一株贫营养低温脱氮菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株贫营养低温脱氮菌及其应用。

背景技术：

氮是自然界水体中一种常见的污染物，过度积累会造成水体富营养化，生态系统失衡等严重后果。传统脱氮方法主要有物理、化学和生物法。相比于物理化学法，生物脱氮具有成本低，二次污染小，抗冲击性能好等优点。

在我国北方地区，特别是东北地区，由于冬季地表水水温过低，不利于传统脱氮菌的生长，而且由于地表水中c、n等营养物质的贫瘠，更是对传统生物法带来了极大地难度。因此，筛选出高效的，能够在低浓度营养物质下进行低温脱氮细菌，以及加强对低温细菌的实际应用，对于北方地区低温水体，特别是地表水，地下水等贫营养状态下的微污染水体的治理，是十分必要的。

近年来，由于异养硝化好氧反硝化细菌的不断发现，关于其较于传统自养型细菌的优势也日趋得到关注，特别是其对于极端环境的适应能力，也不断被研究者所发现。目前，关于低温脱氮细菌的报道比较少，少数筛选出的低温细菌也只针对于污水处理，并且温度在处理4℃以上。因此筛选出能够在低温下，对地表水，地下水等水体进行生物处理的低温脱氮菌株是具有重要的研究和实际应用价值的。

技术实现要素：

本发明的目的是要解决现有脱氮菌不适宜于贫营养低温水体的问题，提供了一株贫营养低温脱氮菌及其应用。

本发明的一株贫营养低温脱氮菌为紫色杆菌(janthinobacteriumsp.)m-11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2017年07月03日，保藏编号为cgmccno.14380。

本发明的一株贫营养低温脱氮菌的应用是指在贫营养低温水体脱氮上的应用。

本发明从松花江水进行处理的中式反应器中填料中筛选出的高效耐低温脱氮细菌janthinobacteriumsp.m-11，经鉴定为革兰氏阴性菌，兼性厌氧菌，生长温度为2-35℃，最适温度为25-30℃，菌体长度为1-1.5μm，宽度为0.5-1μm，呈短杆状，无芽孢。菌落呈半径为1-2mm白色半透明规则圆形，湿润有光泽。

janthinobacteriumsp.m-11的dna提取采用ctab法。pcr扩增16srdna基因，采取16srdna基因的通用引物。pcr扩增产物经纯化后直接进行双向测序。将该序列输入genbank,用blast软件与数据库序列进行比对分析，结果表明与janthinobacteriumsp.的16srdna序列相似性较高，为紫色杆菌属。根据16srdna基因的系统发育结果分析以及生理生化特征，该细菌紫色杆菌属(janthinobacterium)一株菌株。最终命名为紫色杆菌(janthinobacteriumsp.)m-11。

本发明采用对松花江水进行处理的中式反应器中填料所筛选出的高效耐低温脱氮细菌janthinobacteriumsp.m-11，该菌株可在2℃条件下对以nh4⁺-n,no2^--n和no3^-n为唯一氮源的富营养水体分别进行脱氮处理。初始n浓度为5mg/l左右，接种浓度为4×10⁶cfu/ml，初始od600约为0.03，贫营养低温脱氮菌janthinobacteriumsp.m-11可在2℃下生长，48小时氨氮去除率达到在90％以上，且没有亚硝态氮和硝酸盐态氮的积累；在2℃对亚硝酸盐和硝酸盐进行去除，去除率达80％以上，且亚硝酸盐积累对该细菌没有抑制作用，说明贫营养低温脱氮菌janthinobacteriumsp.m-11相比其他菌种接种量更小，更适宜贫营养低温水体的处理。

附图说明

图1为培养基中氨氮，硝酸盐氮，亚硝酸盐氮，总氮及细菌浓度随时间的变化图；其中a为氨氮浓度，b为总氮浓度，c为亚硝氮浓度，d为硝态氮浓度，e为细菌浓度；

图2为以亚硝酸钠为唯一氮源的反硝化培养基中硝酸盐氮和亚硝酸盐随时间的变化图；其中f为硝酸盐，g为亚硝酸盐；

图3为以硝酸钠为唯一氮源的反硝化培养基中硝酸盐氮和亚硝酸盐随时间的变化图；其中f为硝酸盐，g为亚硝酸盐；

图4为不同ph下硝化培养基中氨氮浓度。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一株贫营养低温脱氮菌为紫色杆菌(janthinobacteriumsp.)m-11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2017年07月03日，保藏编号为cgmccno.14380。

