一种靶向EGFR和HER2的双特异性抗体及其应用的制作方法

本发明主要涉及一种靶向egfr和her2的双特异性抗体及其应用。

背景技术：

癌症严重危害人类身体健康，尤其是恶性肿瘤患者病情发展迅速，易发生转移，且死亡率高。目前在各种疾病所致死亡统计中高居第二位。近年来随着环境污染加剧等因素造成肿瘤的发病率显著上升。而临床采用的常规疗法如放疗、化疗和手术治疗在一定程度上缓解了病情，提高了生存时间，但也存在很多的弊端，如副作用大、易复发等。治疗效果难以进一步得到提高。

在各种癌症中，肺癌是发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤。其中80％-85％属于非小细胞肺癌(nsclc)。肺癌在男性患者中死亡率和发病率占第一位，而在女性中也占第二位。对肺癌的发病机制和治疗手段的研究和开发一直在进行。研究发现egfr是一类在肺癌等癌症中高表达的细胞表面抗原，其属于her家族(包括egfr/her1、her2、her3和her4)，该家族成员通过配体(如egf)激活后形成同源或异源二聚体后激活下游pi3k-akt信号通路来介导细胞的增殖、生长和分化等，是非小细胞肺癌依赖的重要受体和通路。通过靶向抑制egfr可以达到良好的临床效果。靶向抑制egfr的药物主要有两大类：egfr-tki和单克隆抗体。目前egfr-tki小分子药物(如吉非替尼)可以很好地靶向治疗肺癌；德国merck公司研制的人/鼠嵌合单克隆抗体——西妥昔单抗(cetuximab，商品名erbitux)也主要应用于egfr高表达的癌症治疗当中。然而肺癌具有高度的突变潜力，往往通过发生二次突变(如t790m、l858r)等对egfr-tki和抗体产生耐受。因此，进一步了解耐受机制，挖掘新的作用靶点成为研究热点。

大量研究表明egfr和同家族成员her2之间的异源二聚体对下游信号通路的作用在her家族中是最强的，而且her2的扩增和激活成为肺癌细胞产生耐受的重要机制。20％的非小细胞肺癌患者中被检测出her2的过表达，同时egfr和her2的共表达达到10％-50％。在20％-30％的乳腺癌患者中也存在her2过表达。1998年美国genentech公司研制的针对her2受体的人源化单抗——曲妥珠单抗(trastuzumab，商品名herceptin)获得了美国fda批准用于her2高表达转移性乳腺癌治疗。因此，同时靶向egfr和her2成为重要的治疗策略。同时靶向egfr和her2的拉帕替尼(lapatinib，商品名tykerb)在临床治疗非小细胞肺癌时也表现出良好的潜力。但小分子抑制剂药物容易引起耐受，无法长期发挥治疗效果。而近年来双特异性抗体的出现带来了新的希望，双特异性抗体可以同时靶向两种不同的抗原，从而发挥双重或协同效应，用量少而且特异性强。具有十分突出的治疗优势。

技术实现要素：

为克服非小细胞肺癌耐药问题，本发明的发明人结合egfr和her2的关联和工作积累，利用基因工程技术构建了一种同时靶向egfr和her2的双特异性抗体，这种抗体同时含有人源化西妥昔单抗和赫赛汀单抗的抗原表位结合区。

本发明的技术方案如下：

一种靶向egfr和her2的双特异性抗体，包含了人源化cetuximab和商业herceptin的抗原结合区的全长igg1型抗体蛋白。具有人源化cetuximab和商业herceptin的重链和轻链各一条，所述的重链氨基酸序列为seqidno:2和no:6；所述的轻链氨基酸序列为seqidno:4和no:8。

本发明还保护编码上述靶向egfr和her2的双特异性抗体的基因，其特征在于，编码所述重链的核苷酸序列为seqidno:1和no:5；编码所述轻链的核苷酸序列为seqidno:3和no:7。

本发明还保护涉及包含本发明核酸分子的载体和包含所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列的载体，具体表达载体可为pzjc或pcdna3.1。

