本发明涉及生物芯片技术领域，具体地说，是一种蜕膜和绒毛配对cdna芯片。
背景技术：
生物芯片是指包被在硅片、尼龙膜等固相支持物上的高密度组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分的高通量微阵列。利用高通量生物芯片，通过特异性分子杂交及染色技术，对受检样本进行检测，可准确、快速获取大量的分子检测信息。目前已广泛应用于生命科学研究、临床医学分子诊断、以及生物抗体靶向药物筛查和验证等领域。
正常妊娠是一个复杂的生理过程，胎儿虽携有遗传自父系的hla抗原，但却并未引发母体产生针对胎儿这种特殊半同种“天然移植物”的排斥。妊娠期母-胎间存在着复杂的分子对话机制，以维持胎儿胎盘正常发育。妊娠早期胎儿绒毛外滋养细胞(evt)侵入蜕膜组织，与母体蜕膜免疫细胞(dic)及蜕膜基质细胞(dsc)直接接触，形成精细调控的母-胎界面。母-胎界面主要由3种细胞构成：胚胎来源的滋养细胞(trophoblast,tro)，母体来源的蜕膜基质细胞(decidualstromalcell,dsc)和蜕膜免疫细胞(decicidualimmunecell,dic)。作为母-胎界面唯一携带有父系抗原的滋养细胞，其侵袭与迁移是胚泡着床、胎盘发育，并建立母-胎关系的关键步骤。蜕膜基质细胞除参与蜕膜营养供应之外，还分泌多种活性分子调节胚泡着床与胎盘发育，并作为免疫潜能细胞，参与抗原提呈和分泌细胞因子，发挥重要的免疫调节作用。蜕膜免疫细胞是母-胎免疫耐受的基础，通过表达特殊的活化标记和分泌大量的细胞因子，在母-胎界面局部发挥着不同于外周的免疫调节作用。正常生理妊娠时母-胎界面呈现th2型免疫优势和调节性t细胞(regulatorytcells,treg)扩增现象，一旦这种耐受状态被打破，th1型免疫反应占优势，将导致妊娠失败或妊娠并发症如复发性流产、子痫前期等。
对母-胎界面形成的深入研究是揭示正常妊娠维持机制和病理妊娠发病机制的重要途径和手段。
中国专利文献cn103614473a公开了一种桔小实蝇抗敌百虫和高效氯氰菊酯抗药性水平检测cdna芯片及其制作方法和应用。中国专利文献cn101235420a公开了一种斑茅抗旱cdna表达谱芯片及其应用。中国专利文献cn101245386a公开了一种用于多种肿瘤抑瘤基因检测的cdna芯片。中国专利文献cn101942515a公开了一种检测茶树次生代谢相关基因表达信息的cdna芯片。目前尚没有利用蜕膜和绒毛组织制备组织cdna芯片的技术及应用的专利和文献报道。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种蜕膜和绒毛配对cdna芯片。
本发明的再一的目的是，提供一种蜕膜和绒毛配对cdna芯片的制备方法。
本发明的另一的目的是，提供一种蜕膜和绒毛配对cdna芯片的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种蜕膜和绒毛配对cdna芯片，所述的cdna芯片通过如下方法制得：取蜕膜和绒毛组织，提取其rna，逆转录成cdna，预置在pcr反应板内，制作成cdna芯片。
进一步地，所述的pcr反应板为96孔或384孔。
进一步地，所述的蜕膜和绒毛组织为孕早期流产妇女的蜕膜和绒毛组织。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的制备方法包括以下步骤：取孕早期流产妇女的蜕膜和绒毛组织，提取其rna，逆转录成cdna，预置在pcr反应板内，制作成cdna芯片。
进一步地，提取rna的方法按照rna提取试剂盒oligotextm进行。
进一步地，逆转录成cdna的方法按照stratagene公司cdna文库构建系列试剂盒说明书进行。
进一步地，将制备好的cdna芯片置于湿盒中水化，取出置90～120℃平台烘30秒至1分钟后，再紫外光照射10～40分钟固定。
进一步地，制作cdna芯片的点样液为2×ssc缓冲液、50％二甲基亚砜、3×ssc+1.5mol/l甜菜碱或150mmol/l磷酸钠。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的cdna芯片在制备检测基因表达的产品中的应用。
