LOC100130111在制备骨肉瘤诊断产品、治疗药物中的用途的制作方法

本发明属于生物医学领域，涉及loc100130111在制备骨肉瘤诊断产品、治疗药物中的用途。

背景技术：

骨肉瘤是来源于间叶组织的恶性肿瘤，其主要致病特征为体内增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织。是一种人类骨骼系统最常见的原发性恶性肿瘤。典型的骨肉瘤是一种罕见的(占全部恶性肿瘤的0.2％)高致癌恶性肿瘤，其发病率约每年每一百万人里有三例。骨肉瘤主要出现在较长的骨骼以及少部分的软组织。其主要发病人群集中在10～20岁青少年，具有发病率高，早期转移率高，治愈生存率低等特点。x-射线，断层摄影技术，核磁共振，血管造影技术以及动态骨闪烁摄影技术等广泛应用于该病的诊断、肿瘤发生的程度及手术类型判断等等。但是利用上述临床手段进行骨肉瘤的诊断，常常导致患者的病情延误，错过最佳治疗时期。因此寻找一种骨肉瘤早期诊断标志物是亟待解决的问题。

人体中编码蛋白质的基因大约有2-3万个，仅占人类基因组的2％，其余98％不编码蛋白质的基因组dna最初被认为是没有功能的，是生物体中的垃圾，通常被称为“垃圾dna”。但目前的研究表明，这些垃圾dna大多可转录产生非编码rna(non-codingrna，ncrna)。根据成熟转录本大小的不同，ncrna可分为小分子ncrna(如sirna，mirna，pirna等)，中等长度ncrna(70-200nt)和长ncrna(longncrna，lncrna，>200nt)。

目前，ncrna领域研究较多的是小分子ncrna，而对lncrna的研究还处于起步阶段。由于序列内部存在过多的终止密码子，lncrna不能被翻译成蛋白质，他们通常是以rna转录本的形式行使其生物学功能，如发育过程中的细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡和类固醇代谢等。

最近的研究发现lncrna与肺癌、非霍杰金淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病有关。这表明lncrna与细胞的癌变有着极为密切的联系，lncrna在细胞增殖、分化和癌变中发挥着重要的作用。目前，已经克隆的人类lncrnas基因已超过4万多个，但绝大部分lncrna的功能未知。

目前，有关lncrna在骨肉瘤的发病机制、疾病诊断及治疗方面的研究基本空白，因此本申请利用生物信息学分析研究探讨lncrna在骨肉瘤的发病机制、疾病诊断及治疗方面的的作用，同时为后续深入研究提供实验基础及研究方向。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于诊治骨肉瘤的长链非编码rna标志物。本发明利用实验证明loc100130111在骨肉瘤组织中的表达水平明显高于在癌旁组织中的水平，因此可以将loc100130111作为诊治骨肉瘤的分子标志物。

为了实验上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测长链非编码rna表达的试剂在制备骨肉瘤辅助诊断或预后预测产品中的应用。

本发明的长链非编码rna在ncbi中的命名为loc100130111，其基因id：100130111，loc100130111的转录本序列是genbank登录号nr_135221.1(具有2580bp的长度，相应的dna序列如seqidno.1所示)。

进一步，所述试剂包括利用sybrgreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测loc100130111表达量时使用的pcr扩增引物。

在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如seqidno.2和seqidno.3所示。

本发明提供了一种用于骨肉瘤辅助诊断或预后预测的产品，所述产品包括检测loc100130111表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括sybrgreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测loc100130111表达量时使用的pcr扩增引物。

在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如seqidno.2和seqidno.3所示。

进一步，前面所述的产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断骨肉瘤的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的rna表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的rna表达谱，容易分析出哪个rna的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知非loc100130111的异常与骨肉瘤相关也属于loc100130111的用途，同样在本发明的保护范围之内。

所述试剂盒包括检测loc100130111表达量的试剂，所述试剂包括与loc100130111或其dna序列结合的核酸，所述核酸包括sybrgreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测loc100130111表达量时使用的pcr扩增引物。

所述芯片包括检测loc100130111表达量的试剂，所述试剂包括与loc100130111或其dna序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测loc100130111表达量的探针。

所述试纸包括检测loc100130111表达量的试剂，所述试剂包括与loc100130111或其dna序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测loc100130111表达量的探针。

本发明提供了一种用于治疗骨肉瘤的药物组合物，所述药物组合物包括loc100130111的抑制剂。

进一步，所述抑制剂不受限制，只要是可以抑制loc100130111表达水平或抑制loc100130111功能活性即可。

所述抑制剂包括loc100130111的sirna或shrna。在本发明的具体实施方案中，所述loc100130111的sirna序列如seqidno.6和seqidno.7所示。

本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可。

本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

本发明还提供了前面所述的抑制剂在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。

本发明还提供了一种诊断骨肉瘤的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中loc100130111的表达水平；