本发明涉及一种靶向egfr和her2的双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：

a)将人源化cetuximab的重链恒定区和赫赛汀抗体的重链恒定区相应位置碱基进行突变，从而构成隆突-入-穴结构，形成异源重链结合，并交换人源化cetuximab的重链ch1和轻链cl区域，最终形成靶向her2与egfr的双特异性抗体的重轻链基因；

b)将靶向her2与egfr的双特异性抗体的重轻链基因分别克隆到真核表达载体pzjc或pcdna3.1载体上，转染宿主细胞，进行瞬时转染；

c)在摇瓶培养条件下，培养并收集上清；

d)纯化所述的双特异性抗体。

所述的宿主细胞用于载体转染表达，为哺乳动物细胞，具体可为hek293f细胞。

本发明还保护一种组合物，该组合物含有靶向egfr和her2的双特异性抗体和药学上可接受的载体。

本发明还保护一种靶向egfr和her2的双特异性抗体及其组合物在制备抗非小细胞肺癌及其获得性耐受细胞的药物中的应用。

所述的非小细胞肺癌及其获得性耐受细胞分别为高表达egfr和过表达her2的非小细胞肺癌细胞，具体可为pc-9和pc-9/gr细胞。

本发明还保护一种靶向egfr和her2的双特异性抗体及其组合物和其他的抗肿瘤药物联合使用。

本发明的优点：该双特异性抗体可以同时靶向egfr和her2，保留了两个亲本抗体与egfr和her2的亲和力，同时提高了抗体的靶向特异性，减少了抗体用量，而且对非小细胞肺癌pc-9/gr(gefitinib-resistance)细胞的杀伤作用十分显著，效果优于两个亲本抗体的组合，与其他药物联用的效果也十分显著。为临床治疗非小细胞肺癌及其耐受提供了重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例3中的抗体鉴定图。

图2为实施例5流式检测抗体与非小细胞肺癌的亲和力图。其中pbs：磷酸盐缓冲液；herb：人源化cetuximab抗体；her：赫赛汀抗体；hecrossmab：靶向egfr和her2的双特异性抗体。

图3为实施例6中pc-9和pc-9/gr细胞生长抑制功能检测图。图中a为pc-9细胞生长抑制功能检测图；b为pc-9/gr细胞生长抑制功能检测图。其中nc：阴性对照；herb：人源化cetuximab抗体；her：赫赛汀抗体；hecrossmab：靶向egfr和her2的双特异性抗体；egf：表皮生长因子；pc-9：人非小细胞肺癌pc-9细胞；pc-9/gr：人非小细胞肺癌pc-9/gr细胞。

图4为实施例6中pc-9和pc-9/gr细胞中增加吉非替尼进行处理所得生长抑制功能检测图。图中a为pc-9细胞中增加吉非替尼进行处理所得生长抑制功能检测图；b为pc-9/gr中增加吉非替尼进行处理所得生长抑制功能检测图。其中egf：表皮生长因子；herb：人源化cetuximab抗体；her：赫赛汀抗体；hecrossmab：靶向egfr和her2的双特异性抗体；pc-9：人非小细胞肺癌pc-9细胞；pc-9/gr：人非小细胞肺癌pc-9/gr细胞；gef：吉非替尼。

图5为实施例7中流式检测细胞凋亡图。

图6为实施例8中信号通路检测图，图中nc：阴性对照；herb：人源化cetuximab抗体；her：赫赛汀抗体；hecrossmab：靶向egfr和her2的双特异性抗体；egf：表皮生长因子；p-akt：磷酸化蛋白激酶b；akt:蛋白激酶b；aeg-1：星形胶质细胞上调基因-1；c-myc和c-fos：为两种原癌基因；gapdh甘油醛-3-磷酸脱氢酶，作为内参蛋白。

序列说明

seqidno:1：herceptin的重链核苷酸序列。

seqidno:2：herceptin的重链氨基酸序列。

seqidno:3：herceptin的轻链核苷酸序列。

seqidno:4：herceptin的轻链氨基酸序列。

seqidno:5：人源化cetuximab的重链核苷酸序列。

seqidno:6：人源化cetuximab的重链氨基酸序列。

seqidno:7：人源化cetuximab的轻链核苷酸序列。

seqidno:8：人源化cetuximab的轻链氨基酸序列。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明内容。其中涉及到的实验方法均为常规方法，特殊的进行说明。所用试验材料均采购自常规生化试剂商店。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复，结果以平均值进行表示。

