错误折叠蛋白的积累、氧化磷酸化的解偶联、质膜与细胞骨架结构的破坏以及细胞蛋白分泌途径的缺失等，这些都严重影响酵母细胞的生长及代谢。同时可见胁迫对细胞的影响主要与蛋白质的损伤有关。细胞体内存在的由分子伴侣系统，泛素蛋白酶体系统，自噬系统三个部分组成的蛋白质平衡网络，可以调节细胞体内的蛋白质的降解与合成，修复与损伤的平衡并且控制蛋白质质量，使得蛋白质能较好地行使各项功能从而使细胞在多变的生长环境中保持活性。蛋白质平衡网络中的关键系统泛素蛋白酶体系统可以通过泛素及泛素酶将损伤蛋白质泛素化后利用泛素蛋白酶体进行降解,由此可知蛋白酶体对于细胞的蛋白质质量控制的重要性。
目前国内外在酵母抗逆性方面研究比较局限，主要集中于细胞单一抗逆性研究，例如耐热性及耐乙醇胁迫等。整体来说，提高酵母细胞抗逆性的方法主要是适应性驯化和随机突变筛选，并且这些方法虽能提高酵母的单种抗逆性但往往不能同时提高细胞活力甚至使细胞活力降低。未见通过基因工程手段精细改造调控蛋白酶体来提高酿酒酵母的活力同时提高细胞多重抗逆性能力的研究报道。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的单一以及技术的不足，提供一种能够使酵母工程菌株同时具备多重抗逆性且增强其细胞活力的基因表达盒、插入有该基因表达盒的表达载体、利用该基因表达盒制备工程菌株的方法及其包括在工业生产乙醇中的应用。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种基因表达盒，该表达盒由组成型或诱导性启动子、如seqidno.1所示的核酸序列及终止子三部分组成。
上述基因表达盒构建方式可以用以下方法实现：所述核酸序列seqidno.1的5’端连接启动子核酸序列，3’端连接终止子核酸序列构建基因表达盒。其中seqidno.1是通过将酿酒酵母基因pre9(编码泛素蛋白酶体的α3亚基)5’端的+4bp至+31bp(atg＝+1)这一序列进行截除后所得序列。
其中启动子核酸序列是指用来增强所述核酸序列seqidno.1转录水平调控基因转录时间的序列。各种组成型及诱导性启动子核酸序列都可以用于本发明。终止子序列是用来终止所述核酸序列seqidno.1转录的序列，各类常规的终止子序列均可用于本发明。
进一步优选地，所述基因表达盒中所用启动子为强组成型启动子fba1p,基因序列如seqidno.2所示。
根据本发明，对所述基因表达盒中的终止子没有特别的限定，且本领域技术人员能够很容易地选择适当的终止子来构建能够表达核酸序列seqidno.1的基因表达盒。
第二方面，本发明提供了一种表达载体，其中，该表达载体插入有上述基因表达盒，所述表达载体可以为插入有本发明的基因表达盒并能够使其表达的任何表达载体，例如，质粒或噬菌体。
实现方式为，根据本发明的一种优选实施方式，所述表达载体为在质粒prs42k(含有g418筛选标记的穿梭载体)的bamhi酶切位点和slal酶切位点之间插入序列如上所述的基因表达盒而得到的表达载体。将本发明优选实施方式中的表达载体转化到酿酒酵母细胞中时能够获得更高的表达效率，从而能够更好地实现本发明的目的。
第三方面，本发明提供了1种制备多重抗逆性的酵母菌株的方法，即实现基因表达盒在宿主酵母细胞内表达而得到酿酒酵母菌株。该方法包括两种策略：1.将本发明中基因表达盒整合到基因组上进行表达。2.实现本发明中表达载体在酵母细胞中的表达。
本发明中，将表达盒整合到基因组上的方法是将在表达盒与筛选标记基因连接转化至酵母细胞，利用基因同源重组整合到酵母基因组上。
筛选标记基因不做特别的限定，且本领域技术人员能够很容易地选择适当的筛选标记基因来筛选成功改造的阳性克隆酵母。本发明优选的是g418抗性筛选标记基因。
本发明中实现表达载体在酵母细胞中的表达的方法是首先通过pcr技术将表达盒两端加上与双酶切后的载体两端互补的39个bp长度的核酸序列，之后同双酶切(bamhi酶，slal酶)后的质粒一起转化至酵母细胞，利用酵母细胞自身的同源重组机制获得表达载体。
