本发明属于基因工程技术领域，具体涉及橡胶树白粉菌内源启动子wy7及其用途。
背景技术：
启动子是基因表达的一种重要的顺式作用元件，位于结构基因5'端上游，能活化rna聚合酶并使之与模板dna准确结合，具有转录起始的特异性。启动子能提供rna聚合酶特异识别的结合位点，能够控制基因的转录起始和基因的表达，通常位于基因转录起始位点近端的核苷酸序列内，主要由核心启动区、上游元件和应答元件组成。
根据真核基因编码的产物和rna聚合酶的种类，可以把启动子分为三类，i型启动子即rrna基因启动子、ii型启动子即mrna基因启动子型和iii型启动子即trna基因启动子。高等植物的启动子属于mrna基因启动子，其核心结构大多包含一个tata盒以及起始子。
根据基因的转录模式，可以把启动子大致分为三类，诱导型启动子、组织特异性启动子和组成型启动子。诱导型启动子是一类在植物特定的生长、发育阶段，在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可以大幅度地提高目的基因的表达水平，也可以解除胁迫、使基因表达停止的启动子。组织特异性启动子也称之为器官特异性启动子，在这些启动子调控下,基因可以定向、专一地只在某些特定的器官或组织部位表达,并往往表现出发育调节的特性。这种类型的启动子所启动的外源基因在植物中的表达具有特异性,能够克服组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异性的持续、高效表达所造成的浪费,而在需要该基因大量表达的特定组织部位则因表达量过低又达不到预期效果以及由此引发的一系列代谢紊乱问题。组成型启动子是一类表达比较持续稳定的启动子，能够控制结构基因并使其转录水平大致恒定，在不同组织、器官表达水平没有明显差异，不表现时空特异性。从植物本身克隆组成型启动子是研究的热点，目前使用最广泛的两个组成型启动子是烟草花叶病毒(camv)35s启动子以及来自根癌农杆菌ti质粒t-dna区域的胭脂碱合成酶基因启动子(nos)和章鱼碱合成酶基因启动子(ocs)。另外,水稻atcl启动子序列结构也研究得比较清楚。这些也是转基因植物研究中应用最广的启动子。
随着组成型启动子35s的应用越来越广泛，有许多问题也随之暴露出来。在目前的研究中发现，植物组成型启动子的增强子核心序列与动物的增强子相同，但在动物系统中，增强子的组织表达是特异性的，而35s驱动的基因在植物各组织中的表达是非特异性的，在应用中逐渐暴露出一些问题。例如外源基因在植物不同组织中表达，产生代谢产物积聚在植物体内打破其原有的代谢平衡，影响其正常生长发育。除此之外，在35s启动子处还含有一个核苷酸的重复的六聚体花纹结构，这一序列的突变可能会减弱启动子的启动表达能力，至今都没有行之有效的措施来避免这一现象的发生。
专性寄生是指寄生物离开宿主就不能生存的现象。专性寄生菌由于无法进行离体培养，给各种研究尤其是分子生物学方面的研究带来了巨大的困难，以致于专性寄生菌大多都尚未建立遗传转化体系，各种分子机理研究严重滞后。橡胶树白粉菌是一种重要的专性寄生真菌，间接影响着橡胶产业的发展。其遗传转化体系尚未建立。我们利用生物信息学方法预测其内源启动子并进行验证，试图找到一些橡胶树白粉菌的内源强启动子，以便了解其调控外源目的基因和内源基因的分子机理，对橡胶树白粉菌侵染的分子机制、其遗传转化体系的构建，以及转基因植物表达外源基因的研究提供一些新的思路。
技术实现要素：
针对以上现有技术的不足之处，本发明提供一种橡胶树白粉菌内源启动子wy7。
本发明采取的技术方案如下：
一种橡胶树白粉菌内源启动子wy7，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：
a、seqidno：1所示的核苷酸序列；
b、与seqidno：1互补的核苷酸序列；
c、能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；
e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。
优选的，所述启动子的制备方法包括：以橡胶树白粉菌基因组dna为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据seqidno：1在橡胶树白粉菌基因组dna中的序列分别针对首尾进行设计。
进一步的，本发明还涉及一种核酸构建体，其包含本发明的启动子，与启动子可操作连接的基因序列。
进一步的，本发明还涉及一种重组载体，所述载体为本发明的启动子与pgem-teasy或pbi121质粒经重组所得。
