同时检测三种鱼类病毒的多重PCR引物组、试剂盒及方法与流程

本发明属于水产病害微生物检测技术领域，具体涉及一种可同时检测鳗鲡疱疹病毒(eelherpesvirus，ehv)、日本鳗鲡表皮细胞坏死病毒(japaneseeelendothelialcells-infectingvirus，jeecv)和花鳗鲡多瘤病毒(anguillamarmoratapolyoma-likevirus，ampv)三种dna病毒的多重pcr引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术：

我国是世界主要的鳗鲡养殖国家之一，其产值在我国的水产品出口贸易中占有重要地位。养殖的品种主要日本鳗鲡(a.japonica)、欧洲鳗鲡(a.anguilla)、美洲鳗鲡(a.rostrata)、花鳗鲡(a.marmorata)。由于大规模的集约化养殖，重大病毒性疫病爆发日益频繁，造成巨额的经济损失。明确疾病的的致病病原是有效开展疾病防控的重要前提。我们率先在国内建立了多种鳗鲡病毒的检测方法，开展了相关病毒的流行病学调查。鳗鲡疱疹病毒(eelherpesvirus,ehv)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(japaneseeelendothelialcells-infectingvirus,jeecv)和花鳗鲡多瘤病毒(anguillamarmoratapolyoma-likevirus，ampv)同属于dna病毒，这三种病毒对鳗鲡的致病性均表现为烂鳃、出血等症状，在临床诊断上难以区分。我们分别建立了这三种病毒的pcr检测方法，分别检测耗时费力；同时，也多次发现它们有混合感染的情况。

ehv是一种具有囊膜的双链dna病毒，曾给多国欧洲鳗鲡和日本鳗鲡的养殖业者造成巨大经济损失，其也是引起野生欧洲鳗鲡减少的重要因素。我们前期的研究表明，其可在欧洲鳗鲡、日本鳗鲡、美洲鳗鲡和花鳗鲡上检出。临床和病理学研究表明，ehv可引起“烂鳃”、“脱粘”、“红头”等典型症状。但现有的pcr检测都是根据ehv的dna聚合酶基因序列设计引物，因dna聚合酶基因高度保守，在检测时可能会检出鳗鲡虹彩病毒，表现为ehv假阳性。

jeecv是一种双链环状dna病毒，具有与多瘤病毒的大t抗原基因同源且高度保守的ltlg基因,是日本鳗鲡内皮细胞坏死病(viralendothelialcellnecrosisofeel,vecne)的致病病原。自上世纪80年代，vecne就经常爆发，给日本鳗鲡的养殖业者造成巨大经济损失。其致病的典型症状包括鳗鲡的鳍条变红，腹部膨胀，鳃、肝脏充血等。我们在国内首次建立了jeecv的pcr检测方法，并成功应用于疾病的诊断。

ampv与jeecv一样，具有多瘤病毒的ltlg基因。序列分析表明，我们从患病的花鳗鲡中扩增到的序列与中国台湾分离的ampv有较大差异，同源性为94％。ampv可引起花鳗鲡烂鳃、体表出血等典型症状。

因此，亟需提供一种检测这三种病毒的多重pcr引物组，发明检测试剂盒及优化实验条件，实现这三种病毒的同时检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种方便快捷、特异性强、准确率高、且能同时检测鳗鲡疱疹病毒(eelherpesvirus，ehv)、日本鳗鲡表皮细胞坏死病毒(japaneseeelendothelialcells-infectingvirus，jeecv)和花鳗鲡多瘤病毒(anguillamarmoratapolyoma-likevirus，ampv)的多重pcr检测方法。

为实现上述目的，本发明提供一种在同一pcr反应体系中同时检测ehv，jeecv和ampv的多重pcr引物组及多重pcr检测试剂盒，并通过以下技术方案实现：

本发明根据获得的的核酸序列，设计用于扩增ehv，jeecv和ampv的特异性引物，避免引物之间形成稳定的引物二聚体，并对引物扩增序列的特异性进行分析，获得由6条核酸序列组成，可同时对ehv，jeecv和ampv具有高的扩增灵敏性和特异性的引物组，包括：seqidno：1-6；具体的，可以分为由seqidno.1、seqidno.2所示的核苷酸序列组成的用于检测ehv的引物组1，由seqidno.3、seqidno.4所示的核苷酸序列组成的用于检测jeecv的引物组2和由seqidno.5、seqidno.6所示的核苷酸序列组成的用于检测ampv的引物组3组成。