可以采用本领域常用的各种转化手段将表达盒转化酵母细胞，例如，电穿孔法或化学法。优选地，采用化学法来转化酵母细胞。化学法的具体操作为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
本发明中，对使用的酵母细胞没有特别的要求，可以为野生型的各种酵母细胞，也可以为缺陷型酵母细胞。
根据本发明，为了获得制备的具有表达盒的酵母菌株的纯培养物，将转化后的酵母细胞在含有g418抗生素培养基中进行培养，筛选阳性克隆。
第四方面，本发明提供了两种酵母菌株，该酵母菌株为酿酒酵母(saccharomycescerevlsiae)的菌株。本发明提供的两株酵母菌株，其中一株是本发明中的基因表达盒整合到酵母基因组上获得的多重抗逆性的酵母菌株，该酵母菌株的保藏号为cgmcc14241。另一株是将本发明中的载体转化至酵母细胞得到的多重抗逆性，高活性的酿酒酵母，该酵母菌株的保藏号cgmcc14242。本发明中，将上述保藏号为cgmcc14241的酵母菌株命名为酿酒酵母lip-g09。将上述保藏号为cgmcc14242的酵母菌株命名为酿酒酵母lip-p11。
酿酒酵母lip-g09及lip-p11具有典型的酿酒酵母菌株生物学特征：细胞呈椭圆形，多边芽殖；菌落凸起、乳白色、圆形、光滑湿润、边缘整齐、容易挑起。而且，酿酒酵母lip-g09及lip-p11具有典型的酿酒酵母生理生化特征，能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖，还能有效发酵葡萄糖产乙醇。
有益效果
通过上述技术方案，利用本发明基因表达盒整合到酵母基因组上后获得酵母菌株lip-g09，在梯度升温(37℃-43℃)，及恒定高温42℃培养时具有较高发酵活力，菌体量(84h)比出发菌株wt分别提高16.9％和20.5％。同时酵母菌株lip-g09的抗氧化胁迫(cdso4)、抗热胁迫(heat)、抗细胞壁损伤胁迫(congored)等多重抗逆性大大提高。
将本发明中的载体转化至酵母细胞得到的多重抗逆性，高活性的酿酒酵母菌株lip-p11比菌株lip-g09的seqidno.1基因转录水平更高。同时具有更高的细胞活力(胁迫条件及适宜条件下都比出发菌株活力更高)，在梯度升温(37℃-43℃)，及恒定恒温40℃培养时具有较高发酵活力。梯度升温发酵结果显示菌株lip-p11菌体量(84h)比对照菌株wt/v(含空质粒的菌株)及出发菌株wt提高了120.0％及35.7％；同时酵母菌株lip-p11抗dna损伤胁迫、抗渗透压胁迫、抗氧化胁迫、抗热激胁迫、抗细胞壁损伤胁迫、抗乙醇胁迫等多个方面的抗胁迫能力均有明显提高。
利用本发明制备多重抗逆性酵母菌株的方法实现了本发明中的基因表达盒在酵母中的表达，并表达量更高的菌株具有更高的细胞活力及更强的多重抗逆性，证明了基因表达盒的作用。具有高活力及多重抗逆性的酿酒酵母将会大大提高工业发酵生产过程中的生产效率，降低发酵能耗，降低生产成本，实现人工生物反应体系的高效性，对工业发酵有深远的意义。同时通过分子生物学和合成生物学的理论与方法，精细改造酵母细胞的蛋白质内平衡系统中的关键因子蛋白酶体的成功应用，提供了一个提高酵母细胞抗逆性的新思路，奠定了理论基础。
附图说明
图1酵母菌株lip-p11和其载体上插入的基因表达盒的组成示意图；
图2酵母菌株lip-p11的载体上基因表达盒的pcr验证结果。lip-p11：目标片段，m:dna分子量标准；
图3酿酒酵母工程菌株lip-g09和其染色体上基因表达盒的组成示意图；lipg09：目标片段，m:dna分子量标准；
图4酿酒酵母工程菌株lip-g09染色体上基因表达盒的pcr验证结果；
图5酿酒酵母菌株梯度(37℃-43℃)升温发酵实验结果；
图6酿酒酵母菌株恒定40℃高温发酵实验；
图7酿酒酵母工程菌株lip-g09多重抗逆性表征结果；
图8酿酒酵母工程菌株lip-p11抗逆性表征结果；
图9酿酒酵母细胞活力表征结果；
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“抗逆性”是指微生物在偏离其最佳生长条件下的胁迫环境中的生长和发酵能力，比如较高或较低的温度，较高或较低的渗透压，较高的反馈抑制，有毒物质的存在等环境。