本发明的发明人结合egfr和her2的关联和工作积累，利用基因工程技术构建了一种同时靶向egfr和her2的双特异性抗体，这种抗体同时含有人源化西妥昔单抗(cn102153647b)和赫赛汀单抗的抗原表位结合区，具有人源化cetuximab和商业herceptin的重链和轻链各一条，其中重链氨基酸序列为seqidno:2和no:6；轻链氨基酸序列为seqidno:4和no:8。

实施例1、重组质粒构建

质粒构建中的所有实验操作均参考于《分子克隆实验指南》(第二版，科学出版社)。将序列表的序列1、3、5、7所示的dna分子分别插入到pzjc载体上，得到4种重组质粒。分别以人源化cetuximab抗体和赫赛汀单抗的重轻链为模板，引入相应的位点突变和片段互换，设计引物进行扩增。相应的引物如下表1所示：

表1合成crossmab结构基因引物序列

实施例2、制备双特异性抗体

(1)、培养生长良好的hek293f细胞至125ml摇瓶中培养，转染前一天调整细胞数为5×10⁵/ml，活力达到90％以上，培养基为30ml。37℃、125rpm培养。

(2)、转染当天测定细胞数目及活力，活力应大于95％。离心后更换新鲜freestyle293f培养基。取30μg组合质粒dna于opti-mem培养基中，总体积为1ml。

(3)、取60μl293f脂质体加入opti-mem培养基中，总体积为1ml。

(4)、室温孵育5min，将dna缓慢加入稀释好的脂质体中，用枪头轻轻吹吸混匀，并室温静置20-30min，孵育结束后将2ml脂质体和质粒的混合液加入细胞悬液中。

(5)、继续放入摇床中37℃、125rpm培养。12-14天后收集培养上清。

(6)、将收集到的培养上清进行12000rpm离心10min，然后用0.22μm滤膜进行过滤。

(7)、用真空泵过滤结合缓冲液和洗脱缓冲液。

(8)、打开蛋白纯化仪(bio-rad，biologicduoflow)进行rproteina亲和层析，大体过程如下：开启仪器，润洗泵，先用5个柱体积的超纯水(约10ml)将柱子中的乙醇洗净，然后用10个柱体积的柠檬酸结合缓冲液(约20ml)平衡柱子。再用5个柱体积的柠檬酸洗脱缓冲液清洗柱子，洗去残余蛋白；最后再用10个柱体积的柠檬酸结合缓冲液平衡柱子至电导、ph均稳定且将od280值归零。

将过滤后的细胞收集液进行上样，缓慢流过柱子。上样后用10个柱体积的柠檬酸结合缓冲液再次平衡柱子同时洗去未结合的杂蛋白。

洗脱：用5个柱体积的ph＝3.0的柠檬酸洗脱缓冲液将结合在柱子上的目的蛋白洗脱下来，在出现蛋白峰时用收集管进行收集，收集管中事先加入200μl的tris-hcl(ph＝9.0)防止ph过低导致收集到的抗体变性。

洗脱结束后再次用10个柱体积的柠檬酸结合缓冲液平衡柱子，最后用超纯水清洗柱子，用乙醇封柱，柱子保存在4℃。将收集管中洗脱的液体合并后用超滤管进行浓缩并置换buffer为pbs，抗体经过bca和elisa方法定量后分装在小管中保存在-20℃。

实施例3、sds-page检测

(1)样品处理：三倍体积的样品加入一倍体积的4×loadingbuffer(loadingbuffer分变性还原和变性非还原两种)，混匀后煮沸10min，12000rpm离心10min，备用。

(2)配胶：先配分离胶，，在分离胶上方加入异丙醇，室温静置30min左右至胶凝固后倒掉异丙醇。再配制浓缩胶，加入浓缩胶后迅速插入梳子模具，室温静置30min至胶凝固，拔掉梳子模具。

(3)上样：用小枪头吸取样品上样，marker上样5μl，最两侧胶孔用1×loadingbuffer补充。

(4)电泳：蛋白电泳缓冲液没过胶孔，先用80v电压将溴酚蓝指示带电泳至浓缩胶和分离胶分界线处，再将电压调至120v至电泳结束。

(5)电泳结束后如需进行考马斯亮蓝染色则撬开配胶板，取出蛋白胶，用考马斯亮蓝染色液染色30min，再用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。