引物对的特异性检测结果表明，该pcr反应体系特异性好。检测ehv的引物组1对锦鲤疱疹病毒(koiherpesvirus，khv)、鳗鲡虹彩病毒(eeliridovirus，eiv)等同源性较近的病毒无非特异性扩增，检测jeecv的引物组2对ampv无特异性扩增，检测ampv的引物组3对jeecv无特异性扩增。

引物对的灵敏性试验结果表明，该多重pcr检测方法均可以检测最低10个拷贝的ehv，jeecv和ampv。

ehv，jeecv和ampv多重pcr检测试剂盒包括上述6条核酸序列组成的引物组，pcr缓冲液，dntp，taqdna聚合酶，ddh2o及阳性对照dna质粒组成。其中，阳性对照质粒为连接pmd19-t载体的ehv，jeecv和ampv的扩增序列，浓度均为108拷贝/μl，扩增的dna序列如下：

ehv质粒pmd19-ehv的插入序列为seqidno.7；

jeecv质粒pmd19-jeecv的插入序列为seqidno.8；

ampv质粒pmd19-ampv的插入序列为seqidno.9。

用上述检测引物组及检测试剂盒进行ehv，jeecv和ampv的多重pcr检测的方法如下：

制备待测样品dna模板

利用组织基因组dna提取试剂盒或病毒基因组dna提取试剂盒提取待检样品中的基因组dna。

pcr检测

取2μl上述方法中提取的样品dna作为pcr模板，在冰上配制如下pcr反应体系：

置于pcr仪进行pcr扩增，扩增条件为：

预变性：94℃3分钟；

循环：94℃变性10秒，60℃退火15秒，72℃延伸45秒，40个循环；

延伸：72℃5分钟；

结果判定

取10μlpcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行电泳，如果电泳结果在240bp位置有扩增条带，表示病料中具有ehv；如果电泳结果在505bp位置有扩增条带，表示病料中具有jeecv；如果电泳结果在793bp位置有扩增条带，表示病料中具有ampv。如果电泳结果同时出现多条条带，表示病料中具有与条带大小对应病毒的混合感染。如果在上述三处位置均无可见扩增条带，表示病料中无上述三种病毒。

本发明还包括引物组在制备同时检测鳗鲡疱疹病毒ehv、日本鳗鲡表皮细胞坏死病毒jeecv和花鳗鲡多瘤病毒ampv的制品中的应用。所述的制品包括用于检测三种鱼类病毒的试剂盒、基因探针、基因芯片等。其中，基因探针、基因芯片的制作方法可参考现有技术。

本发明提供的多重pcr检测引物组、检测试剂盒及检测方法，可在同一pcr反应体系中同时检测和鉴别ehv，jeecv和ampv，具有操作简便，特异性强等优点；而且本发明可根据扩增长度的不同直接判定结果，更高效、实用。

附图说明

图1是利用引物组1、引物组2、引物组3进行扩增特异性鉴定的电泳图。m：dl2000标准分子量marker；1：ehv；2：khv；3：eiv；4：jeecv；5：ampv；6：ampv；7：jeecv；

图2是利用引物组和试剂盒鉴定ehv，jeecv，ampv的电泳图。m：dl2000标准分子量marker；1：ehv；2：jeecv；3：ampv；

图3是利用引物组和试剂盒鉴定ehv，jeecv，ampv的灵敏度电泳图。m：dl2000标准分子量marker；1：108copies；2：107copies；3：106copies；4：105copies；5：104copies；6：103copies；7：102copies；8：100copies；9：阴性对照；

图4是利用上述引物组和试剂盒鉴定ehv,jeecv，ampv病料的电泳图。m：dl2000标准分子量marker；1：阳性对照；2：ehv和jeecv混合感染；3：ehv和ampv混合感染；4：ehv；5：jeecv；6：ampv；7：未检出病料；8：阴性对照；

