SNP检测技术拆分混合样本的方法与流程

本发明属于生物技术领域，尤其法医学dna个体识别中的混合样本拆分。

背景技术：

目前法医学dna个体识别和亲子鉴定领域，主要是以str为生物标志物，伴随新一代高通量基因检测技术的发展，以snp为生物标志物的法医学应用开始崭露头角。

目前法医学领域中存在三大疑难检材：1.混合样本：性侵案件中的混合精斑，尤其无精子精斑，凶器上的混合血斑等等，多个样本的dna信号彼此干扰，无法确定嫌疑人；2.降解样本：年代久远的骨骼样本，高腐样本，水泡样本等等，dna降解为200bp以下片段时，由于片段太短，实验建库失败；3.痕量样本：犯罪现场得到的证据往往是蛛丝马迹，一个指纹，用过的橡胶手套等等，dna起始量太少只有痕量水平的情况，实验建库仍然会失败。

str短串联重复序列(shorttandemrepeat，str)又称微卫星dna(microsatellitedna)，是一类广泛存在于人类基因组中的dna多态性基因座。它由2-6碱基对构成核心序列，呈串联重复排列，str基因位点长度一般在100-300bp之间，因个体间dna片断长度或dna序列差异而成高度多态性，在基因传递过程中遵循孟德尔遗传方式，因其基因片段短、扩增效率高、判型准确等特点，已广泛应用于法医学个体识别和亲子鉴定等领域。

snp单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。snp在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

dna个体识别，通过分析生物标志物str是否能够匹配来确认。用于刑事案件dna物证鉴定，依赖公安系统的str数据库，该数据库目前仍在不断累积、更新。

dna亲子鉴定是根据法医学、生物学和遗传学的理论，通过分析子代和亲代的生物标志物str是否符合遗传特征，来判断父母与子女之间是否是亲子关系。检测流程包括：1.dna提取：提取样本细胞核中dna，纯化(去除蛋白质等杂质)；2.pcr扩增：dna目标片段(str所在序列)通过聚合酶链式反应(pcr)，在pcr仪上进行大量复制，达到富集扩增效果；3.加检测标志物：dna双链解开，添加特定检测标志物(用来标记检测的片段长度)；4.毛细管测序仪检测：dna带有电荷，通过毛细管电泳测序仪，在同样的电压、电泳时间条件下，dna片段长度不同导致电泳速度不同，检测标志物显示的位置也不同；5.分析数据，出具报告：根据“孩子”，“父亲”，“母亲”的str检测结果是否符合遗传特征，来判断父母与子女之间是否是亲子关系。这样的方法需要对待测的三者分别取样，进行比对，其中的“孩子”需要是独立的个体才能准确取样。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种snp检测技术拆分混合样本的方法，尤其为了解决混合样本(尤其2人混合)的问题，使用高通量测序平台建库分析snp集合，能准确拆分混合样本(尤其2人混合)。

本发明采用的技术方案是：一种混合snp集合数据拆分方法，具体操作步骤如下：

步骤一：假设混合样本包括a、b两个样本，混合比例为x0：(100-x0)，x0<＝50且x0>＝0；

步骤二：取n个snp位点对混合样本进行检测获得混合样本snp集合，获得a、b两个样本共计2n个基因型，并获得每个snp位点的突变频率y；

步骤三：对于每个snp位点的突变频率y，a、b混合比例为9种，具体如下：

a.2*y＝x1*gt0+(100-x1)*gt0

b.2*y＝x2*gt0+(100-x2)*gt1

c.2*y＝x3*gt0+(100-x3)*gt2

d.2*y＝x4*gt1+(100-x4)*gt0

e.2*y＝x5*gt1+(100-x5)*gt1

f.2*y＝x6*gt1+(100-x6)*gt2

g.2*y＝x7*gt2+(100-x7)*gt0

h.2*y＝x8*gt2+(100-x8)*gt1

i.2*y＝x9*gt2+(100-x9)*gt2

其中，gt0代表无突变为0，gt1代表杂合突变为1，gt2代表纯合突变为2；

取9n个x的众数作为混合样本中a样品混合比例x0；

步骤四：样本a混合比例x0，带入到y对应的9个公式中(x1到x9都替换为x0)，得到使等式两边差值最小的(gtai,gtbi)作为a、b样本在该位点i的基因型。重复此方法得到n个位点的snp集合基因型。

2根据权利要求1所述的一种snp集合数据拆分混合样本的方法，其特征在于：所述snp位点数目n不少于80个。

3根据权利要求1所述的一种snp集合数据拆分混合样本的方法，其特征在于：所述snp位点标记上游引物核苷酸序列如seqidno.1-100所示，所述snp位点标记下游引物核苷酸序列如seqidno.101-200所示。