本实施方式从松花江水进行处理的中式反应器中填料中筛选出的高效耐低温脱氮细菌janthinobacteriumsp.m-11，经鉴定为革兰氏阴性菌，兼性厌氧菌，生长温度为2-35℃，最适温度为25-30℃，菌体长度为1-1.5μm，宽度为0.5-1μm，呈短杆状，无芽孢。菌落呈半径为1-2mm白色半透明规则圆形，湿润有光泽。

janthinobacteriumsp.m-11的dna提取采用ctab法。pcr扩增16srdna基因，采取16srdna基因的通用引物。pcr扩增产物经纯化后直接进行双向测序。将该序列输入genbank,用blast软件与数据库序列进行比对分析，结果表明与janthinobacteriumsp.的16srdna序列相似性较高，为紫色杆菌属。根据16srdna基因的系统发育结果分析以及生理生化特征，该细菌紫色杆菌属(janthinobacterium)一株菌株。最终命名为紫色杆菌(janthinobacteriumsp.)m-11。

本实施方式采用对松花江水进行处理的中式反应器中填料所筛选出的高效耐低温脱氮细菌janthinobacteriumsp.m-11，该菌株可在2℃条件下对以nh4⁺-n,no2^--n和no3^-n为唯一氮源的富营养水体分别进行脱氮处理。

具体实施方式二：本实施方式一株贫营养低温脱氮菌的应用是指在贫营养低温水体脱氮上的应用。

本实施方式贫营养低温脱氮菌janthinobacteriumsp.m-11可在2℃下生长，48小时氨氮去除率达到在90％以上，且没有亚硝态氮和硝酸盐态氮的积累；在2℃对亚硝酸盐和硝酸盐进行去除，去除率达80％以上，且亚硝酸盐积累对该细菌没有抑制作用，说明贫营养低温脱氮菌janthinobacteriumsp.m-11相比其他菌种接种量更小，更适宜贫营养低温水体的处理。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：贫营养低温水体中低温脱氮菌的投加量为4×10⁶cfu/ml。其他与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式贫营养低温脱氮菌janthinobacteriumsp.m-11的筛选方法为：取稳定运行的反应器中的填料，震荡离心取上清液。采用稀释平板涂布法进行分离，在2℃下，初始nh4⁺-n浓度为5mg/l，对分离出来的菌株置于培养基中进行nh4⁺-n去除实验，对于nh4⁺-n去除率最高的菌株即为所需低温脱氮菌株。具体菌种筛选步骤为:从运行稳定的反应器中取得填料10g。放置于50ml离心管中加入30ml无菌水，震荡均匀使细菌均匀分散至无菌水中。然后，从细菌悬浮液中取1ml接入装有9ml无菌水的试管中，得到浓度为10¹梯度的细菌悬浮液，重复此步骤，依次得到菌种浓度为10²、10³…10⁷梯度的细菌悬浮液。然后采用平板涂布法，从各梯度的细菌悬浮液中取100μl放入平板培养基中进行2℃低温培养，分别挑取不同形态，菌落清晰的典型菌落，在平板培养基上进行划线分离，重复3-4次直至出现菌落特征一致的单一菌落。上述所有操作均在无菌条件下进行。

上述的平板培养基的成分为(g/l)：醋酸钠1，氯化铵1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钠0.2，琼脂18和2ml微量元素溶液。微量元素溶液成分(g/l)：氯化锰0.5，硫酸亚铁0.5，硫酸镁1，氯化钙1，硫酸锌0.5和氯化钴0.2。

将初筛所得到的20株菌株分别加入到富集培养基中富集培养，富集培养基的成分为(g/l):氯化铵0.4，醋酸钠1，磷酸氢二钠0.2，氯化钾0.1和2ml微量元素溶液；微量元素溶液成分(g/l)：氯化锰0.5，硫酸亚铁0.5，硫酸镁1，氯化钙1，硫酸锌0.5和氯化钴0.2。

取富集后的菌液离心，pbs溶液清洗三次后分别加入硝化培养基中，硝化培养基成分为(g/l)：氯化铵0.02，醋酸钠0.09，磷酸氢二钠0.02，氯化钾0.01和1ml微量元素溶液；微量元素溶液成分(g/l)：氯化锰0.5，硫酸亚铁0.5，硫酸镁1，氯化钙1，硫酸锌0.5和氯化钴0.2。