结果见图1，表明抗体组装完整，纯度较高。

实施例4、elisa检测亲和力

(1)将合成的egfr和her2抗原(委托由北京义翘神州生物技术有限公司合成，egfr抗原：10004-hcch，her2抗原：10001-h02h-50)分别包被96孔酶标板，每孔加入100μl，4℃包被过夜。

(2)清洗：倒掉包被液，在纱布上扣干液体，每孔加入175μl1×pbst，润洗后甩干液体。再每孔加入350μl1×pbst，静置3min，倒掉液体并在纱布上扣干液体，再次用同样的方法用pbst洗两遍。

(3)封闭：用10％的小牛血清(pbs配制)进行封闭，每孔加入200μl，37℃封闭2h。

(4)清洗、加样：每孔加入175μl1×pbst，润洗后甩干液体。将阳性对照曲妥珠单抗与待测样品(纯化的抗her2人源化抗体)一起进行一定浓度的稀释，然后加入酶标板的对应孔中，每孔100μl样品，每个样品做3个复孔，37℃孵育1.5h。

(5)清洗加二抗：清洗步骤同(2)中的清洗步骤。清洗后每孔加入100μl二抗，即hrp-羊抗人igg(1:2000稀释，用10％小牛血清稀释)，37℃孵育1.5h。

(6)显色：弃二抗，同(2)中的清洗步骤进行清洗。清洗后每孔加入100μltmb底物溶液，37℃孵育14min进行显色。

(7)终止并检测：显色后直接每孔加入50μl终止液(2mh2so4)终止反应，在酶标仪上读取450nm波长处的光吸收值。

(8)根据吸光值的高低比较待测样品与抗原结合的亲和力的大小。

最终，测定双特异性抗体hecrossmab与egfr和her2的亲和力(kd)如下表2所示。从结果中可以看出来hecrossmab保留了亲本抗体与egfr和her2的亲和力。

表2亲和力常数(nm)

实施例5、流式细胞术检测抗体与非小细胞肺癌细胞的亲和力

(1)取对数期生长的pc-9或pc-9/gr细胞(细胞表面同时表达egfr和her2)，调整细胞浓度为5×10⁵-1.0×10⁶/ml，加入ep管中，每管1ml细胞悬液，每管对应一个样品。

(2)2000rpm、4℃离心5min，弃上清。

(3)加入1ml含1％fbs的pbs洗涤细胞一次，2000rpm、4℃离心5min，弃上清。

(4)加入稀释好的相应浓度的抗体样品(hecrossmab)以及阳性对照样品(herbitux、herceptin以及herbitux+herceptin)于ep管中，200μl每管，另外可设置加入200μlpbs的样品为阴性对照组，冰浴60min。待测抗体可加入不同梯度的浓度，例如：1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。

(5)抗体孵育结束后离心弃上清，用500μl含1％fbs的pbs洗涤一次。

(6)每管样品中加入fitc标记的羊抗人igg100μl(用含1％fbs的pbs进行1：64稀释)，避光冰浴45min(此时可打开流式细胞仪提前预热机器)。

(7)二抗孵育结束后再次离心弃上清，用500μl含1％fbs的pbs洗涤一次。

(8)细胞沉淀重悬于350μl含1％fbs的pbs中并转移至流式管中进行流式上机检测。根据检测到的fitc荧光值的大小来判断抗体亲和力的强弱。

结果见图2。从结果中可以看出同两个亲本抗体的组合相比，hecrossmab与两个亲本抗体同pc-9和pc-9/gr细胞之间的亲和力相当。

实施例6、mtt检测细胞毒性实验

(1)铺板：分别收集对数期pc-9和pc-9/gr细胞，调整细胞浓度至2.5×10⁴/ml，铺板在96孔板上，每孔加入200μl细胞悬液即每孔5000个细胞，无菌pbs填充边缘，铺2块96孔板，用于72h后的检测。37℃、5％co2培养24h。

(2)加药：待铺板细胞贴壁后，用培养基稀释不同浓度的抗体，吸去96孔板中的培养基，每孔加入200μl含相应浓度抗体的培养基，每个样品浓度设置3个复孔。2小时后相应孔中加入表皮生长因子(egf，10nmol/l)，同时设置不加药的空白对照组。2块96孔板同时加药，72h后检测。加药后继续37℃、5％co2培养。