进一步地，所述的产品用于病理妊娠病因筛查及分子分型、新型标志物筛选与验证、个体化治疗患者筛选以及疗效和预后判断；所述病理妊娠为妊娠时限异常、异位妊娠、妊娠特有疾病、妊娠晚期出血或其它妊娠性疾病，所述妊娠时限异常包括流产、早产和过期妊娠，所述妊娠特有疾病包括妊娠高血压疾病、妊娠剧吐，所述妊娠晚期出血包括前置胎盘和胎盘早剥，所述其它妊娠性疾病包括羊水量异常、胎儿窘迫、胎膜早破、多胎妊娠和母儿血型不合。
本发明优点在于：
1、每一位流产妇女分别取其蜕膜和绒毛组织cdna形成配对，集中在同一芯片上，实现生理结构上的母-胎界面在体外芯片上功能呈现。
2、高通量，一张芯片至少可以集成45例患者蜕膜和绒毛配对组织cdna，一次即获大量信息，成百上千倍地提高效率。
3、特异性强、敏感性高、操作简单快速、定量准确性高、结果可靠性强、结果分析简单并且样本带有完整的病例临床信息等优势，可用于定量检测目的基因在不同病人的表达情况及进行深入的临床信息相关性分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明取孕早期流产妇女的蜕膜和绒毛组织，提取其rna，逆转录成cdna，预置在pcr反应板(96孔或384孔)内，制作成cdna芯片，为一种通过实时荧光定量的方法来检测目的基因的表达的cdna阵列。其特点：1)每一位流产妇女分别取其蜕膜和绒毛组织cdna形成配对，集中在同一芯片上，实现生理结构上的母-胎界面在体外芯片上功能呈现；2)高通量，一张芯片至少可以集成45例患者蜕膜和绒毛配对组织cdna，一次即获大量信息，成百上千倍地提高效率；3)特异性强、敏感性高、操作简单快速、定量准确性高、结果可靠性强、结果分析简单并且样本带有完整的病例临床信息等优势，可用于定量检测目的基因在不同病人的表达情况及进行深入的临床信息相关性分析。
实施例1cdna芯片的制备(一)
1、人蜕膜组织rna的提取
收集清宫术中蜕膜和绒毛组织，记录患者的年龄、bmi、流产次数、治疗方案、内分泌、自身抗体、血凝，免疫、染色体筛查或遗传性易栓症筛查的资料参数，建立临床资料数据库。采用rna提取试剂盒oligotextm直接从孕早期流产妇女的蜕膜、绒毛组织中提取rna。所用的蜕膜、绒毛组织来自上海市第一妇婴保健院(要求：月经周期规律28～32天，末次月经确切，无腹痛及阴道流血史，无避孕药史和抗早孕药史)。整个取材过程严格遵守无菌操作。提取的rna的方法及步骤应严格参照rna提取试剂盒oligotextm进行。
2、cdna文库的构建
按照stratagene公司cdna文库构建系列试剂盒说明书完成。利用上述合成的mrna为模板、oligo(dt)为引导、逆转录酶rt的催化，合成cdna第一条链；用cdna合成酶i进行第二条链的合成。然后，用pfudna聚合酶修饰cdna末端。再在末端连接ecori连接子，并用t4多核苷酸激合酶磷酸化ecori末端。使其能与其后的非磷酸化ecori位点相连。灭活t4多核苷酸激合酶活性。用xhoi酶消化cdna，使其分裂成为小片段，用乙醇沉淀后溶于1×ste缓冲液中。用sepharosecl-2b凝胶过滤柱对cdna进行凝胶过滤层析，分步收集样品，合并较大的cdna片段。利用eb平皿鉴定所获得的cdna片段的质量。
将cdna片段与uni-zapxr载体连接。用zap-cdnagigapackiiigoldcloningkit试剂盒对连接产物进行包装，形成包装噬菌体颗粒。先用该试剂盒所提供的vcs257细菌和野生型dna作预实验，以检测该试剂盒的包装效率。再培养xl1-bluemrf’宿主菌，用包装产物感染宿主菌，铺于琼脂平板。
3、cdna芯片的制作
取cdna溶液或pcr产物10μl，加入2×ssc缓冲液3μl混匀，转移至96孔板中，将板置于自动点样机平台上，按顺序以2000点/cm2的密度在载玻片上制作cdna芯片。将制备好的cdna芯片置于湿盒中水化5～10分钟，取出置90～120℃平台烘30秒至1分钟后，面朝下置于uv透射分析仪上，以功率为0.5mw/cm2的320nm紫外光照射10～40分钟固定。