进一步的，本发明还涉及一种重组细胞，所述细胞含有权利要求1的启动子或权利要求3的核酸构建体或权利要求4的重组载体。
优选的，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组根癌农杆菌细胞。
进一步的，本发明还涉及一组引物对，所述引物对的两条引物分别含有seqidno：2和seqidno：3所示的序列；所述引物对的两条引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基。
进一步的，本发明还涉及一种转基因植物，所述转基因植物转化有本发明的启动子或核酸构建体或重组载体或感染本发明的重组细胞。
进一步的，本发明还涉及一种植物愈伤组织或外植体，所述愈伤组织或外植体转化有本发明的启动子或核酸构建体或重组载体或感染有本发明的重组细胞。
进一步的，本发明还涉及所述启动子wy7或所述核酸构建体或所述重组载体或所述重组细胞在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
提供了一种来源于橡胶树白粉菌的新的启动子wy7，所述启动子能够用于调控双子叶植物和单子叶植物中的外源目的基因的表达，为转基因植物的基因表达提供了一种全新的工具和选择。
附图说明
图1为重组载体pbi121-wy7的质粒图谱。
图2为启动子wy7重组载体pbi121-wy7的重组根癌农杆菌介导转化的三生烟叶盘的gus染色结果。
图中，wy7为pbi121-wy7转化三生烟叶盘的gus染色结果；ck+(camv35s)：由camv35s调控gus基因转录的pbi121空载体转化三生烟叶盘的gus染色结果；ck-(无菌苗)为未转化的三生烟无菌苗叶盘的gus染色结果。
图3为wy7转基因三生烟各生长时期图；
图中，由左至右依次为共培养期、愈伤期、侧芽期、生根期、成株期。
图4为wy7调控gus基因转基因三生烟的pcr扩增检测结果；
图中，m：marker2000；wy7：wy7调控gus基因转基因三生烟叶片dna；ck+：转pbi121空载体的转基因三生烟；ck-：野生型三生烟。
图5为启动子wy7重组载体pbi121-wy7的重组根癌农杆菌介导转化的水稻(日本晴)愈伤的gus染色结果；
图中，wy7：pbi121-wy7转化水稻愈伤叶盘的gus染色结果；ck+(camv35s)：由camv35s调控gus基因转录的pbi121空载体转化水稻愈伤的gus染色结果；ck-：未转化的日本晴水稻愈伤的gus染色结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例一、wy7启动子片段的pcr扩增
使用真菌基因组dna提取试剂盒(omega,d3390-01)提取橡胶树白粉菌(海南省热带生物资源可持续利用重点实验室提供)的基因组dna，根据wy7启动子的序列，设计一对特异性扩增引物(上游引物wy7f，加限制性酶切位点hindⅲ和保护碱基，下游引物wy7r，加限制性酶切位点bamhⅰ和保护碱基)。以上述提取的橡胶树白粉菌的基因组dna为模板，使用高保真extaq聚合酶(transgen,ap122)进行pcr扩增。如表1所示。
表1基因启动子扩增的pcr体系
pcr扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性60s，55℃退火50s，72℃延伸60s，进行35个反应循环，最后72℃延伸5min。
其中，上游引物wy7f：cccaagcttttggaggtttctacagcctt，其中下划线代表hindⅲ酶切位点。下游引物wy7r：cgggatcccgcttgtctgaagtttttgc，其中下划线代表bamhⅰ酶切位点。
pcr扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为260bp左右的条带，使用omega琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(目录号：d2500-01)进行纯化回收。
实施例二、pgem-teasy-wy7重组载体的构建
将上述得到的pcr扩增产物进行t/a克隆(pgem-teasy质粒，promega，a1360)转化大肠杆菌(transgen,cd201)，挑取阳性克隆测序，证明准确。
其中，t/a克隆的连接条件如下：
t/a连接体系：10ul
pgem-teasyvector(promega，a137a):1ul
2×rapidligationbuffer:5ul
pcr扩增产物(回收插入片段)：2ul
t4dnaligase:1ul
ddh2o:1ul
