本发明属微生物
技术领域：
，具体涉及一株芽孢杆菌菌株及其应用。技术背景紫茎泽兰(eupatoriumadenophorum)，菊科泽兰属，多年生草本或亚灌木，是一种世界性的恶性杂草，由于其能够快速形成单优群落，并且可以多种方式抑制其它植物生长，是我国现存危害最大的一种外来植物，由于其含有多种有毒组分及恶臭气味组分，仅有泽兰实蝇等极少数物种对其有采食现象。近年来人们对紫茎泽兰的治理采取了投放专性天敌、除草剂、植物防控等手段但均收效甚微，因此很有必要针对紫茎泽兰研发一种有效、成本低廉的生物防治措施。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种高效、低成本、使用方便的微生物药剂控制紫茎泽兰，具体是提供一株芽孢杆菌(bacillussp.)菌株及其在防治紫茎泽兰中的应用。本专利申请人通过从紫茎泽兰的寄生昆虫泽兰实蝇(procecidocharesutilisstone)唾液腺筛分出该菌株，能够高效快速地对紫茎泽兰发生生物侵染，可显著抑制紫茎泽兰的种子萌发，并且在适宜环境下造成紫茎泽兰幼苗病变。本发明所提供的菌株为芽孢杆菌(bacillussp.)菌株，专利申请人对菌株的编号为zlsy5。该菌株已于2017年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc),地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。分类命名为：芽孢杆菌bacillussp.，保藏编号为13725(保藏中心登记入册编号：cgmccno.13725)。本发明所提供的菌株的应用是以其为活性成分或活性成分之一制成菌剂防控紫茎泽兰。专利申请人提供的上述zlsy5菌株，是芽孢杆菌属中首次证实能够高效侵染并造成紫茎泽兰种子无法正常萌发，且会导致萌发中紫茎泽兰种子根部病变的菌株，是在紫茎泽兰防控领域有着良好应用前景的菌株。本发明通过从云南野外紫茎泽兰上泽兰实蝇的唾液腺内分离出一株芽孢杆菌bacillussp.菌株，可在自然环境下快速侵染紫茎泽兰种子使其无法正常萌发或者萌发根快速畸变导致萌发终止，是一种具有良好效果及开发研究远景的微生物。本菌株的生物学特性研究如下。将菌株接种在lb培养基上并于28℃恒温培养，3d。形态学观察：挑取单菌落于载玻片上涂片后，用结晶紫对供试菌株染色，观察细菌形态特征。用大肠杆菌做对照，进行革兰氏染色。直接在培养基上观察其菌落特征。分子生物学鉴定分子鉴定菌株dna的获取：在无菌的环境中，挑供试菌株菌落在20μl无菌水，充分混匀，置于100℃金属浴3h(半小时摇晃一次)裂解细胞，12000g离心1min去除菌体，吸取上清，置于-20℃冰箱保存备用。核糖体16srdna-v4区段扩增：以细菌基因组dna为模板进行pcr扩增，引物由昆明擎科生物公司合成。pcr扩增反应在30μl反应体系中进行(见下表)。引物：16sv4515f5′-gtgccagcmgccgcggtaa-3′806r5′-ggactachvgggtwtctaat-3′反应成分终浓度所需体积(μl)ddh2017.5buffer1×3.0mgcl21mm2.0dntpmixture0.2mm3.0primer10.5μm1.5primer20.5μm1.5模板dna(稀释4x)25ng1.0taq-dnaase1.5u0.5total30扩增循环反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性30s，52℃退火60s，72℃延伸60s；35个循环；最终72℃延伸15min，4℃保存。取15μlpcr扩增产物和3μl核酸染料混合，于1.0％的琼脂糖凝胶上电泳检测，电泳缓冲液为0.5xtae，在120v电压下进行15min，置于upv紫外成像系统上观察成像，并拍照保存。