一种水稻叶绿体核糖体蛋白及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及的是遗传学
技术领域：
，尤其涉及的是一种水稻叶绿体核糖体蛋白及其编码基因和应用。
背景技术：
：水稻是世界上最重要的粮食作物之一，其产量受到多种因素的调控，光合作用是影响水稻产量的关键因素之一。叶绿体是光合作用以及多种代谢产物合成和积累的主要场所，为植株的发育提供能量源泉，叶绿体发育受阻将影响植物体的生长。叶绿体核糖体主要负责叶绿体中质体编码蛋白的转录和翻译，已有的研究表明叶绿体核糖体蛋白在核糖体形成、质体蛋白合成、叶绿体分化和早期叶绿体发育的过程中行使重要的功能。某些叶绿体编码的质体蛋白为叶绿体核糖体、光系统i和ii等的重要组分；已有研究显示编码叶绿体核糖体蛋白的基因突变导致胚胎发育受阻、幼苗致死以及降低植株的光合作用等，这些研究有助于我们更好的认知光合作用机理。叶绿素缺失突变体是研究光合作用、光形态建成等生理过程的理想材料，关于叶绿素缺失突变体的应用越来越受关注，可利用这些突变体资源，为进一步通过基因工程手段培育高光效的水稻品种提供依据。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种水稻叶绿体核糖体蛋白及其编码基因和应用，以提供一种新的与水稻叶绿体发育相关的蛋白及其基因，为进一步认知光合作用机理、培育高光效作物品种提供基础。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明提供了一种水稻叶绿体核糖体蛋白，所述蛋白具有如seqidno.1所示的氨基酸序列，或具有如seqidno.1所示的氨基酸序列的一个或若干氨基酸残基经取代和/或缺失和/或插入衍生得到的氨基酸序列，该蛋白命名为asl4蛋白。本发明还提供了一种上述水稻叶绿体核糖体蛋白的编码基因，该编码基因的dna序列如seqidno.2所示，全长3963bp，包含7段外显子和6段内含子，该编码基因的cds序列如seqidno.3所示，全长1209bp，命名为als4基因。本发明还提供了上述编码基因在培育高光效作物品种中的应用。本发明还提供了一种植物表达载体，所述植物表达载体为多克隆位点区域依次连接有启动子、上述als4基因的cds序列、以及终止子的pcambia1305载体。本发明还提供了一种水稻幼苗致死的基因序列，该序列包含上述als4基因dna序列的第4内含子的第37位碱基到终止密码子(tga)下游的第2312位碱基，全长2855bp，该基因序列为单隐性核基因，其缺失可导致植株叶绿素和类胡萝卜素合成受阻，叶绿体不能分化，植株苗期白化致死。本发明还提供了一种鉴定上述水稻幼苗致死的基因序列的特异性indel标记，所述标记的上游核苷酸序列如seqidno.4所示，下游核苷酸序列如seqidno.5所示。本发明还提供了一种利用上述特异性indel标记鉴定所述水稻幼苗致死的基因序列的方法，步骤包括：利用所述特异性indel标记引物对水稻基因组dna进行pcr扩增，若仅得到如seqidno.6所示的3348bp的核苷酸序列，则该水稻为不含所述幼苗致死的基因序列的普通水稻；若仅得到如seqidno.7所示的493bp的核苷酸序列，则该水稻为含有所述幼苗致死的基因序列的纯合子，表型为苗期白化；若得到如seqidno.6所示的3348bp的核苷酸序列和如seqidno.7所示的493bp的核苷酸序列，则该水稻为含有所述幼苗致死的基因序列的杂合子，表型与普通水稻一致。本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种水稻叶绿体核糖体蛋白及其编码基因和应用，该蛋白为叶绿体核糖体小亚基蛋白s1，将该蛋白的编码基因导入叶绿体发育异常的突变体植株中，可以培育成含正常色素且发育正常的植株；本发明还提供了一种水稻幼苗致死的基因序列及其检测方法，可快速监测含有该基因序列的水稻植株；该蛋白及其编码基因、其幼苗致死的基因序列的发现对研究植物生长、发育、遗传及光合作用具有重要意义，为进一步利用基因工程手段培育高光效的作物品种提供潜在的应用价值。附图说明图1为二叶期和三叶期野生型和突变体asl4的地上部分色素含量分析结果，fw为鲜重；图2为三叶期野生型和突变体asl4叶片叶绿体超微结构电镜图；其中，a为野生型三叶期叶片叶绿体超微结构观察，b，c，d为突变体asl4三叶期叶片叶绿体超微结构观察，sg为淀粉颗粒，nc为正常发育的叶绿体，uc为未分化的叶绿体，cw为细胞壁，og为嗜锇颗粒；图3为asl4基因的图位克隆结果；其中，a为asl4基因的初定位；b为asl4基因的精细定位；c为定位区间的候选基因预测；d为候选基因orf3，即asl4的结构和突变位置；图4为水稻幼苗致死基因asl4的特异性indel引物对该基因的pcr扩增结果，1为普通水稻pcr扩增产物，2为纯合的含有幼苗致死基因水稻pcr扩增产物；图5为pcambia1305载体图谱；图6为asl4的转基因互补结果；a为野生型、突变体asl4和转基因植株的分子检测和表型；b为野生型、突变体asl4和转基因植株的叶绿素含量分析。