先置于室温1小时，然后于4℃连接过夜，得到pgem-teasy-wy7重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：
冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μldh5α(transgene,cd201)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即pgem-teasy-wy7重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴3min，加入600μl4℃预冷的lb培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃220rpm复苏60min，8000rpm离心30s，去上清，留取200μl，用剩下的200μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃棒涂布lb(氨苄青霉素,iptg,x-gal)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养12h～16h。获得含有pgem-teasy-wy7克隆载体的重组大肠杆菌，命名为dh5α-wy7。深圳华大基因科技有限公司对pgem-teasy-wy7克隆载体中的wy7进行测序，测序结果如seqidno：1所示。
测序结果表明，获得的pgem-teasy-wy7克隆载体中wy7启动子序列正确。
实施例三、pbi121-wy7重组载体的构建
将上述构建获得的dh5α-wy7菌株挑取单菌落进行摇菌，37℃220rpm摇菌过夜，用omega质粒小提试剂盒(d6943-01)提取质粒，然后用hindⅲ(neb,r0104s)和bamhⅰ(neb,r0136v)限制性内切酶进行双酶切，酶切产物用omega回收试剂盒(d2500-01)进行回收wy7启动子片段。
将上述得到的回收产物与pbi121质粒(tiannz，60908-750y)进行连接，然后转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序，证明准确。
其中，t/a克隆的连接条件如下：
t/a连接体系：10ul
pbi121vector:1ul
10×t4dnaligasebuffer:1ul
回收产物(wy7启动子片段)：6ul
t4dnaligase(takara，d2011a)：0.5ul
ddh2o:1.5ul
16℃连接过夜，得到pbi121-wy7重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：
冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μldh5α(transgen,cd201)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即pbi121-wy7重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴3min，加入600μl4℃预冷的lb培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃200rpm复苏60min，8000rpm离心30s，去上清，留取200μl，用剩下的200μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃棒涂布lb(卡那霉素)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养16h～24h。获得含有pbi121-wy7克隆载体的重组大肠杆菌，命名为dh5α-pwy7。深圳华大基因科技有限公司对pbi121-wy7克隆载体中的wy7进行测序，测序结果如seqidno：1所示。
测序结果表明，获得的pbi121-wy7克隆载体中wy7启动子序列正确。
实施例四、重组根癌农杆菌lba4404-wy7细胞的制备