4一种基于权利要求1-3所述的snp集合数据拆分方法的snp检测技术拆分混合样本的方法，其特征在于：步骤如下：

步骤1提取混合样本基因组dna，通过多重反应pcr的方法富集目标dna片段；

步骤2构建dna片段文库，制备ngs测序模板，通过ngs进行dna片段测序；

步骤3根据权利要求1所述的一种snp集合数据拆分混合样本的方法，得到样本a,b各自的snp集合基因型；

步骤4得到已知样本a的snp集合基因型，就可以推断出混合的未知样本b的snp集合基因型；

优选地，混合样本为孕妇外周血、刑事案件样本或器官移植患者血液样本。

snp检测技术拆分混合样本的方法在刑事案件样本鉴定中的应用，混合样本为刑事案件样本时，通过混合snp集合数据拆分方法将混合snp集合进行拆分和分析，判断混合样本为2人及以上混合样本，已知样本包括受害人snp集合，通过比对得出嫌疑人snp集合，为刑事案件提供依据。

snp检测技术拆分混合样本的方法在通过孕妇外周血进行亲子鉴定中的应用，混合样本为孕妇外周血时，已知样本包括母亲基因组dna，未知样本包括胎儿基因组dna，将确认的胎儿snp集合与待测父亲snp集合进行遗传学特征比对，从而判断胎儿与待测父亲间的关系。

snp检测技术拆分混合样本的方法在器官移植患者血液样本检测中的应用，混合样本为器官移植患者血液样本时，混合样本中的基因组dna分别为受者基因组dna和供体基因组dna，通过混合snp集合数据拆分方法将混合snp集合进行混合比例拆分，通过混合比例判断排斥情况。

本发明具有的优点和积极效果是：需要生物学标志物所在dna片段更短，检测灵敏度更高，dna起始量很低，而且要求结果可重复；使用高通量测序平台检测指定snp集合，可以对160bpdna片段，1ngdna起始量检材实现1-5％的灵敏度，如果是2人混合样本，混合比例大于1：49，可以准确拆分为两人snp集合。

本方案具有多方面应用，在刑事案件样本检测中，如果被害人snp集合已知，即可确定另一个snp集合为嫌疑人snp集合，为刑事案件的侦破提供关键线索；还可以用于无创亲子鉴定，只需要取孕周六周以上的外周血，就可以准确拆分出胎儿snp集合，再比对“父亲”的snp集合，就可以确定该“父亲”是否是胎儿的生物学父亲，排除孩子为独立个体的因素，能够尽早确定亲子关系，例如应用在刑事案件中，能够快速确定强奸案嫌疑人；同时能够应用于移植器官排斥情况的检测。

附图说明

图1是本发明方案实施方式流程图；

图2是混合比例与突变频率分布坐标图；

图3是snp位点分布情况；

图4是snp位点密度分布曲线。

具体实施方式

本方案主要是将snp检测技术应用到混合样本拆分中，其核心在于使用高通量测序平台检测指定snp集合，可以对160bpdna片段，1ngdna起始量检材实现1～5％的灵敏度。如果是2人混合样本，可以准确拆分为两人snp集合，尤其应用在刑事案件中，当被害人snp集合已知，即可确定另一个snp集合为嫌疑人snp集合，为刑事案件的侦破提供关键线索。

snp检测技术拆分混合样本的方法，步骤如下：

步骤1提取混合样本基因组dna，孕妇或者器官移植患者的外周血游离dna作为混合样本，需要离心去掉血细胞；而其他混合样本，如混合精斑/血斑需要裂解细胞，通过ngs构建混合snp集合，snp位点标记上游引物核苷酸序列如seqidno.1-80所示，snp位点标记下游引物核苷酸序列如seqidno.81-160所示。

步骤2：文库构建，使用多重反应pcr的试剂盒对步骤一得到的dna进行扩增富集，然后加测序接头(含样本识别的标签序列)建库。

步骤3：高通量测序仪测序，如iontorrentpgm/s5/s5xl和illuminamiseq对步骤二得到的文库进行测序，得到数据要求扩增子均一性参数uniformity>95％，平均覆盖深度>200x，常染色体snp位点>80个。并得到snp集合中每个位点的突变频率