com1和com2代表转基因阳性植株，com-v为空载体转基因对照植株。具体实施方式实施例11、材料本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品，所用作物品种，若无特别说明，均为市售购买的常规品种或国家种质库保存的品种。2、方法2.1水稻幼苗致死突变体asl4的获得及表型分析利用mnu(单甲基亚硝基脲)化学诱变水稻品种农院238，获得农院238的mnu化学诱变突变体库(该突变体库由安徽省农业科学院水稻研究所保存和提供)，从突变体库中得到幼苗致死突变体als4，该突变体苗期二叶期和三叶期均表现出明显的白化表型，四叶期开始，突变体逐渐萎缩死亡。通过对二叶期和三叶期野生型和突变体地上部分进行色素分析表明突变体asl4几乎不能合成叶绿素和类胡萝卜素(图1)。利用透射电镜观察三叶期野生型和突变体叶片中叶绿体超微结构，发现野生型叶片能够发育含有正常片层结构的叶绿体(图2a)，而突变体叶片中叶绿体数目减少，且叶绿体结构异常，不能正常分化(图2b-d)。上述的叶绿素和类胡萝卜素的测定方法如下：①分别从二叶期和三叶期野生型和突变体地上部分叶片中剪取相同重量的叶片在5ml95％乙醇中黑暗处理48h，中途每12h颠倒摇晃一次；②12000rpm离心2min，上清用分光光度计测定665nm、649nm和470nm下的吸光值，3次重复；③根据公式叶绿素a浓度ca＝13.95*d665-6.88*d649；叶绿素b浓度cb＝24.96*d649-7.32*d665；类胡萝卜素x浓度cx＝(1000*d470-2.05ca-114*cb)/245计算各色素的浓度(其中d665、d649和d470分别代表665nm、649nm和470nm下的吸光值)；④最后计算组织中各色素的含量：叶绿体色素含量＝(色素浓度(c)*提取液体积*稀释倍数)/样品鲜重(mg/g)。上述透射电镜的具体操作步骤如下：①三叶期剪取野生型和突变体asl4的新鲜叶片，横切成2mm左右的薄片，利用2.5％的戊二醛溶液(配方：0.2mna2hpo4-nah2po4(ph7.2)50ml，25％(体积比)戊二醛10ml，ddh2o定容至100ml，4℃避光保存)室温固定24h；②继续用1％(体积比)oso4固定，利用醋酸氧铀染色，进一步丙酮系列脱水(50％-70％-80％-90％(体积比)，各浓度处理15min，再用100％丙酮脱水3次，每次30min)；③将处理后的样品包埋在树脂中，干燥器保存；④利用leica超薄切片机制成50-90nm切片，再次染色，并在hitachih-7650透射电镜下观察。2.2突变基因asl4的遗传分析和基因定位突变体asl4经过多代自交选择，性状稳定遗传，由于asl4幼苗致死不能繁殖，故保留其杂合体亲本，杂合体亲本当代表型出正常野生型表型，但其自交后代出现正常与白化植株的分离，且比例符合3∶1，说明该突变性状受单隐性核基因控制。利用覆盖水稻12条染色体的205对indel标记，筛选亲本asl4和水稻南京11品种的多态性，挑选asl4/南京11f2群体中10个白化幼苗进行连锁分析，将目标基因定位在水稻第三染色体断臂上；进一步用92个具有白化表型的极端个体将目的基因定位于标记c3-16和k5之间1.03m的区域内(图3a)，扩大定位群体，设计新的indel标记，最终将目的基因定位于标记k40与k29之间50kb区间内(图3b)；通过rgap数据库对定位区间进行基因预测，发现该定位区间包含三个候选基因(图3c)，分别为逆转座子蛋白编码基因(loc_os03g20080)、myb家族转录因子编码基因(loc_os03g20090)和叶绿体30s核糖体蛋白s1编码基因(loc_os03g20100，即asl4)，所述叶绿体30s核糖体蛋白s1编码基因的dna序列如seqidno.2所示，该蛋白编码基因的cds序列如seqidno.3所示，所述叶绿体30s核糖体蛋白s1的氨基酸序列如seqidno.1所示；进一步通过基因组测序发现该叶绿体30s核糖体蛋白s1对应的dna序列从其第4内含子的37bp到终止密码子tga下游2312bp处存在2855bp的序列缺失(图3d)，该缺失部分即为导致水稻幼苗白化致死的关键基因序列。