目的片段切胶回收，方法参考qiagenepcrcleanupkit试剂盒说明书。pcr产物测序和序列分析：将回收产物送昆明擎科生物公司进行正反双向测序，测序结果在genbank(http://www.ncbi.nih.gov)中进行blast比对分析。菌株鉴定形态学鉴定菌体杆状或球状，(0.3～2.2)μm×(1.2～7.0)μm，革兰氏阳性菌。好氧型，多数运动，侧生鞭毛，菌落表面粗糙、不透明、褶皱、乳白色或褐色、产色素。所得结果与已发表的bacillussp.相同，从形态学上判断该菌株是bacillussp.。16srdna产物测序结果基因转录间隔区引物对(515f和608r)扩增到400bp左右的基因转录间隔区及核糖体dna基因片段。由昆明擎科生物公司对16srdna扩增产物进行了双向测序。结果在ncbi上进行对比，结果表明所扩增的片段与genbank中已发表的bacillussp.基因cp014166.1、al009126.1、d84213.1的同源性达到了100％。从分子水平证明该细菌就是bacillussp.。本发明提供的zlsy5菌由以下方式分离纯化得到：泽兰实蝇采自云南农业大学化学楼附近的紫茎泽兰上，将有虫瘿的紫茎泽兰采回实验室。对采回的虫瘿整体消毒后在超净工作台内解剖出幼虫，幼虫用75％酒精漂洗三次，每次两分钟，无菌水漂洗三次后解剖，获得泽兰实蝇体内各组织。灭菌：所用培养皿、离心管、试管，枪头等实验器材及无菌水采用高压灭菌，0.1mpa，121℃，灭菌30分钟。研磨：将泽兰实蝇唾液腺放入无菌离心管中，加入1ml无菌水，用研磨棒研磨。梯度稀释：将研磨后的汁液取1ml放入盛有9ml无菌水的试管中，即为10-1稀释度的菌液，再从10-1稀释度的菌液中取1ml放入盛有9ml无菌水的试管中，即为10-2稀释度的菌液，以此类推制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的菌液。平板涂布：细菌的分离常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基(na培养基)，纯化常用lb培养基。倒平板，每个培养皿倒大约15ml的培养基，平放静置，待冷却备用。将稀释菌液10-4、10-5、10-6、10-7分别涂布于平板上，每个梯度涂三皿。在皿底做上标记。培养：倒置平皿于28℃培养箱中培养3-5天。菌的纯化：在无菌条件下用挑针将na培养基上长出的单菌落挑取于lb培养基上划线培养。纯化3-4次可得纯化后的单菌落。zlsy5菌培养条件研究本发明提供了芽孢杆菌zlsy5的人工扩繁及使用方式包含以下步骤：zlsy5的一阶段扩繁培养：用标准lb固体培养基，按体积比0.2％比例添加紫茎泽兰水提取物，调ph值4.3-6.3，倒平板待冷却后，接种zlsy5菌株，在温度15℃-28℃培养1-3天，见有单菌落长出即可。zlsy5的二阶段扩繁培养基：标准lb液体培养基，按体积比0.5％比例添加紫茎泽兰水提取物，ph值4.3-6.3。挑取第一步扩繁后长出的单菌落，接入到100ml的lb液体培养基，28℃过夜摇床培养后，将菌悬液接入二阶段扩繁培养基，在温度15℃-28℃培养1-3天，每12小时进行一次搅拌，接种比例为：2l液体培养基接种400μl菌悬液的比例进行接种。所述紫茎泽兰水提取物为：紫茎泽兰鲜品植株(含叶片)，粉碎后在40℃±5℃下，按照质量比1:9-1:12的比例浸提2小时，去除固体后取上清，0.22μm滤膜过滤后即可使用。zlsy5的使用液：将上述二阶段培养完成的培养液，8℃冷藏8小时，取出后静置至常温按1:5-1:10的比例加水稀释后直接喷洒需要防控的地块及已开花或结实的紫茎泽兰植株上，也可配合zlsy2、zlsy22菌株对已经爆发的紫茎泽兰做生物防控。