步骤4一种snp集合数据拆分混合样本的方法，具体操作步骤如下：

1)：假设混合样本包括a、b两个样本，混合比例为x0：(100-x0)，x0<＝50且x0>＝0；

2)：取n个snp位点对混合样本进行检测获得混合样本snp集合，获得a、b两个样本共计2n个基因型，并获得每个snp位点的突变频率y；

3)：对于每个snp位点的突变频率y，a、b混合比例为9种，具体如下：

a.2*y＝x1*gt0+(100-x1)*gt0

b.2*y＝x2*gt0+(100-x2)*gt1

c.2*y＝x3*gt0+(100-x3)*gt2

d.2*y＝x4*gt1+(100-x4)*gt0

e.2*y＝x5*gt1+(100-x5)*gt1

f.2*y＝x6*gt1+(100-x6)*gt2

g.2*y＝x7*gt2+(100-x7)*gt0

h.2*y＝x8*gt2+(100-x8)*gt1

i.2*y＝x9*gt2+(100-x9)*gt2

其中，gt0代表无突变为0，gt1代表杂合突变为1，gt2代表纯合突变为2；

取9n个x的众数作为混合样本中a样品混合比例x0；

4)：样本a混合比例x0，带入到y对应的9个公式中(x1到x9都替换为x0)，得到使等式两边差值最小的(gtai,gtbi)作为a、b样本在该位点i的基因型。重复此方法得到n个位点的snp集合基因型。

对于a：b为1：1或者1：2的情况，多数情况为2-3个基因型组合，很难准确拆分，所以只能确定1：1，1：2的混合比例，但不能准确拆分两个人的snp基因型集合。通过这样的方案可以通过人的血液或者体液样本，区分样本来自单一人样本、两个人混合样本、三个人以上混合样本，如果是两个人混合样本，可以拆分出两个人的snp基因型集合。如图1所示，基于这样的技术支持，本方案在公安刑事物证鉴定、临床孕妇外周血亲子鉴定和临床器官移植免疫系统监测中具有显著效果。

实施例1：混合样本比例拆分

1)：假设混合样本包括a、b两个样本，混合比例为x0：(100-x0)，x0<＝50且x0>＝0；

2)：取n个snp位点对混合样本进行检测获得混合样本snp集合，获得a、b两个样本共计2n个基因型，并获得每个snp位点的突变频率y；

3)：对于每个snp位点的突变频率y，a、b混合比例为9种，具体如下：

a.2*y＝x1*gt0+(100-x1)*gt0

b.2*y＝x2*gt0+(100-x2)*gt1

c.2*y＝x3*gt0+(100-x3)*gt2

d.2*y＝x4*gt1+(100-x4)*gt0

e.2*y＝x5*gt1+(100-x5)*gt1

f.2*y＝x6*gt1+(100-x6)*gt2

g.2*y＝x7*gt2+(100-x7)*gt0

h.2*y＝x8*gt2+(100-x8)*gt1

i.2*y＝x9*gt2+(100-x9)*gt2

其中，gt0代表无突变为0，gt1代表杂合突变为1，gt2代表纯合突变为2；

取9n个x的众数作为混合样本中a样品混合比例x0。检测结果如图3所示，为多个snp位点的分布情况。图4为这些snp位点根据图3分布情况以样本a的混合比例为自变量的密度分布曲线，可以看到峰值在20％，即能确定混合比例为1：4。

4)：样本a混合比例x0，带入到y对应的9个公式中(x1到x9都替换为x0)，得到使等式两边差值最小的(gtai,gtbi)作为a、b样本在该位点i的基因型。重复此方法得到n个位点的snp集合基因型。

实施例2：公安刑事物证鉴定

1.dna提取：刑事案件的混合样本的gdna提取。

1)取性侵案件中的混合精斑(或者凶器上的混合血斑)到含有细胞裂解液的离心管中。颠倒离心管5-6次混匀。

2)室温孵育10分钟，裂解细胞。2000xg室温离心10分钟。

3)移除上清液，离心管内剩余大约1.4ml液体。

4)加入rna酶，蛋白沉淀液，2000xg离心10分钟。

5)上清液中加入异丙醇，2000xg室温离心1分钟，弃上清液。

6)乙醇清洗并干燥，得到dna。

2.文库构建、模板制备

1)配置dna靶向扩增反应体系

5xionampliseq^tmhifimix(redcap)4ul,2xionampliseq^tmprimerpool4ul,dna(1-10ng)<10ul,nuclease-freewater20ul。

2)靶点扩增

snp所在的扩增子被称为靶点，使用如下程序进行靶点扩增：

3)连接接头及纯化

在一张新片上对不同文库进行测序时，必须为每个文库连接不同的标签序列，该标签序列位于测序接头。使用ionxpress^tmbarcodex和ionp1adapter添加接头可用于iontorrent平台检测；如果使用illumina平台检测，需要对pcr产物做平末端修复，磷酸化，加a形成年末端，然后再加上illumina平台的测序接头。本实例使用iontorrent平台。