上述基因定位的方法如下：(1)植株总dna的提取方法如下：①苗期三叶期从asl4/南京11的f2群体中挑选具有白化表型的极端个体，分单株取样，放入2.0mlep管中，加入钢珠，液氮冷冻后利用磨样器磨成粉末；②向样品中加入400μl的2×ctab提取液(提取液配方为：ctab20g，nacl81.9g，0.5medta40ml(ph8.0)，1mtris-hcl100ml(ph8.0)，加ddh2o定容至1l，灭菌后使用)，65℃温浴30min，每10min摇晃一次；③加入400μl的24∶1(氯仿∶异戊醇，v/v)，震荡混匀，12000rpm离心5min；④吸取200μl上清至一1.5mlep管中，加入400μl预冷的无水乙醇，轻摇混匀，-20℃放置30min，12000rpm离心5min，去上清，沉淀室温晾干，加入200μl灭菌ddh2o溶解2h以上，4℃保存备用。(2)indel标记开发方法如下：根据网上公布的水稻品种日本晴和9311基因组序列，找到定位区间序列，选择差异片段3bp以上20bp以下的区间，利用primerpremier5.0软件设计indel标记引物，标记扩增片段大小为120-220bp；表1：用于基因定位的部分indel标记引物名称正向序列(5’-3’)反向序列(5’-3’)c3-16cgaggacagcaggaataaggagtttacgagttgccaagcak5cggactcctctgatacgataggcattttgcaccatacak20ggtttcagatttgccacgttcattccgcatttggtck22acatctgaatctcacaaccgaaaaagatccaaggagtatgacgak27ttgagggatacgatttagattcattcgacctgcccgttagtk29ccaaccgtttctacgttgacttgtagcccgtatgctcttctck31tttactcgccgctttggaccagcagggaggattgggatk40cggacgacgaggcgaaccaggagcagcgtgcggctg(3)pcr扩增方法如下：pcr反应体系为10μl，其中包括dna模板2μl(约20-200ng)，前后引物各0.5μl，10×pcr缓冲液1μl，25mm的mgcl20.6μl，1mm的dntp混合液0.3μl，rtaq0.1μl，ddh2o补至10μl；pcr反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，33个循环；72℃5min，4℃10min。(4)pcr产物检测利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，具体操作步骤如下：①100ml的8％(质量)聚丙烯酰胺凝胶电泳工作液配置：40％(质量)丙烯酰胺20ml，10×tbe10ml，ddh2o70ml，10％(质量)ap1.2ml，temed100μl。其中40％(质量)丙烯酰胺配方为：丙烯酰胺380g，n，n-亚甲双丙烯酰胺20g，ddh2o定容至1l，过滤后4℃保存备用；10×tbe配方为tris碱108g，硼酸55g，0.5medta40ml(ph8.0)，ddh2o定容至1l，4℃保存备用；10％(质量)ap配方为过硫酸铵10g，ddh2o定容至100ml，4℃保存备用。②电泳检测：凝胶工作液制备好后，倒入胶槽，插入梳子，放置30min以上；pcr产物中加入2μl6×loading缓冲液，混匀后，上样2μl，230v电泳70min。③银染显色：利用ddh2o配置千分之一质量浓度的agno3染色液(现配现用)，染色液的体积为每两块胶50-100ml；将胶块卸入配好的染色液中，30rpm轻摇染色12min；倒去染色液，ddh2o漂洗2-3次，去除残液，加入与染色液等体积的显色液(100ml显色液配方为：naoh1.5g，甲醛溶液1ml，ddh2o补至100ml)，30rpm轻摇显色，直到出现条带为止；去除显色液，自来水清洗胶块2-3次，利用保鲜膜保存胶块，晾干后读取数据。2.3叶绿体核糖体蛋白asl4编码基因的克隆根据网上公布的水稻日本晴序列和步骤2.2的asl4蛋白的编码基因设计克隆引物：seqidno.8：asl4-f：5’-atggcgtccctggcgcagcacgt-3’seqidno.9：asl4-r：5’-ctattcatctgtggtttgccc-3’分别以野生型基因组dna和cdna为模板进行pcr扩增，扩增产物回收后连接到平端载体peasy中进行测序，结果与预测结果一致，获得如seqidno.3所示的asl4的基因组序列和如seqidno.2所示的asl4的cds序列。2.4水稻幼苗致死基因序列的克隆根据网上公布的日本晴序列和步骤2.2获得的水稻幼苗致死的基因序列设计多对引物，对野生型农院238和突变体asl4进行pcr扩增，选择能够扩增获得差异片段的引物为indel标记：seqidno.4：asl4-f：tgtggaggtcgatgaggaaseqidno.5：asl4-r：gagggagtataagattggtgagaa2.5水稻幼苗致死基因序列的检测利用核苷酸序列seqidno.4和seqidno.5为前后引物进行基因检测，pcr扩增普通水稻和含有水稻幼苗致死基因的基因组dna并进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到如seqidno.6所示的3348bp大小的核苷酸序列和如seqidno.7所示的493bp大小的核苷酸序列(图4)。