基于全长转录组测序开发的姜荷花多态性SSR引物及试剂盒的制作方法

本发明涉及ssr引物，具体的说是基于全长转录组测序开发的姜荷花多态性ssr引物及试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术：

姜荷花原产于泰国，具有花型独特、花色艳丽、花期长、瓶插寿命长的特点，由于不育苞片形似荷花且为姜科，故称为姜荷花，具备荷花和郁金双重之美，又称热带郁金香(summertulip)。近些年，我国也引进了姜荷花，并逐渐应用在切花、盆花和园林花镜上。由于姜荷花是新型花卉且观赏性高深受人们喜爱，越来越多的国外品种被引进，许多种质资源在国内被驯化得日益适应国内气候环境。众多的品种资源存在同物异名、同名异物以及品种间亲缘关系不清的问题，给品种收集、保存和利用带来影响，不利于后续姜荷花新品种培育工作的展开。因此开发多态性分子标记深入了解品种间关系，对于后续开展姜荷花种质资源创新工作是必要的。

随着分子生物学的发展，分子标记技术广泛应用于种质资源遗传多样性和辅助育种工作中。issr、rapd、aflp等显性标记尽管有无需知道基因组信息，成本低的优点，但是随机性强，稳定性差。与其他分子标记相比，ssr标记具有共显性、重复性好的优点，是目前进行遗传多样性分析和遗传图谱构建等的首选。

目前姜荷花的ssr应用很少，还没有专门针对该物种开发的ssr标记，仅有的一个应用ssr标记检测姜荷花原品种和伽马射线突变品种间的遗传差异，但是所用引物是借鉴同属药用植物姜黄（curcumalonga）的。由于ssr标记的物种专一性强，针对本物种开发的标记当然具有更好的稳定性和更高的多态性。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种基于全长转录组测序开发的姜荷花多态性ssr引物及试剂盒。

一种基于全长转录组测序开发的姜荷花多态性ssr引物，所述引物包括20对引物，分别为：

p2f:agcaatgttgacgaaatggaaa(seqidno.1)，

p2r:aagcaatctcttaggaaatcag(seqidno.2)；

p5f:ctggtcacccacctaaatcctt(seqidno.3)，

p5r:acgccgtggagaagaggctatt(seqidno.4)；

p6f:ggagggactacgggaaagggaa(seqidno.5)，

p6r:gcaggacagttacgattgatga(seqidno.6)；

p7f:gaaagcgacaagatgctgaggg(seqidno.7)，

p7r:accttcctcttctccacctgat(seqidno.8)；

p9f:gagccagaagtcacaatcagcg(seqidno.9)，

p9r:ttgtcctggcttcctctctggg(seqidno.10)；

p11f:ctgagtgtaggacttgtcggtg(seqidno.11)，

p11r:tagccattgacgaacaaaaagc(seqidno.12)；

p12f:gaagagcaaaagacaggcagat(seqidno.13)，

p12r:cacagacaaagaatgaaaacta(seqidno.14)；

p13f:agggcgtcttcaaggtctggat(seqidno.15)，

p13r:acaacaacggcagcagcagtat(seqidno.16)；

p14f:gcctttggtatctctgttctaa(seqidno.17)，

p14r:taatgcggtaggaggggaacaa(seqidno.18)；

p16f:tctatgttcttcgctaccttcg(seqidno.19)，

p16r:acctttatcctcttggtctcgc(seqidno.20)；

p17f:caaaacgaggaaagaaaccaaa(seqidno.21)，

p17r:tatgcttgttggaggctatcac(seqidno.22)；

p18f:agggcaaaactcaaaagggtag(seqidno.23)，

p18r:ctccttgtagtccttgtcctgc(seqidno.24)；

p19f:aaacacagactgccctccttga(seqidno.25)，

p19r:ttcccatcagaagataacaacg(seqidno.26)；

p21f:cgtttctccagacaatgaccgc(seqidno.27)，

p21r:cgtcaactaactctacgctaac(seqidno.28)；

p23f:ccctggcgtaacctccatttcc(seqidno.29)，

p23r:gatggcgtggagtatggcgtct(seqidno.30)；

p25f:cctggcgtaacctccatttccg(seqidno.31)，

p25r:gatggcgtggagtatggcgtct(seqidno.32)；

p26f:actcgccaatctcttacacagc(seqidno.33)，

p26r:tcggggtaatggtgacggtaag(seqidno.34)；

p27f:tttcaccaggagtaagagggat(seqidno.35)，

p27r:aaacctcagccttttctcttca(seqidno.36)；

p31f:cagccgtttgttatgctactta(seqidno.37)，

p31r:ttgaaactttaccaagaacagg(seqidno.38)；

p33f:gtcaaacttctcaaaccacacg(seqidno.39)，

p33r:atcatacaataccctcaacaat(seqidno.40)。

一种鉴定姜荷花亲缘关系的试剂盒，它包括所述的引物。

本发明的有益效果：

本发明的20对ssr引物是通过10个姜荷花品种筛选得到，在10个姜荷花品种中均具有多态性，因此可以用做姜荷花的品种鉴定，ssr标记是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所提供的20个引物对应用于更多姜荷花品种上，进行品种鉴定、种质资源亲缘关系和遗传多样性分析，为姜荷花分子标记辅助育种奠定了良好的基础。