4)qpcr定量

使用qpcr方法的ionlibrarytaqmanquantitationkit(cat.no.4468802)试剂盒对文库进行定量。为扩增的文库通常产量在100-500pm。定量后将其稀释至～100pm，再进行模板制备。

3.高通量测序仪测序

测序得到大量dna片段碱基读取(reads)，采用二代测序仪，包括iontorrent平台或illumina平台的测序仪进行上机测序。

4.分析数据，出具报告

测序得到的海量数据reads，通过比对到人类基因组标准参考序列hg19(grch37)，计算并记录每个snp各个allele的突变频率，并通过snp集合数据拆分混合样本各自的基因型，将得到的两个snp集合基因型与已知样本snp集合基因型进行比对，得到未知样本snp集合基因型，即得到嫌疑人snp集合基因型。

实施例3：无创胎儿亲子鉴定

现有的法医物证鉴定中，亲子关系的鉴定分别需要“孩子”，“父亲”，“母亲”提供各自的检材，如血液、毛发、唾液、口腔细胞及骨头等都可以做亲子鉴定的检材，其中的“孩子”需要是独立的个体才能准确取样。采用本方案技术可以从孕妇外周血中分离出孩子的snp集合，排除孩子为独立个体的因素，能够尽早确定亲子关系。由于六周以上的孕妇外周血游离dna(cell-freedna)中，胎儿游离dna(cell-free-fetusdna)浓度为5％～15％，可以将孕妇外周血看做是两个人混合的检材，通过snp检测技术拆分混合样本的方法将胎儿snp集合出来，于待测“父亲”样本进行比对，从而实现早期无创亲子鉴定。具体实施步骤入下：

1.dna提取：cfdna提取，来自孕妇外周血

1)材料和设备要求

实验注意事项

(1)所有步骤都在室温(20–25℃)进行，除非特别标注的步骤。

(2)用移液器吹吸混匀时避免产生气泡。

(3)如果储存温度太低，magmax^tmcellfreednalysis/bindingsolution和magmax^tmcellfreednawashsolution中可能会出现沉淀，请将上述两种溶液于37℃孵育1小时。

(4)magmax^tmcellfreednamagneticbeads使用前请充分涡旋以重悬磁珠。

(5)在配制magmax^tmcellfreednalysis/bindingsolution与magmax^tmcellfreednamagneticbeads混合液时，推荐多配制5-10％的总样品混合液的使用量。

(6)血浆样本可在streck管中稳定保存14天。提取前用蛋白酶k处理样本可使cfdna产量高50％。

2)游离dna手动抽提步骤

准备游离的血浆样本

(1)全血4℃2000×g离心10min。

(2)转移上清血浆至新的离心管中。

(3)将转移出来的血浆在4℃，16,000×g再离心10min.

注释：或者可将转移出来的血浆在4℃，6,000×g离心30min以除去残留的血液或细胞碎片。

(以下流程适用于使用edta血液采集管收集的全血样本，对于strek管采集的全血样本，请参考英文protocolpublicationnumberman0014327)

3)裂解血浆样本将cfdna结合于磁珠上

如下表用量依次加入游离dna结合液(magmax^tmcellfreednalysis/bindingsolution)、磁珠(magmax^tmcellfreednamagneticbeads)和血浆配制

混合液并充分混匀，混合比例为1.25：0.015：1

(1)加入适量体积的血浆样本。

(2)颠倒混匀10次以使血浆样本与bindingsolution/beadsmix充分混匀。

(3)振荡10min，使游离dna与磁珠结合。

(4)短暂离心收集管盖上液体后将离心管放置在磁力架(dynamag^tmmagnet)上静置5min或直至液体变澄清并磁珠形成沉淀块状。

(5)用移液器小心弃除上清。

(6)将离心管在磁力架上再放置1min，用移液器吸弃残留的上清。

4)用洗涤液和80％乙醇洗涤

(1)取1mlmagmax^tmcellfreednawashsolution斡旋震荡重悬磁珠。

(2)将磁珠悬浊液转移至一新的1.5ml离心管中，暂时保留旧的离心管。

(3)将新的含有磁珠悬浊液的1.5ml离心管于磁力架上放置20s。

(4)收集上清，并用该上清重新冲洗前述保留的旧离心管。

(5)将获得的磁珠悬浊液转移至磁力架上的1.5ml离心管中，丢弃这只旧的离心管。

(6)将1.5ml离心管于磁力架上再放置2min，或直至液体变澄清并磁珠形成沉淀块状。

(7)用1ml移液器吸弃上清。

(8)将1.5ml离心管保留在磁力架上，于实验台上轻拍磁力架5次，然后用200ul的移液器吸弃所有残留的液体。

(9)将离心管于磁力架上取下来，加入1ml新鲜配置的80％乙醇，涡旋30s。

(10)将1.5ml离心管于磁力架上再放置2min，或直至液体变澄清并磁珠形成沉淀块状.