接种后的硝化培养基在2℃下进行培养并测量氨氮的去除效率，对氨氮去除效率最高的菌种进行鉴定。其主要生物学特性为革兰氏阴性菌，菌体为短杆状，菌落为规则乳白色半透明圆形。dna提取采用ctab法。pcr扩增16srdna基因，采取16srdna基因的通用引物。pcr扩增产物经纯化后直接进行双向测序。将该序列输入genbank,用blast软件与数据库序列进行比对分析，结果表明与janthinobacteriumsp.的16srdna序列相似性较高，为紫色杆菌属。根据16srdna基因的系统发育结果分析以及生理生化特征，该细菌紫色杆菌属(janthinobacterium)一株菌株。最终命名为紫色杆菌(janthinobacteriumsp.)m-11。

对本实施方式的贫营养低温脱氮菌janthinobacteriumsp.m-11在贫营养低温水体脱氮上的功能性验证：

试验1、janthinobacteriumsp.m-11的低温氨氮去除能力

将贫营养低温脱氮菌janthinobacteriumsp.m-11在富集培养基中培养至对数生长期，接种于处于2℃下的硝化培养基中，接种后od600约为0.03，150rpm转速好氧培养，测量培养基中氨氮，硝酸盐氮，亚硝酸盐氮，总氮及细菌浓度随时间的变化，结果如图1所示。

图1中检测结果显示，该细菌可在2℃下生长，在48小时候去除率达到在90％以上，在氨氮降低的过程中，没有亚硝态氮和硝酸盐态氮的积累，说明该细菌能直接将氨氮转化成氮气等气体。

试验2、janthinobacteriumsp.m-11低温反硝化性能

将贫营养低温脱氮菌janthinobacteriumsp.m-11在富集培养基中培养至对数生长期，分别接种于以亚硝酸钠和硝酸钠为唯一氮源的反硝化培养基中，接种后od600约为0.03，150rpm转速好氧培养，分别测量培养基中硝酸盐氮和亚硝酸盐随时间的变化，结果如图2和图3所示。

图2，3结果显示该细菌可在2℃对亚硝酸盐和硝酸盐进行去除，去除率达80％以上，且亚硝酸盐积累对该细菌没有抑制作用，说明该细菌对于亚硝酸盐有一定耐受性。

反硝化培养基成分为(g/l)：硝酸钠0.03或亚硝酸钠0.025，醋酸钠0.09，磷酸氢二钠0.02，氯化钾0.01和1ml微量元素溶液。微量元素溶液成分(g/l)：氯化锰0.5，硫酸亚铁0.5，硫酸镁1，氯化钙1，硫酸锌0.5和氯化钴0.2。

试验3、janthinobacteriumsp.m-11的生长适宜ph

将贫营养低温脱氮菌janthinobacteriumsp.m-11在富集培养基中培养至对数生长期，在2℃下分别接种于ph为5-10下的硝化培养基中，接种后od600约为0.03，150rpm转速下好氧培养，24h后测量硝化培养基中氨氮浓度。所测定的数值为离心菌体后上清液的氨氮浓度，结果如图4所示。

图4中结果显示该耐冷细菌在ph＝7显示出最高的氨氮去除率(76.33％)，酸性条件能够明显抑制该细菌的低温脱氮效果，碱性虽然在一定程度上抑制了该细菌的低温脱氮效果，但是相比于酸性条件下，该细菌在碱性条件下依然能够表达出一定的脱氮能力。

试验1～3中的富集培养基的成分为(g/l):氯化铵0.4，醋酸钠1，磷酸氢二钠0.2，氯化钾0.1和2ml微量元素溶液；微量元素溶液成分(g/l)：氯化锰0.5，硫酸亚铁0.5，硫酸镁1，氯化钙1，硫酸锌0.5和氯化钴0.2。

硝化培养基成分为(g/l)：氯化铵0.02，醋酸钠0.09，磷酸氢二钠0.02，氯化钾0.01和1ml微量元素溶液；微量元素溶液成分(g/l)：氯化锰0.5，硫酸亚铁0.5，硫酸镁1，氯化钙1，硫酸锌0.5和氯化钴0.2。

由上述试验可知，贫营养低温脱氮菌janthinobacteriumsp.m-11相比其他菌种接种量更小，更适宜贫营养低温水体的处理。

序列表

<110>哈尔滨工业大学

<120>一株贫营养低温脱氮菌及其应用

<160>1

<210>1

<211>1457

<212>dna

<213>紫色杆菌（janthinobacteriumsp.）

<400>1

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