实施例1基因表达盒及高活性多重抗逆性构建
本论文中所用出发菌株酿酒酵母(invsc1)为营养缺陷型酵母菌株。所用穿梭质粒prs42k购买自德国法兰克福的euroscarf。所用ypd培养基为通用的完全培养基，固体培养基含2％琼脂粉。含有质粒的菌株如lip-p11及对照菌株wt/v的培养基中都添加抗生素g418。
设计引物克隆启动子基因，目标基因序列seqidno.1序列，终止子基因，再通过oe-pcr进行基因组合得到基因表达盒。将基因表达盒与之后同双酶切(bamhi酶，slal酶)后的质粒prs42k一起通过化学转化法转化至酵母细胞invsc1，(示意图见图1)利用酵母细胞的同源重组机制进行质粒自组装，涂布于含有抗生素g418的筛选平板上。挑取阳性克隆接种于含有抗生素g418的ypd液体培养基内，30℃培养24h，提取质粒，对插入基因表达盒片段进行pcr检测(见图2)，并对基因表达盒进行测序验证，其基因表达盒序列如seqidno.3所示，结果表明正确无误。获得基因表达盒，表达载体同时获得酵母工程菌lip-p11。
利用引物成功克隆重组位点左500bp重复序列l，g418抗性基因(seqidno.4)，启动子fba1p，核酸序列seqidno.1，再通过oe-pcr进行基因组合，得到组合片段后通过酵母化学转化法导入酵母细胞insc1，利用酵母细胞的同源重组机制将组合片段整合到酵母基因组原pre9的位点上(见图3)。涂布于含有抗生素g418的筛选平板上。挑取阳性克隆接种于含有抗生素g418的ypd液体培养基内，30℃培养24h，提取基因组，对导入染色体的基因组合片段进行pcr检测(见图4)。对基因表达盒序列进行测序验证，得到测序正确的基因表达盒序列如seqidno.5所示，获得酿酒酵母工程菌lip-g09。可知整合在基因组上的的基因表达盒是由启动子fba1p，目标基因序列seqidno.1，及基因组上原有pre9基因的终止子组成。
实施例2.表达盒中目标基因序列转录水平检测
将酿酒酵母工程菌在液体ypd培养基中，30℃，200rpm培养36h后，按初od660＝0.1转接到40ml新鲜ypd液体培养基中，30℃培养12h后，将温度升高到40℃继续培养24h。收集菌体采用试剂盒进行rna的提取。之后采用takara公司的“primescripttmrtmastermix(perfectrealtime)”试剂盒将提取的rna进行反转录采用qrt-pcr相对定量的方法，即选择一个内参基因atc1，通过样品中的内参性特征基因作为标定基因，目的基因的含量通过与内参基因的比较反应出来。数值不是确定性的样品浓度，而是与内参基因相比较得到的相对值。结果表明菌株lip-p11的目标基因序列seqidno.1转录水平是菌株lip-g09的1.51倍，主要由于质粒prs42k的高拷贝性质使表达目标基因的水平有差异。
实施例3.高温发酵实验
菌种活化
挑取存放在4℃冰箱中平板上保藏的菌种，接于液体ypd培养基中，于恒温振荡器中30℃、转速200rpm，培养36h，再以1％的接种量转接于新鲜液体ypd培养基中继续培养12h后作为种子液。
梯度升温(37℃-45℃)发酵实验
将活化好的种子液按一定的量接种至含有40ml新鲜ypd液体培养基的250ml三角瓶中，使细胞培养液的最初od660为0.1并于30℃恒温摇床中培养12h后，把培养温度提高到37℃。然后以37℃为基准，每隔12h逐步提高培养温度至39℃、40℃、41℃、42℃、43℃，共培养84h。每隔12h取样，紫外可见分光光度计测量od600值，并以此作为生长状况指标，表征酿酒酵母在梯度升温环境下的耐热性强弱。每个实验组重复3次。如图5所示，以细胞的od值表征细胞的菌体量，菌株lip-p11的菌体量(84h)比对照菌株wt/v(有空载体prs42k的酵母菌株)提高了78.6％。并且比无抗生素g418胁迫压力及质粒负担的出发菌株wt提高了29.8％；菌株lip-g09的高温发酵活力稍优于出发菌株。
恒定40℃高温培养