将重组大肠杆菌dh5α-pwy7挑取单菌落在含有50ug/ml卡那霉素的液体lb培养基中摇菌，37℃200rpm，生长到od600为0.5左右，与含有协助质粒prk2013的大肠杆菌hb101和受体农杆菌lba4404的感受态细胞等体积混匀，用涂抹棒涂布于不含有任何抗生素固体的lb培养基平板上，28℃培养过夜。用接种针将长出的菌落转接到含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的固体lb培养基平板上，28℃培养3-4天。将长出的单菌落再次转接到含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的固体lb培养基平板上，挑取单菌落用含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的lb液体培养基摇菌，37℃200rpm，以引物对wy7f、wy7r进行菌落pcr验证，同时提取质粒用hindⅲ和bamhⅰ限制性内切酶进行双酶切验证。条带为260bp左右的即为重组根癌农杆菌lba4404-wy7细胞。
实施例五、重组根癌农杆菌介导转化三生烟
1)烟草无菌苗的获得
将三生烟种子装入1.5ml离心管(＜50粒/管)，加入1mlddh2o，放入4℃冰箱，浸泡2到3天进行春化。
春化好的三生烟种子用移液枪吸出ddh2o，加入1ml75％的无水乙醇浸泡2min，用移液枪吸出无水乙醇，用ddh2o反复洗3至5次，洗净种子，每次用ddh2o1ml。然后再用移液枪加入3％的次氯酸钠溶液浸泡种子3min，再用ddh2o洗3至5次，最后用移液枪吸出ddh2o。
用无菌滤纸吸干种子表面的水分，再用吸头将三生烟种子接种于ms固体培养基平板上进行萌发，每皿10—20粒，置于26℃光照培养箱(16h光8h暗)培养一周，光照强度为2000lx(本发明的所有的光照培养均在此光照强度下进行)。三生烟长出幼苗后，转入装有新鲜ms固体培养基的组培瓶，每瓶(φ6cm，h11cm，50ml培养基/瓶)1株烟草小苗，26℃光照培养箱(16h光8h暗)培养3—5周，获得三生烟无菌苗。
剪除三生烟无菌苗的叶片和根，将茎杆剪为带有腋芽的小段，每段长约2—3cm，用枪镊夹住将其形态学下端垂直插入含有新鲜ms固体培养基的组培瓶内。每瓶接种一个带有腋芽的茎段，26℃光照培养3—5周，此即待转化材料。
2)侵染菌液的制备
将重组根癌农杆菌lba4404-wy7挑取单菌落转入含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的lb液体培养基摇菌，28℃200rpm摇菌过夜。吸取少量菌液转入30倍体积的含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的lb液体培养基，相同条件进行复摇。培养至od600为0.6—0.8，即为侵染菌液。
3)侵染
从培养3—5周的无菌三生烟苗上剪取较大的叶片，盛入装有少许ddh2o的无菌培养皿中。
用直径约1cm的打孔器将烟草叶片打成叶圆盘，或者用无菌手术刀将烟草叶片切为边长约1cm的近似正方形的叶盘，放入另一个装有少许ddh2o的无菌培养皿中。
用枪镊将烟草叶盘夹出，放入装有适量侵染菌液的无菌50ml离心管中。轻轻摇动离心管，确保农杆菌充分接触到叶盘边缘的伤口，浸泡10—25min，期间不断摇晃几次。捞出烟草叶盘，转移至干燥的无菌滤纸上，吸干菌液。转接到不含任何抗生素，含有1.0mg/l6-ba和0.1mg/lnaa的ms固体培养基平板中，叶面朝上，每皿接种4—10块叶盘，26℃暗培养2天。
4)筛选
暗培养结束的烟草叶盘转接到含有5—10ug/ml卡那霉素和1.0mg/l6-ba，0.1mg/lnaa和100ug/ml特美汀的ms固体培养基平板中，26℃光照培养。
培养2—4天后，取没有变白的叶盘进行gus染色。37℃染色过夜后以75％乙醇溶液进行脱色三次，除尽叶绿素，拍照。结果如图4所示，经含有启动子wy7的重组载体pbi121-wy7的重组根癌农杆菌介导转化的三生烟叶盘经gus染色后变蓝。结果显示本发明的wy7启动子在双子叶模式植物三生烟中对gus基因具有调控作用。
gus染色液配方：
0.25mmk3fe(cn)6,0.25mmk4fe(cn)6,64mmna2hpo4·12h2o,36mmkh2po4,10mmna2edta,0.1％tritionx-100,10％ch3oh,2.5mg/mlx-gluc。
实施例六、转基因烟草中gus基因的表达
取部分上述转化过的三生烟叶盘继续光照培养，约两周后继代，约四周后出现丛生芽。当丛生芽生长到1—2cm时，用灭菌过的手术刀切下，接种到含有5—10ug/ml卡那霉素和100ug/ml特美汀的1/2ms培养基中，每瓶1株。26℃光照培养约2周。取生根状况良好的烟草小苗，在培养箱里打开组培瓶的盖子，炼苗2—3天。
剪除转基因烟草小苗的大部分叶片，小心洗掉根部大部分培养基，移栽到灭过菌的土壤里，进行盆栽。生长约2—3周，取长出的新叶提取dna进行pcr扩增验证。扩增引物为wy7f、wy7r。扩增产物经1％琼脂糖电泳，结果如图5显示，得到了一条约250bp的条带，与wy7大小一致，转pbi121空载体的阳性对照和三生烟野生型无菌苗则无条带。