基因检测的方法如下：①pcr反应体系为50μl：dna模板为3μl(50-200ng)，前后引物(10pm)各为2.5μl，kod缓冲液25μl，2mmdntp混合液10μl，kod酶1μl，加ddh2o补至50μl；反应程序为：94℃3min；98℃10s，60℃30s，68℃1-4min(1kb/min)，33个循环；68℃7min，4℃10min。②电泳检测：称取1g琼脂糖，加入100ml1×tbe缓冲液，混匀后微波炉加热至固体完全溶解，加入5ulgenecolour核酸燃料，轻摇混匀，倒入胶槽；凝胶制备好后，放置30min，pcr产物中加入2-4ul6×loadingbuffer，混匀后，上样5ul，160v电泳40min；观察记录数据：利用bio-rad凝胶成像系统拍照记录数据。根据pcr产物的琼脂糖凝胶电泳结果进行基因型鉴定，若仅含有3348bp条带，为野生型普通水稻，若仅含有493bp条带，为纯合als4基因型水稻，若含有3348bp和493bp条带，为含有水稻幼苗致死基因的杂合体水稻。2.6asl4基因的功能验证将野生型asl4的基因组序列6124bp(包括1523bp启动子区、完整的编码区和638bp的终止区)同源重组到载体pcambia1305(载体图谱如图3所示)中，获得含有asl4基因的植株表达载体pcambia1305-gasl4。利用杂合体亲本种子制备愈伤，利用步骤2.5的方法检测愈伤的基因型，挑选含有纯合asl4基因型的愈伤，利用农杆菌介导的方法将pcambia1305-gasl4转化到愈伤组织中；同时将空载体pcambia1305以同样的方式转化到含有纯合asl4基因型的愈伤中作为对照，获得转基因植株。进一步利用分子标记kf对转基因单株进行检测，结果显示转基因对照植株中未检测到野生型目的条带，表型和叶绿素含量与突变体无明显差异；然而，在pcambia1305-gasl4转基因植株中检测到野生型目的条带，这些单株即为阳性植株，分析显示这些阳性植株的表型恢复到正常水平(图6a)，叶绿素含量恢复到正常水平(图6b)。上述分子标记kf序列为：seqidno.10：kf-f：5’-tgcaaccaggagatacgctca-3’seqidno.11：kf-r：5’-ctaagatgccctctgaactga-3’3、结论本发明利用农院238的mnu化学诱变突变体库获得了水稻幼苗致死突变体材料，经多代自交选择，性状稳定遗传。对该突变体进行遗传定位和基因预测，结果发现了本发明的新的功能基因，该基因为编码叶绿体30s核糖体蛋白s1的基因。对突变体进行进一步基因组测序，结果发现，该基因的dna序列的第4内含子的第37bp到tga下游2312bp处的2855bp的序列缺失。最后，利用转基因技术，构建asl4基因组互补载体(pcambia1305-gasl4)并转化到纯合asl4缺失突变体中，发现转基因阳性植株的表型和叶绿素含量均恢复到正常水平，进一步证实asl4基因为一种新的与叶绿素合成和叶绿体发育相关的基因(叶绿体30s核糖体蛋白s1编码基因)，为研究植物生长、发育、遗传及光合作用原理，进一步利用基因工程手段培育高光效的作物品种提供了依据。以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。sequencelisting<110>安徽省农业科学院水稻研究所<120>一种水稻叶绿体核糖体蛋白及其编码基因和应用<130>/<160>11<170>patentinversion3.3<210>1<211>402<212>prt<213>oryzasativa<400>1metalaserleualaglnhisvalalaglyleualaserproproleu151015serglyalaproargargargproalaalaprothrargproserala202530leuvalcysglythrtyralaleuthrlysglugluarggluargglu354045argmetcysglnleupheaspglualasergluargcysargthrala505560prometgluglyvalserpheserprogluaspleuaspseralaval65707580gluserthraspileaspthraspileglyserleuilelysglythr859095valphemetthrthrserasnglyalatyrvalaspileglnserlys100105110serthralapheleuproleuaspglualacysleuleuaspvalasn115120125hisilegluglualaglyileargalaglyleuvalglugluphemet130135140ileileaspgluasnproglyaspgluthrleuileleuserleugln145150155160alaileglnglnaspleualatrpgluargcysargglnleuglnala165170175gluaspvalvalvalthrglylysvalileglyglyasnlysglygly180185190valvalalaleuvalgluglyleulysglyphevalprophesergln195200205valserserlysserthralaglugluleuleuasplysgluleupro210215220leulysphevalgluvalaspglugluglnglyargleuvalleuser225230235240asnarglysalametalaaspserglnalaglnleuglyileglyser245250255valvalleuglythrvalgluserleulysprotyrglyalapheile260265270aspileglyglyileasnglyleuleuhisvalserglnileserhis275280285aspargvalalaaspileserthrvalleuglnproglyaspthrleu290295300lysvalmetileleuserhisasparggluargglyargvalserleu305310315320serthrlyslysleugluprothrproglyaspmetileargasnpro325330335lysleuvalpheglulysalaaspglumetalaglnilephearggln340345350argilealaglnalaglualametalaargalaaspmetleuargphe355360365glnprogluserglyleuthrleusersergluglyileleuglypro370375380leuserseraspthrprosergluglyserglygluglyglnthrthr385390395400aspglu<210>2<211>3963<212>dna<213>oryzasativa<400>2atggcgtccctggcgcagcacgtcgcggggctggcgagcccgccgctctccggcgcgccg60cggcgccgccccgcggcgcccacgcggccgtcggcgctggtgtgcgggacgtacgcgctc120accaaggaggagcgggagcgggagcggatgtgccagctgttcgacgaggcctccgagcgc180tgccgcaccgcgcccatggagggcgtctccttctcgcccgaggacctcgactccgccgtc240gagtccaccgacatcgacaccgatatcggctcactcgtaatccaccccccgcaaccttcc300tcctgttcttctcaatcgtccttgctcgctcgtatgatgtgaaacagatagtagcaattg360gtgcttaaaaacaggcttaactttcagtaggtgatgcctcgttttcctgcaagtcacttg420agtcttaccttgtgctcaattggatacggcttgcgggagattggagtcacttgccctgta480tatgtcactagttgttacatttcggtttgctagttgttttaggctatcaacaacaaggtg540attggttactgaaagttacccaactagaattctattgtttgcttgcttggaatgtgctct600gcgcatcatgattcgtctataatgtgttactcccctaaggtacaagcgaaagaatgttca660gtttactacaagtacctcttccattttctgacctgctcatagtggtagcaggtatagtga720taatcaggaatagtagtttcattagcccttacctgttatgttttgccttttgtgaaacta780gttgaacgctagaactcacgcaattgtgtggcttcatctaaataatttagttgttttttc840aataatgtttactaaaaaaatatatatgt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