实施例2cdna芯片的制备(二)
1、人蜕膜组织rna的提取
收集清宫术中蜕膜和绒毛组织，记录患者的年龄、bmi、流产次数、治疗方案、内分泌、自身抗体、血凝，免疫、染色体筛查或遗传性易栓症筛查的资料参数，建立临床资料数据库。采用rna提取试剂盒oligotextm直接从孕早期流产妇女的蜕膜、绒毛组织中提取rna。所用的蜕膜、绒毛组织来自上海市第一妇婴保健院(要求：月经周期规律28～32天，末次月经确切，无腹痛及阴道流血史，无避孕药史和抗早孕药史)。整个取材过程严格遵守无菌操作。提取的rna的方法及步骤应严格参照rna提取试剂盒oligotextm进行。
2、cdna文库的构建
按照stratagene公司cdna文库构建系列试剂盒说明书完成。利用上述合成的mrna为模板、oligo(dt)为引导、逆转录酶rt的催化，合成cdna第一条链；用cdna合成酶i进行第二条链的合成。然后，用pfudna聚合酶修饰cdna末端。再在末端连接ecori连接子，并用t4多核苷酸激合酶磷酸化ecori末端。使其能与其后的非磷酸化ecori位点相连。灭活t4多核苷酸激合酶活性。用xhoi酶消化cdna，使其分裂成为小片段，用乙醇沉淀后溶于1×ste缓冲液中。用sepharosecl-2b凝胶过滤柱对cdna进行凝胶过滤层析，分步收集样品，合并较大的cdna片段。利用eb平皿鉴定所获得的cdna片段的质量。
将cdna片段与uni-zapxr载体连接。用zap-cdnagigapackiiigoldcloningkit试剂盒对连接产物进行包装，形成包装噬菌体颗粒。先用该试剂盒所提供的vcs257细菌和野生型dna作预实验，以检测该试剂盒的包装效率。再培养xl1-bluemrf’宿主菌，用包装产物感染宿主菌，铺于琼脂平板。
3、cdna芯片的制作
取cdna溶液或pcr产物10μl，加入50％二甲基亚砜3μl混匀，转移至96孔板中，将板置于自动点样机平台上，按顺序以2000点/cm2的密度在载玻片上制作cdna芯片。将制备好的cdna芯片置于湿盒中水化5～10分钟，取出置90～120℃平台烘30秒至1分钟后，面朝下置于uv透射分析仪上，以功率为0.5mw/cm2的320nm紫外光照射10～40分钟固定。
实施例3cdna芯片的制备(三)
1、人蜕膜组织rna的提取
收集清宫术中蜕膜和绒毛组织，记录患者的年龄、bmi、流产次数、治疗方案、内分泌、自身抗体、血凝，免疫、染色体筛查或遗传性易栓症筛查的资料参数，建立临床资料数据库。采用rna提取试剂盒oligotextm直接从孕早期流产妇女的蜕膜、绒毛组织中提取rna。所用的蜕膜、绒毛组织来自上海市第一妇婴保健院(要求：月经周期规律28～32天，末次月经确切，无腹痛及阴道流血史，无避孕药史和抗早孕药史)。整个取材过程严格遵守无菌操作。提取的rna的方法及步骤应严格参照rna提取试剂盒oligotextm进行。
2、cdna文库的构建
按照stratagene公司cdna文库构建系列试剂盒说明书完成。利用上述合成的mrna为模板、oligo(dt)为引导、逆转录酶rt的催化，合成cdna第一条链；用cdna合成酶i进行第二条链的合成。然后，用pfudna聚合酶修饰cdna末端。再在末端连接ecori连接子，并用t4多核苷酸激合酶磷酸化ecori末端。使其能与其后的非磷酸化ecori位点相连。灭活t4多核苷酸激合酶活性。用xhoi酶消化cdna，使其分裂成为小片段，用乙醇沉淀后溶于1×ste缓冲液中。用sepharosecl-2b凝胶过滤柱对cdna进行凝胶过滤层析，分步收集样品，合并较大的cdna片段。利用eb平皿鉴定所获得的cdna片段的质量。
将cdna片段与uni-zapxr载体连接。用zap-cdnagigapackiiigoldcloningkit试剂盒对连接产物进行包装，形成包装噬菌体颗粒。先用该试剂盒所提供的vcs257细菌和野生型dna作预实验，以检测该试剂盒的包装效率。再培养xl1-bluemrf’宿主菌，用包装产物感染宿主菌，铺于琼脂平板。