实施例七、水稻愈伤组织的诱导和转化
诱导水稻愈伤组织，用重组根癌农杆菌lba4404-wy7转化所述愈伤组织。
1)水稻种子灭菌
将成熟的日本晴水稻种子手工去壳，加70％乙醇处理1—2min，倒净乙醇，用无菌水冲洗三次。加0.1％hgcl2浸泡15min，用无菌水冲洗三次。晾干，备用。
2)水稻愈伤组织的诱导和继代
将消毒后的含胚米粒接种到n6d培养基上，29℃生化培养箱培养2周左右，诱导愈伤组织产生。
将长出的水稻愈伤组织从种子上剥离，转接到新的n6d培养基上，继代培养。大约每两周继代一次。
3)农杆菌lba4404-wy7的活化及转化菌液制备
挑选黄白色，干燥的活跃愈伤组织，接种到新的n6d培养基上培养三天。
挑取重组根癌农杆菌lba44o4-wy7的单菌落，在含50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的液体ym/yep/lb培养基上中，28℃，250rpm震荡培养至od600＝0.8—1.0。
吸取1ml培养好的菌液加入50ml含50ug/ml的卡那霉素的ym/yep/lb液体培养基中，继续培养至od600＝0.8—1.0。4℃，4000rpm离心，沉淀菌体，然后用含适量ms重悬菌液至od600＝0.5左右，备用。
4)转化
将继代培养的水稻愈伤组织放入灭菌培养皿中，将lba4404-wy7重悬液倒入培养皿，浸泡水稻愈伤组织15—30min。将水稻愈伤组织移出放在灭菌滤纸上，滤掉多余液体。n6共培养基上放一张灭菌滤纸。将水稻愈伤组织放到滤纸上，密封培养，28℃暗培养48—60小时。
5)筛选
将受感染的水稻愈伤组织用1％的甘露醇溶液清洗3—4次，然后用无菌水振荡清洗3—4次，直到上清液变澄清。最後用300mg/l的头孢霉素或者500mg/l的羧苄青霉素的无菌水溶液清洗3—4次。将愈伤组织放在无菌滤纸上，除去多余水分。最后将愈伤组织接种到含有5—10ug/ml的卡那霉素和300mg/l的头孢霉素或者500mg/l的羧苄青霉素的n6培养基上，密封，29℃暗培养，约两周继代一次。
实施例八：日本晴水稻愈伤组织中的gus基因的表达
将用lba4404-wy7转化的水稻愈伤组织进行gus染色。
gus染色液的配方(1ml)：0.25mmk3fe(cn)6,0.25mmk4fe(cn)6,64mmna2hpo4·12h2o,36mmkh2po4,10mmna2edta,0.1％tritionx-100,10％ch3oh,2.5mg/mlx-gluc。
用lba4404-wy7转化的水稻愈伤组织于37℃浸泡在gus染色液中，过夜。
拍照，结果如图5所示，含有重组载体pbi121-wy7的根癌农杆菌介导转化的日本晴水稻愈伤组织gus染色后变蓝色。不含重组载体pbi121-wy7的根癌农杆菌介导转化的日本晴水稻愈伤组织gus染色后颜色不变。结果表明，本发明的wy7启动子对gus基因的表达具有调控作用。
表2ms培养基配方
ph调至5.8，121℃灭菌20min。
表3n6培养基配方
ph调至5.2，121℃灭菌20min。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
序列表
<110>海南大学
<120>橡胶树白粉菌内源启动子wy7及其用途
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>251
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
attggaggtttctacagcctttctgccagccactctattgcattctctaatagtttcgat60
ctccaatctcccccatttagtccaaaagtctgtggggctttttttttctaaatcttttag120
ttattttgttagttagttggtgtcactatcctgttttttaggggcctattatccgaattt180
tgatgaattgtgattggatgtaatcggtttatatatttccaacattaaaaagcaaaaact240
tcagacaagcg251
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ttggaggtttctacagcctt20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cgcttgtctgaagtttttgc20