(3)将测得的loc100130111的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与对照相比，loc100130111的表达水平升高，则该受试者被判断患有骨肉瘤、或者该受试者患有骨肉瘤的风险高、或者骨肉瘤患者被判断为预后不良。

本发明还提供了一种骨肉瘤的治疗方法，所述方法包括降低loc100130111表达量或者抑制loc100130111的功能活性。

本发明还提供了一种骨肉瘤药物的筛选方法，可以通过在对骨肉瘤细胞添加测试药物后或在对骨肉瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量loc100130111的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当loc100130111的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后的治疗药物。

在本发明的上下文中，“诊断骨肉瘤”包括判断受试者是否已经患有骨肉瘤、判断受试者是否存在患有骨肉瘤的风险、判断骨肉瘤患者对药物治疗的反应性、或者判断骨肉瘤患者的预后情况。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

本发明的优点和有益效果：

本发明的发现了一种诊断骨肉瘤的分子标志物，使用该分子标志物可以在骨肉瘤发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。

本发明的包括loc100130111的抑制剂的治疗药物可用作新的骨肉瘤的治疗药物。

附图说明

图1显示利用qpcr检测loc100130111在骨肉瘤组织中表达情况的统计图；

图2显示利用qpcr检测loc100130111表达抑制情况的统计图；

图3显示抑制loc100130111表达对骨肉瘤细胞增殖影响的统计图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选差异表达非长链编码rna

1、研究对象：

选取医院骨科行手术治疗精细切除的3例骨肉瘤患者的典型肿瘤标本及3例正常的癌旁组织，肿瘤标本病理诊断均证实为骨肉瘤。手术所取标本立即分管装入冻存管速冻，离体至速冻之间均小于30min。

2、组织rna总提取

2.1组织匀浆

取约50mg组织样品放入高温灭菌处理后的研钵内，加入的1ml的trizol溶液，充分研磨组织用移液枪移入1.5ml的离心管内，颠倒混匀10下，室温静置10分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

2.2分离阶段

4℃，12000rpm离心5-10分钟，取上清。离心得到的沉淀包含细胞外膜、多糖、高分子，上清液中含有rna。取澄清的匀装溶液加入0.2ml的氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，使其充分混勻，室温静置5分钟。再次4℃，12000rpm离心10min，样品会分成三层，rna主要在上层水相中，将上层水相转移到新管的新管内(约500μl)，注意不要吸到中间层和下层液体，否则会造成dna和蛋白污染。

2.3rna沉淀

在新管内加入0.5ml预先冷冻的异丙醇，混匀后放置于-20℃中30分钟，后4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清。离心前rna沉淀经常不可见，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。

2.4rna洗涤

小心倒掉上清，留取沉淀。加入1ml的75％乙醇(用depc水配制)，涡旋振荡混匀样品洗涤沉淀rna，如不能涡旋混匀，可用手动剧烈颠倒混匀2分钟。然后4℃，7000rpm离心5分钟。

2.5rna再溶解

离心后小心弃上清，可用移液器小心吸取上清，注意不要吸到沉淀。室温晾置10分钟左右干燥rna沉淀，注意不要让rna沉淀完全干燥以免降低rna的溶解性。最后用适量的depc水溶解沉淀，待完全溶解后分成小份-70℃保存或者立即进行逆转录。

3、rna质量检测

组织总rna纯度和浓度的测定

使用nanodropnd-1000型紫外分光光度计测定组织总rna的浓度和纯度，首先需要使用depc水进行背景调零后进行测定，操作步骤如下：

(1)滴加1μldepc水(调零)或者rna样品至测量基座的表面；

(2)液滴会自动在上下基座之间形成液柱并自动完成测定，rna浓度及质量的各种参数将会在电脑自动生成参数文件；

(3)测定完一个后，擦拭干净上下基座表面的样本液体后再进行下一个样本的测定；

(4)测定结果：

浓度计算：

a260下读值为1表示40μgrna/ml。样品rna浓度(计算公式为：a260*稀释倍数*40μg/ml。具体计算举例如下：

rna溶于40μldepc水中，取5μl1:100稀释至495μl的depc水中，测得a260＝0.21，rna浓度＝0.21*100*40μg/ml＝840μg/ml

取5μl用来测量后，剩余样品rna为35μl，剩余rna总量为：35μl*840μg/ml＝29.4μg；

纯度检测：

rna溶液的a260/a280比值是一种rna纯度检测的常用方法，理想的纯的rna其od260/a280的比值是1.8-2.1，纯度越高越接近2.0

od260/a280的比值>2.1或者<1.8都认为是rna污染。

4、组织总rna完整性测定

经1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，检测rna的完整性。

5、芯片实验

申请人选择美国arraystar公司提供的12*135k的humanlncrnamicroarray(v2.0)芯片，该芯片数据来源几乎包含了所有权威lncrna数据库，如ncbirefseq，ucscknowngene6.0，gencodev13，rnadb2.0，nred，lincrnas，同时也对mrna序列研究，mrna数据主要来源于thecollaborativeconsensuscodingsequence(ccds)project。