zlsy5致病症状研究将直径为180mm培养皿垫定性滤纸后灭菌，在超净工作台上将稀释好的带紫茎泽兰种子的液体10ml均匀倒在无菌滤纸表面，紫茎泽兰种子液体为：常温下100ml无菌水添加0.2g紫茎泽兰种子混匀。采取对比效果实验，空白对照为采取泽兰提取液加水按实例2比例稀释后灌溉处理，其余均abc组采用实施例2菌液使用量：喷洒量为每培养皿5ml，培养皿为直径180mm喷洒后在人工气候箱内暗光条件培养5天，显微镜下观察种子萌发情况。以上数据可以看出含有zlsy5菌株的培养液后能够显著抑制紫茎泽兰种子的萌发率，并在一定数量下导致萌发期种子根部病变。zlsy5室内影响紫茎泽兰播种的实验结果将100粒紫茎泽兰种子均匀与晒好并高温灭菌处理过的细泥土中置于直径50cm的花盆，播种后即将实施例1的菌液500ml均匀喷洒至土壤表层，空白对照使用的为单纯紫茎泽兰提取液。随后观察14天，观察紫茎泽兰出芽率和长势，观察期间视土壤情况正常灌溉无菌水，得到以下数据：从以上数据可以看出：含有zlsy5菌株的培养液后能够显著抑制紫茎泽兰种子的萌发率，并在一定数量下导致萌发苗畸变。以下情况也表明：本发明所提供的枯草芽孢杆菌(bacillussp.)菌株(zlsy5菌株)，其分类学特征与枯草芽孢杆菌cgmccno.13451(zlsy2菌株)明显不同。菌形态比较菌生理生化测定结果注：”a”既产酸又产气；“b”只产酸不产气；“c”既不产酸也不产气本发明的有益效果：本发明提供的芽孢杆菌用于紫茎泽兰的防控，效果好成本低。具体实施方式实施例1。第一步：将标准固体lb培养基灭菌后，在未凝固前添加0.2％紫茎泽兰提取物，并调整ph值至4.3倒平板，待冷凝后将zlsy5接种至培养基上，在15℃培养基上培养1天后，挑取单菌落接入到100ml的lb液体培养基，28℃过夜摇床培养，获得菌悬液备用。第二步：配置标准液体lb培养基，灭菌后按体积比添加0.5％的紫茎泽兰提取物，调整ph值至4.3，降温至25℃，将上一步骤准备好的菌悬液按比例接种(添加)至液体培养基中，在25℃下培养3天，每12小时进行一次搅拌。取出降温至8℃冷藏8小时。第三步：将冷藏好的带菌液体培养基取出，按照体积比培养基：水为1:10的比例稀释后，喷洒至土壤表层或已开花或结实的紫茎泽兰植株上。实施例2。第一步：将标准固体lb培养基灭菌后，在未凝固前添加0.2％紫茎泽兰提取物，并调整ph值至6.3倒平板，待冷凝后将zlsy5接种至培养基上，在28℃培养基上培养3天后，挑取单菌落接入到100ml的lb液体培养基，28℃过夜摇床培养，获得菌悬液备用。第二步：配置标准液体lb培养基，灭菌后按体积比添加0.5％的紫茎泽兰提取物，调整ph值至6.5，降温至22℃，将上一步骤准备好的菌悬液按比例接种(添加)至液体培养基中，在22℃下培养5天，每12小时进行一次搅拌。取出降温至8℃冷藏8小时。第三步：将冷藏好的带菌液体培养基取出，按照体积比培养基：水为1:10的比例稀释后，喷洒至土壤表层或已开花或结实的紫茎泽兰植株上。实施例3。第一步：将标准固体lb培养基灭菌后，在未凝固前添加0.2％紫茎泽兰提取物，并调整ph值至5.7倒平板，待冷凝后将zlsy5接种至培养基上，在15℃培养基上培养3天后，挑取单菌落接入到100ml的lb液体培养基，28℃过夜摇床培养，获得菌悬液备用。第二步：配置标准液体lb培养基，灭菌后按体积比添加0.5％的紫茎泽兰提取物，调整ph值至5.7，降温至15℃，将上一步骤准备好的菌悬液按比例接种(添加)至液体培养基中，在15℃下培养3天，每12小时进行一次搅拌。取出降温至8℃冷藏8小时。第三步：将冷藏好的带菌液体培养基取出，按照体积比培养基：水为1:5的比例稀释后，喷洒至土壤表层或已开花或结实的紫茎泽兰植株上。当前第1页12