种子液按一定的量接种于含有40ml新鲜ypd液体培养基的250ml三角瓶中，使细胞培养液的最初od600为0.1。并于30℃恒温摇床中培养12h后，将培养温度提高到40℃、42℃续高温培养至84h。同样每隔12h取样，于紫外可见分光光度计下测定od660值，并以此作为作为生长状况指标，表征酿酒酵母在特定高温下的耐热性。每个实验组重复3次。
如图6所示，以细胞的od值表征细胞的菌体量，菌株lip-p11的菌体量(84h)比对照菌株wt/v(有空载体prs42k的酵母菌株)提高了124％。并且比无抗生素g418胁迫压力及质粒负担的出发菌株wt提高了36.7％；菌株lip-g09的高温发酵活力优于出发菌株wt。
可见该利用该基因表达盒转化至酵母细胞表达可以大大提高酵母细胞的高温发酵活力，且基因表达盒中目标基因表达量越高，提高酵母抗逆性及活力的效果越显著。
实施例4胁迫平板实验
按照菌种活化方法，取所有样品的种子液稀释至相同浓度od600＝1.0，按10-1比例逐步稀释至10-4，取每个梯度的菌液4.5μl顺序点滴于固体胁迫ypd培养基平板上。置于30℃恒温培养箱中培养。并且用以下胁迫平板来检测酵母细胞对各类胁迫的耐受性。
(1)ypd+congred(刚果红)培养基：每100ml培养基加入2ml浓度为5mg/ml的congred母液，终浓度为100μg/ml，用于考察酿酒酵母工程菌对刚果红的敏感性。
(2)ypd+cdso4(硫酸铬)培养基：每100ml培养基加入100μl浓度为0.2mol/lcdso4母液，终浓度为200μm，用于考察酿酒酵母工程菌对氧化胁迫的敏感性。
(3)ypd+乙醇培养基：每100ml培养基加入8ml无水乙醇，终浓度为8％，用于考察酿酒酵母工程菌对高浓度乙醇胁迫的敏感性。
(4)ypd+nacl(氯化钠)培养基：每100ml培养基加入0.06molnacl终浓度为0.6mol/l，用于考察酿酒酵母工程菌对高渗透压胁迫的敏感性。
(6)ypd+ems(甲磺酸乙脂)培养基：每100ml培养基加入0.4mlems，终浓度为0.4％，用于考察酿酒酵母工程菌对dna损伤胁迫的敏感性。
其中热激(heat)胁迫检测是通过将酵母菌菌液在55℃恒温水浴锅中高温水浴10min或者5min后进行平板点滴。
结果如图7所示表明同时酵母菌株lip-g09的抗氧化胁迫(cdso4)、抗热胁迫(heat)、抗细胞壁损伤胁迫(congored)等多重抗逆性大大提高。
结果如图8酵母菌株lip-p11抗dna损伤胁迫、抗渗透压胁迫、抗氧化胁迫、抗热激胁迫、抗细胞壁损伤胁迫、抗乙醇胁迫等多个方面的胁迫抗性均有明显提高。
实施例5酵母菌活力检测-ttc(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)实验
该实验参考挑取平板上酿酒酵母单菌落于液体ypd培养基(250ml三角瓶)中，于恒温震荡培养箱中培养(30℃、转速170rpm，培养36h)作为种子液。将种子液以1％接种于10ml试管中(菌液量4ml)分别置于30℃，35℃，40℃(转速200rpm，培养12h)，之后加入40μl40％的ttc使其终浓度为0.4％，培养4个小时。
细胞内的脱氢酶可以把ttc转化为ttf，取1ml菌液1000r/min离心1min后弃上清液加入1ml85％二甲基亚砜溶液震荡混匀后1000r/min离心1min，取200μl上清液加入酶标板测其486处的ttf吸收值利用公式：ttf含量＝实验测得ttf吸收值×(1/细胞od600吸收值)，以所得到的在标准曲线线性范围内的ttf值确定细胞呼吸力即细胞活力大小。结果如图9所示，可以看出无论是30℃适宜培养条件还是40℃高温胁迫培养条件下，酵母菌株lip-p11的细胞活力比对照菌株wt/v(有空载体prs42k的酵母菌株)及出发菌株(无抗生素g418胁迫压力及质粒负担)相比有明显提高。
从以上实施例可以看出，将本发明的基因表达盒及插有该基因表达盒的载体转化酵母后得到多重抗逆性及较高活力酵母菌株。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。