附图说明

图1是部分引物电泳图；

图2是基于扩增条带多态性做的10个品种的聚类图。

具体实施方式

一、姜荷花‘清迈粉’全长转录组测序

测序材料为种植于浙江省农科院花卉研究中心的生长状态良好的一株姜荷花的叶、花茎、绿色苞片、粉色苞片、小花苞分别提取rna后的混样。测序实验由天津生物芯片技术有限责任公司完成，测序后获得64471个去冗余的基因片段，序列总长度为132833kb。

二、ssr引物的筛选

利用misa软件对基因序列中的ssr位点进行搜索，参数设置如下：1~6核苷酸最少重复次数分别为10、6、5、5、5、5。复合ssr的最大的间隔碱基数为100bp。用primer5.0设计50对引物，引物设计依据以下原则：1、引物位于微卫星序列两端，引物长度18bp~25bp；2、预期pcr扩增片段长度100bp~250bp；3、退火温度为52℃~62℃；4、gc含量为40%~68%；5、避免引物中出现二聚体、发卡结构及错配。

三、品种dna的提取

用ctab法提取10个姜荷花品种（表1）基因组dna。

表1.用于ssr引物多态性筛选的10个品种

四、琼脂糖胶初筛和聚丙烯酰胺凝胶进一步筛选

用50对引物对10个姜荷花品种进行pcr扩增，扩增产物首先用琼脂糖凝胶电泳进行初步筛选，有目的产物条带的进一步用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。聚丙烯酰胺凝胶电泳实验步骤如下：（1）制胶

将玻璃板洗干净，竖置晾干备用。将间隔条、附着板和背板组装成凝胶夹层装置，水平放置，用夹子在两侧夹好固定。量取50ml6%变性聚丙烯酰胺凝胶溶液，加入100ml20%aps和50mltemed，轻轻混匀后利用灌胶瓶将其灌入夹层中，将鲨鱼齿梳的平齐端插入两板之间的胶液5~6mm，室温下放置1~1.5h使凝胶凝固。

（2）预电泳

凝胶聚合后，卸下夹子，将凝胶装置安装于电泳槽上，加入1000ml左右的1×tbe缓冲液，液面高度需没过胶面一定高度。同时，电泳槽中加入400ml左右的1×tbe缓冲液。拔出鲨鱼齿梳子，打开电泳仪，恒功率为85w，预电泳20~30min。

（3）变性

将pcr扩增产物加入5～10ml上样缓冲液离心混匀。95℃变性5min后，取出迅速放置于冰上。冷却10min待用。

（4）电泳

预电泳结束后，暂停电泳仪，用吸管吹打胶面，清除气泡和杂质，避免堵塞点样孔，取适量变性样品（4.5~6.5ml）点入加样孔，恒功率85w，开始电泳。1.5h后，终止电泳。

（5）银染

将附着胶的玻璃板胶面朝上放入2000ml固定液中，置于转速50~60rpm的摇床上轻摇20min左右，从固定液中取出凝胶玻璃板，用去离子水漂洗3min。取出凝胶玻璃板置于2000ml硝酸银溶液，置于转速50~60rpm的摇床上轻摇30~40min，使染色充分。取出凝胶玻璃板放入2000ml去离子水中，漂洗30~60s。取出凝胶玻璃板放入2000ml显色液中，于转速60rpm的摇床上显色4~7min，至dna条带清晰。取出凝胶玻璃板置于2000ml蒸馏水中漂洗3min，取出后放置于干燥处晾干。胶板在扫描仪上进行扫描。部分引物电泳图见图1。

一、引物多态性分析

聚丙烯酰胺凝胶结果表明，有20对引物多态性好、扩增条带清晰。统计了这20条引物的扩增多态性结果（表2），基于扩增条带多态性做了10个品种的聚类图（图2）。聚类树的拓扑结构可以体现10个品种的亲缘关系远近，c7绿天使是唯一一个绿色花苞的品种，聚类图显示该品种和其他品种关系最远。关系最近的c2品种日落和c3品种荷兰红花色最为接近，都是深玫红色，白雪（c8）和白雪田间自然变异筛选到的品种紫精灵（c10）也表现了互相间最近的亲缘关系，聚类结果表明开发的20对引物不仅具有多态性，而且能够反应品种间亲缘关系。

表2.20对姜荷花ssr引物信息

本发明提供的多态性引物可以用于姜荷花品种间遗传多样性分析、遗传图谱构建、分子标记辅助育种等方面。

序列表

<110>浙江省萧山棉麻研究所

<120>基于全长转录组测序开发的姜荷花多态性ssr引物及试剂盒

<141>2018-10-23

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