3、cdna芯片的制作
取cdna溶液或pcr产物10μl，加入3×ssc+1.5mol/l3μl混匀，转移至96孔板中，将板置于自动点样机平台上，按顺序以2000点/cm2的密度在载玻片上制作cdna芯片。将制备好的cdna芯片置于湿盒中水化5～10分钟，取出置90～120℃平台烘30秒至1分钟后，面朝下置于uv透射分析仪上，以功率为0.5mw/cm2的320nm紫外光照射10～40分钟固定。
实施例4cdna芯片的制备(四)
1、人蜕膜组织rna的提取
收集清宫术中蜕膜和绒毛组织，记录患者的年龄、bmi、流产次数、治疗方案、内分泌、自身抗体、血凝，免疫、染色体筛查或遗传性易栓症筛查的资料参数，建立临床资料数据库。采用rna提取试剂盒oligotextm直接从孕早期流产妇女的蜕膜、绒毛组织中提取rna。所用的蜕膜、绒毛组织来自上海市第一妇婴保健院(要求：月经周期规律28～32天，末次月经确切，无腹痛及阴道流血史，无避孕药史和抗早孕药史)。整个取材过程严格遵守无菌操作。提取的rna的方法及步骤应严格参照rna提取试剂盒oligotextm进行。
2、cdna文库的构建
按照stratagene公司cdna文库构建系列试剂盒说明书完成。利用上述合成的mrna为模板、oligo(dt)为引导、逆转录酶rt的催化，合成cdna第一条链；用cdna合成酶i进行第二条链的合成。然后，用pfudna聚合酶修饰cdna末端。再在末端连接ecori连接子，并用t4多核苷酸激合酶磷酸化ecori末端。使其能与其后的非磷酸化ecori位点相连。灭活t4多核苷酸激合酶活性。用xhoi酶消化cdna，使其分裂成为小片段，用乙醇沉淀后溶于1×ste缓冲液中。用sepharosecl-2b凝胶过滤柱对cdna进行凝胶过滤层析，分步收集样品，合并较大的cdna片段。利用eb平皿鉴定所获得的cdna片段的质量。
将cdna片段与uni-zapxr载体连接。用zap-cdnagigapackiiigoldcloningkit试剂盒对连接产物进行包装，形成包装噬菌体颗粒。先用该试剂盒所提供的vcs257细菌和野生型dna作预实验，以检测该试剂盒的包装效率。再培养xl1-bluemrf’宿主菌，用包装产物感染宿主菌，铺于琼脂平板。
3、cdna芯片的制作
取cdna溶液或pcr产物10μl，加入150mmol/l磷酸钠点样液3μl混匀，转移至96孔板中，将板置于自动点样机平台上，按顺序以2000点/cm2的密度在载玻片上制作cdna芯片。将制备好的cdna芯片置于湿盒中水化5～10分钟，取出置90～120℃平台烘30秒至1分钟后，面朝下置于uv透射分析仪上，以功率为0.5mw/cm2的320nm紫外光照射10～40分钟固定。
实施例5cdna芯片的评价
将实施例1-4制备的cdna芯片与cy5标记探针杂交，对扫描图像进行分析：实施例1-实施例4点的形状均较为规则，其中，实施例1最规则；实施例1-4的dna固定效率均较高(＞50％)，其中，实施例1的固定效率最高(95％)。实施例1点样时间短，点的形状规则，固定效率高。
实施例6cdna芯片的应用
将获得的蜕膜和绒毛配对的mrna进行标记，加至实施例1中制作获得的cdna芯片上进行杂交，利用正常妊娠妇女蜕膜和绒毛组织在cdna芯片上差异表达来寻找目的基因。
1、样品的标记
分别提取正常妊娠和孕早期流产妇女的蜕膜和绒毛组织中的总mrna，然后再反转录时分别用cy3和cy5进行荧光标记，然后将分别标记的荧光样品1:1混合备用。
2、杂交和检测
取标记好的样品溶液加至预先热变性的cdna芯片上，盖上盖玻片置于湿盒中杂交5小时，然后置于2×ssc，0.1％sds溶液中洗5分钟，0.1×ssc，0.1％sds溶液中洗5分钟，0.1×ssc溶液中荡洗数遍，晾干。
将杂交完毕晾干的cdna微阵列芯片用激光共聚焦扫描仪在适当条件下扫描检测其杂交信号。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。