(3)检测：加相应抗体处理72h后分别进行检测。处理时间结束后，保留培养基，直接每孔加入20μlmtt(mtt溶液浓度为5mg/ml)，在37℃继续培养。4h后吸去各孔中的液体，每孔加入150μldmso，摇床上快速振荡15min充分溶解结晶，然后立即在酶标仪上检测490nm波长处的吸光值。

(4)细胞存活率＝(加药孔od490/空白对照孔od490)×100％；抑制率＝100％–存活率。

最终结果见图3和图4。可以明显看出：hecrossmab能够很好地杀伤pc-9和pc-9/gr细胞，而且在egf刺激下的pc-9/gr细胞中作用更加显著。同时还能够增强pc-9/gr对吉非替尼(gefitinib)的敏感性，其中gef(10nm)和gef(500nm)分别表示吉非替尼在pc-9和pc-9/gr细胞中的终浓度。

实施例7、流式细胞术检测细胞凋亡

(1)第一天进行细胞铺板(pc-9/gr细胞)，调整细胞至5×10⁵/ml的密度，6孔板每孔加入1.5ml细胞悬液。铺板后继续37℃、5％co2培养24h。

(2)待细胞贴壁后，用培养基配制10μg/ml浓度的不同抗体，将6孔板中培养基吸出换成含抗体的培养基进行加药处理，同时设置不加抗体的阴性对照组。

(3)加药处理72h后收集细胞，用预冷pbs清洗细胞2次。加入300μl的1×bindingbuffer重悬细胞，加入5μlfitc-annexinv避光染色15min，上机检测前再加入5μlpi避光染色5min，补加200μl1×bindingbuffer后进行流式上机检测。染色处理时fitc-annexinv单染和pi单染的对照各设置一组。

(4)流式细胞术检测凋亡比例并统计结果。

结果见图5。可以看出：无论是否存在egf刺激下，hecrossmab能够介导更多的细胞凋亡，而且效果显著强于两个亲本抗体的组合。

实施例8、egfr下游信号通路检测

(1)同实施例7中处理一样，收集细胞进行蛋白收集，将待检测蛋白样品进行sds-page。

(2)在sds-page蛋白电泳结束前30min将两张转膜滤纸用转膜缓冲液进行浸泡，pvdf膜用甲醇浸泡30s后放入转膜滤纸上。

(3)转膜：电泳结束后撬开配胶板取出蛋白胶，将蛋白胶置于pvdf膜上，将蛋白胶、pvdf膜、一张滤纸三者一起转移至半干转膜仪的电极板上，最后在蛋白胶的上面再覆盖一张滤纸，用玻璃棒均匀地赶出气泡，吸走多余的转膜缓冲液。盖上转膜仪盖子，18v转膜1h。

(4)封闭：转膜结束后将pvdf膜转移至5％的脱脂奶粉封闭液(用1×tbst配制，现配现用)中，室温封闭1h。

(5)孵育一抗：封闭结束后将pvdf膜用保鲜膜包裹后进行裁膜，根据预染marker的条带大小将目的条带和内参条带处裁开分成两部分。孵育相应抗体，4℃过夜。

(6)次日用1×tbst清洗pvdf膜3次，每次在摇床上清洗10min。

(7)清洗后孵育二抗，目的条带孵育hrp-山羊抗鼠抗体(1:1500稀释)，内参条带孵育hrp-山羊抗兔抗体(1:5000稀释)，室温孵育1h。

(8)二抗孵育结束后按照(6)中的步骤清洗pvdf膜。

(9)在暗室中进行显影，将pvdf膜放在暗盒中的保鲜膜上，均匀涂抹ecl化学发光剂，然后用x胶片进行压片，经过显影、定影后获得western结果。

结果见图6。可以看出：hecrossmab能够显著抑制akt的磷酸化水平，以及下游效应分子c-fos、c-jun和aeg-1的表达水平。

综上所述，hecrossmab具有良好的抗pc-9及pc-9/gr细胞(同时表达egfr和her2)的生长作用，有望成为一种用于临床治疗非小细胞肺癌以及gefitinib获得性耐受的抗体药物。