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

(1)引物的设计与优化

细胞分离、鉴定了8株ehv，克隆了ehvorf8、orf95等6个基因的开放阅读框序列，分析其同源性，在保守区设计了6对引物，扩增产物的大小均设定在约250bp。以细胞分离培养的ehvdna为模板，以常规的pcr方法进行pcr扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析。筛选出扩增效率高的引物组1。

细胞分离、鉴定了3份jeecv阳性病料，克隆了jeecvltlg的开放阅读框序列，分析其同源性，在保守区设计设计了2对引物，扩增产物的大小设定在约500bp。以jeecv阳性病料中提取的基因组dna为模板，以常规的pcr方法进行pcr扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析。筛选出扩增效率高的引物组2。

细胞分离、鉴定了5份ampv阳性病料，克隆了ampvltlg的开放阅读框序列，分析其同源性，利用软件primerprimer5.0在保守区设计了2对引物，扩增产物的大小设定在约750bp。以ampv阳性病料中提取的基因组dna为模板，以常规的pcr方法进行pcr扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析。筛选出扩增效率高的引物组3。

(2)病料中基因组dna的提取

收集鳗鲡疑似病毒性疾病病料，取肝、脾、肾等内脏组织，匀浆后用组织dna提取试剂盒提取基因组dna。

(3)多重pcr检测的特异性

为检测上述引物组扩增的特异性，用与ehv同源性较高的khv、eiv为模板检测引物组1扩增ehv的特异性；因为jeecv与ampv的亲缘关系近，且未见其它鱼类多瘤病毒的报道，因此分别以jeecv和ampv阳性病料中提取的基因组dna为模板检测引物组2扩增jeecv的特异性以及引物组3扩增ampv的特异性。结果表明，检测ehv的引物组1仅能特异性扩增ehv，不能扩增khv、eiv；检测jeecv的引物组2仅能特异性扩增jeecv，不能扩增ampv；检测ampv的引物组3仅能特异性扩增ampv，不能扩增jeecv(如图1所示)。

(4)多重pcr检测方法的建立

将引物组1、引物组2、引物组3按照1：1：1的比例混合，终浓度均为10μm。分别在退火温度55、60、65条件下进行pcr扩增，然后通过扩增条件优化，建立如下多重pcr检测方法：10xpcrbuffer(mg2+plus)5μl、dntp(2.5mmeach)4μl、taqdnapolymerase(5u/μl)0.5μl、引物组2μl、补充ddh2o至50μl。置于pcr仪进行pcr扩增，扩增条件为：预变性：94预变性：94℃3分钟；循环：94℃变性10秒，60℃退火15秒，72℃延伸45秒，40个循环；延伸：72℃5分钟。取10μlpcr产物，经1％琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察拍照。以本发明建立的检测方法对细胞培养ehv及jeecv、ampv阳性病料进行检测，结果均可高效检出相应病毒，未发现非特异性条带(如图2所示)。

(5)多重pcr的灵敏度

分别将用引物组1、引物组2、引物组3扩增的ehv、jeecv、ampv序列连接至克隆载体pmd19-t，测序验证后，测定dna含量，计算拷贝数，然后将三种质粒按照拷贝数1：1：1混合，浓度为108拷贝/μl，作为试剂盒的阳性对照。将阳性对照进行10倍的梯度稀释，用建立的多重pcr检测方法进行检测。结果表明，该方法可特异性检出最低10个拷贝的ehv、jeecv、ampv(如图3所示)。

(6)多重pcr检测的阳性鳗鲡病料

为验证上述多重pcr检测方法的有效性，选择用常规pcr方法检测ehv、jeecv、ampv阳性的病料、混合感染病料及未检出病料，用上述多重pcr检测方法对病料进行检测，分别检出ehv、jeecv、ampv阳性病料，及ehv和jeecv、ehv和ampv混合感染的阳性病料，结果与用常规pcr方法检测的结果完全一致(如图4所示)。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院生物技术研究所

<120>同时检测三种鱼类病毒的多重pcr引物组、试剂盒及方法

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