(11)用1ml移液器吸弃上清。

(12)将1.5ml离心管保留在磁力架(dynamag^tm-2magnet)上，使磁珠风干3-5min。

(13)于实验台上轻敲磁力架5次，然后用200ul的移液器吸弃所有残留的液体。

5)洗脱cfdna，重新结合到磁珠上并洗涤

(1)向风干的磁珠中加入400ul0.1xtae，涡旋混匀5min。

(2)将1.5ml离心管于磁力架上再放置2min，或直至液体变澄清并磁珠形成沉淀块状。

(3)将上清转移至新的1.5ml离心管中。

(4)向上清中加入5ulmagmax^tmcellfreednamagneticbeads以及500ulmagmax^tmcellfreednalysis/bindingsolution并充分混匀。

(5)振荡5min以使cfdna结合到磁珠上。

(6)将1.5ml离心管于磁力架上再放置5min，或直至液体变澄清并磁珠形成沉淀块状。

(7)用1ml移液器吸弃上清。

(8)从磁力架上拿下离心管，加入1mlmagmax^tmcellfreednawashsolution，涡旋混匀30s。

(9)将1.5ml离心管于磁力架上再放置2min，或直至液体变澄清并磁珠形成沉淀块状。

(10)用1ml移液器吸弃上清。

(11)将1.5ml离心管保留在磁力架上，于实验台上轻拍磁力架5次，然后用200ul的移液器吸弃所有残留的液体。

6)用80％乙醇洗涤两次

(1)从磁力架上拿下离心管，加入1ml新鲜配置的80％乙醇，涡旋混匀30s。

(2)将1.5ml离心管于磁力架上放置2min，或直至液体变澄清并磁珠形成沉淀块状。

(3)用1ml移液器吸弃上清。

(4)将1.5ml离心管保留在磁力架上，于实验台上轻拍磁力架5次，然后用200ul的移液器吸弃所有残留的液体。

(5)重复1-3步，再用80％乙醇洗涤一遍。

(6)将1.5ml离心管保留在磁力架上，使磁珠风干3-5min。

(7)将1.5ml离心管保留在磁力架上，于实验台上轻拍磁力架5次，然后用200ul的移液器吸弃所有残留的液体。

7)洗脱cfdna

(1)向1.5ml离心管中加入10-15ulmagmax^tmcellfreednaelutionsolution。

(2)涡旋震荡5min。

(3)将1.5ml离心管于磁力架上再放置2min，或直至液体变澄清并磁珠形成沉淀块状。

(4)提取的cfdna在上清液中。

(5)提取的cfdna可直接使用，或者将其转移到新的离心管中保存。

(6)4℃保存24h。

(7)-20℃长期保存。

2.文库构建、模板制备

同实施例2步骤2文库构建、模板制备。

3.高通量测序仪测序

同实施例2步骤3高通量测序仪测序

4.分析数据，出具报告

测序得到的海量数据reads，通过比对到人类基因组标准参考序列hg19(grch37)，计算并记录每个snp各个allele的突变频率，并通过snp集合数据拆分混合样本各自的基因型，将得到的两个snp集合基因型与已知样本snp集合基因型进行比对，得到未知样本snp集合基因型，即得到嫌疑人snp集合基因型。

其中混合比例低的为胎儿样本(10％左右)，混合比例高的为孕妇妈妈样本。再检测“待检爸爸”snp集合，就可以判定“待检爸爸”是否为胎儿的生物学父亲。

实施例4：器官移植患者排异情况监测

1.dna提取：cfdna提取，来自器官移植患者

同实施例3的步骤1dna提取。

2.文库构建、模板制备

同实施例2的步骤2文库构建、模板制备。

3.高通量测序仪测序

同实施例3的步骤3高通量测序仪测序。

4.分析数据，出具报告

测序得到的海量数据reads，通过比对到人类基因组标准参考序列hg19(grch37)，计算并记录每个snp各个allele的突变频率，并通过snp集合数据拆分混合样本各自的基因型，和混合比例。根据供体样本混合比例的变动，来判断器官移植排斥情况。其中混合比例低的为器官供体的样本。

以上对本发明的几个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

表一.snp位点引物核苷酸序列