<110>安徽大学

<120>一种靶向egfr和her2的双特异性抗体

<160>24

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1410

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atggactggacctggagggtcttctgcttgctggctgtagctccaggtgctcactccgag60

gttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcc120

tgtgcagcttctggcttcaacattaaagacacctatatacactgggtgcgtcaggccccg180

ggtaagggcctggaatgggttgcaaggatttatcctacgaatggttatactagatatgcc240

gatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctg300

cagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgttctagatggggaggg360

gacggcttctatgctatggactactggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcctcggct420

agcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggc480

acagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtgg540

aactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcagga600

ctctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctac660

atctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaa720

tcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccg780

tcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgag840

gtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtac900

gtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagc960

acgtaccgtgtggtcagcgtcctctccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag1020

tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaa1080

gccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcctccatgccgggatgagctg1140

accaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgcc1200

gtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctg1260

gactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcag1320

caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcag1380

aagagcctctccctgtctccgggtaaatga1410

<210>2

<211>469

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

metasptrpthrtrpargvalphecysleuleualavalalaprogly

151015

alahissergluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalgln

202530

proglyglyserleuargleusercysalaalaserglypheasnile

354045

lysaspthrtyrilehistrpvalargglnalaproglylysglyleu

505560

glutrpvalalaargiletyrprothrasnglytyrthrargtyrala

65707580

aspservallysglyargphethrileseralaaspthrserlysasn

859095

thralatyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthralaval

100105110

tyrtyrcysserargtrpglyglyaspglyphetyralametasptyr

115120125

trpglyglnglythrleuvalthrvalserseralaserthrlysgly

130135140

proservalpheproleualaproserserlysserthrserglygly

145150155160

thralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluproval

165170175

thrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrphe

180185190

proalavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalval

195200205

thrvalproserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnval

210215220

asnhislysproserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolys

225230235240

sercysasplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleu

245250255

leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr

260265270

leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

275280285

serhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyval

290295300

gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnser

305310315320

thrtyrargvalvalservalleuservalleuhisglnasptrpleu

325330335

asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproala

340345350

proileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro

355360365

glnvaltyrthrleuproprocysargaspgluleuthrlysasngln

370375380

valserleutrpcysleuvallysglyphetyrproseraspileala

385390395400

valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr

405410415

proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleu

420425430

thrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysser

435440445

valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser

450455460

leuserproglylys***

465

<210>3

<211>708

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

atggagacacccgcccagctgctgttcctgctgctgctgtggctgcccgacaccaccggc60

gacatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggttacc120

atcacctgccgtgccagtcaggatgtgaatactgctgtagcctggtatcaacagaaacca180

ggaaaagctccgaaactactgatttactcggcatccttcctctactctggagtcccttct240

cgcttctctggctccagatctgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcagccg300

gaagacttcgcaacttattactgtcagcaacattatactactcctcccacgttcggacag360

ggtaccaaggtggagatcaagcggcggaccgtggcggcgccatctgtcttcatcttcccg420

ccatctgatgagcagttgaaatctggtaccgctagcgttgtgtgcctgctgaataacttc480

tatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcc540

caggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctg600

acgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcag660

ggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag708

<210>4

<211>235

<212>prt

<213>人工序列

<400>4

metgluthrproalaglnleuleupheleuleuleuleutrpleupro

151015

aspthrthrglyaspileglnmetthrglnserproserserleuser

202530

alaservalglyaspargvalthrilethrcysargalaserglnasp

354045

valasnthralavalalatrptyrglnglnlysproglylysalapro

505560

lysleuleuiletyrseralaserpheleutyrserglyvalproser

65707580

argpheserglyserargserglythraspphethrleuthrileser

859095

serleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcysglnglnhistyr

100105110

thrthrproprothrpheglyglnglythrlysvalgluilelysarg

115120125

argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu

130135140

glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe

145150155160

tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln

165170175

serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser

180185190

thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu

195200205

lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser

210215220

provalthrlysserpheasnargglyglucys***

225230235

<210>5

<211>1422

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

atggactggacctggagggtcttctgcttgctggctgtagctccaggtgctcactcccag60

gtgaagctgctggagcagtctggggctgaagtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtt120

tcctgcaaggcatctggattcagcctgactaactacggcgtccactgggtgcgacaggcc180

cctggacaaagacttgagtggatgggagtgatctggagtggtggtaacactgactacaac240

acccccttcactagcagagtcaccatcaccagggacacgtccgctactacagcctacatg300

ggcctgtctagcctgagacccgaggacacggccgtatattactgtgcgagagccctgact360

tattacgactacgagttcgcctactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagct420

agcgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctgga480

actgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtgg540

aaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagc600

aaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaa660

cacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc720

ttcaacaggggagagtgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactc780

ctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcc840

cggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaag900

ttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggag960

cagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctctccgtcctgcaccaggactggctg1020

aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaa1080

accatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgcaccctgcctccatct1140

cgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgagctgcgccgtcaaaggcttctatccc1200

agcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacg1260

cctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgtgagcaagctcaccgtggacaag1320

agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac1380

cactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga1422

<210>6

<211>473

<212>prt

<213>人工序列

<400>6

metasptrpthrtrpargvalphecysleuleualavalalaprogly

151015

alahisserglnvallysleuleugluglnserglyalagluvallys

202530

lysproglyalaservallysvalsercyslysalaserglypheser

354045

leuthrasntyrglyvalhistrpvalargglnalaproglyglnarg

505560

leuglutrpmetglyvaliletrpserglyglyasnthrasptyrasn

65707580

thrprophethrserargvalthrilethrargaspthrseralathr

859095

thralatyrmetglyleuserserleuargprogluaspthralaval

100105110

tyrtyrcysalaargalaleuthrtyrtyrasptyrgluphealatyr

115120125

trpglyglnglythrleuvalthrvalserseralaservalalaala

130135140

proservalpheilepheproproseraspgluglnleulyssergly

145150155160

thralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarggluala

165170175

lysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnsergln

180185190

gluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuser

195200205

serthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyr

210215220

alacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysser

225230235240

pheasnargglyglucysasplysthrhisthrcysproprocyspro

245250255

alaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolys

260265270

prolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysval

275280285

valvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyr

290295300

valaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglu

305310315320

glntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuservalleuhis

325330335

glnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlys

340345350

alaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysglygln

355360365

proarggluproglnvalcysthrleuproproserargaspgluleu

370375380

thrlysasnglnvalserleusercysalavallysglyphetyrpro

385390395400

seraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasn

405410415

tyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleu

420425430

valserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnval

435440445

phesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrgln

450455460

lysserleuserleuserproglylys***

465470

<210>7

<211>708

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

atggagacacccgcccagctgctgttcctgctgctgctgtggctgcccgacaccaccggc60

gaactcgtcatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaac120

attgcctgccgggcaagtcagagcattggcactaacatccactggtatcagcagaaacca180

gggaaagcccctagactcctgatcaaatatgcctccgaaagcatcagtggggtcccatca240

agattcagcggcagtggatctggcacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcct300

gaagattttgcaatctattactgtcagcaaaataacaattggcctactacgttcggcgga360

gggaccaaggtggaaatcaaacgacggaccgtggcggcgccatctgtcttcatcttcccg420

ccatctgatgagcagttgaaatctggtaccgctagcgttgtgtgcctgctgaataacttc480

tatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcc540

caggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctg600

acgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcag660

ggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag708

<210>8

<211>235

<212>prt

<213>人工序列

<400>8

metgluthrproalaglnleuleupheleuleuleuleutrpleupro

151015

aspthrthrglygluleuvalmetthrglnserproserserleuser

202530

alaservalglyaspargvalasnilealacysargalaserglnser

354045

ileglythrasnilehistrptyrglnglnlysproglylysalapro

505560

argleuleuilelystyralasergluserileserglyvalproser

65707580

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrileser

859095

serleuglnprogluaspphealailetyrtyrcysglnglnasnasn

100105110

asntrpprothrthrpheglyglyglythrlysvalgluilelysarg

115120125

argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu

130135140

glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe

145150155160

tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln

165170175

serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser

180185190

thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu

195200205

lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser

210215220

provalthrlysserpheasnargglyglucys***

225230235

合成crossmab结构基因引物序列

引物名称序列（5’-3’）

knobher2-h-r1:gctgacctacctggttcttggtcagctcatcccggcatggaggcagggtgtacacctg

knobher2-h-f1:gatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctat

knobher2-h-r2:ggatcctcatttacccggagacaggga

crossmab-egfr-l-r1:tgctagctgaggatcgtttgatttccaccttggt

crossmab-egfr-l-f1:tggaaatcaaacgatcctcagctagcaccaagggc

crossmab-egfr-l-r2:ggatccctaacaagatttgggctcaacttt