5.1lncrna芯片杂交：

主要步骤如下：

(1)合成双链互补crna：

使用invitrogensuperscriptds-cdna合成试剂盒，取5μg总rna加入100pmol的oligodtprimers(特制引物)，按照invitrogensuperscriptds-cdna合成试剂盒手册合成；

(2)标记纯化双链互补cdna

ds-cdna严格按照nimblegengeneexpressionanalyisis操作手册纯化和标记，简单来说，先把4μg的rnase加入到ds-cdna中在37℃中孵育10分钟，然后用苯酚-氯仿-异戊醇混合液清洗接着用冰冻乙醇进行沉淀；标记ds-cdna按照nimblegengeneexpressionanalyisis操作手册使用nimblegenone-colordna标记试剂盒，先取1μg的ds-cdna，加入1od的cy3引物在98℃中孵育10分钟，然后加入100pmol三磷酸脱氧核糖核酸和dna聚合酶羧基端大片段(并充分混合在37℃中孵育2小时。最后加入0.1体积的0.5medta反应液终止反应，最后用异丙醇乙醇沉淀进行纯化；

(3)标记效率质量检测：用nanodropnd-1000对ds-cdna进行效率质量检测；

(4)芯片杂交：

将4μg标记有cy3荧光染料的ds-cdna和microarrays芯片放进nimblegenhybridizationbuffer液中，在杂交培植室内42℃孵育16-20小时，将杂交后的芯片在ozone-free环境下按照nimblegenwashbuffer试剂盒手册进行清洗；

5.2图像采集和数据分析

清洗后的芯片放入axongenepix4000b芯片扫描仪，打开genepix6.0软件以5μm像素的分辨率进行扫描，获得的扫描图像以tiff格式输入到nimblescan软件进行网格对齐和数据分析。这些数据需要通过分位数标准化和稳健多芯片平均标准化分析，从而获得标准化的芯片表达数据，再把数据输入到agilentgenespringgx软件进行分析，图像定量和标准化数据处理全部完成后以列表形式输出数据，获得的mrna和lncrna数据，经过折叠倍率筛选，筛选出差异表达的mrna和lncrna数据重新制作成差异表达的mrna和lncrna数据，表达差异巨大的mrna和lncrna用散点图和火山图标示出来，同时应用软件agilentgenespringgx软件的聚类分析图表对数据进行聚类分析。

13、结果

经过图像采集和数据分析后得到了mrna和lncrna的数据，设定表达差异的标准：foldchang≥2.0，p值≤0.05。根据这个标准筛选得到两组之间差异表达的mrna和lncrna。筛选获得的数据显示，骨肉瘤组织和正常组织相比，有875个lncrna差异表达，其中上调569个，下调306。

实施例2大样本验证筛选出的差异表达基因

基于实施例1的筛选结果，根据pvalue的大小，选择loc100130111进行验证。

1、样本收集

按照实施例1的方法收集骨肉瘤组织及正常癌旁组织各50例。

2、在转录水平上进行验证

试剂：反转录试剂盒(ddr037a)购自宝生物工程(大连)有限公司。荧光实时(real-time)定量pcr(polymerasechainreaction)所用的sybrpremixextaq^tm(tlirnasehplus)试剂盒为日本takara公司生产。

2.1提取组织rna

步骤同实施例1。

2.2引物设计

根据loc100130111转录本序列，通过ncbi的引物设计工具(primerblast)设计引物，上游引物：5’-ggaagaatgaacgaatgg-3’(seqidno.2)；下游引物：5’-attacctatgaaggagaagaa-3’(seqidno.3)。

根据gapdh(内参基因)序列设计引物，上游引物：5’-ctctggtaaagtggatattgt-3’(seqidno.4)；5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.5)。

2.3cdna合成

以提取的总rna(1μg)为模板，加入以下反应体系，具体为：buffer4μl，rtenzymemix1μl，oligodtprimer(50μm)1μl，random6mers(100μm)1μl，以无rna酶的ddh2o将反应体积补足为20μl。将上述混合液置于37℃15min，85℃5s，即获得cdna。该cdna可用于lncrnareal-timepcr检测。

2.4real-timepcr

按日本takara公司的premixextaq^tm(tlirnasehplus)试剂盒推荐的引物最适浓度(10μm)，将loc100130111引物以去离子水溶解，并建立以下反应体系：sybrpremixextaq^tm(2×)25μl，roxreferencedye(50×)1μl，pcr上游引物(10μm)1μl，pcr下游引物(10μm)1μl，cdna4μl，灭菌ddh2o18μl。以95℃20s预变性，按95℃10s变性、60℃20s退火、70℃10s延伸过程循环40次，获得ct值。结果釆用相对定量法，运用公式2^-△△ct计算。实验重复3次。

3、结果

结果如图1显示，与正常组织相比，骨肉瘤组织中loc100130111表达水平显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。

实施例3抑制loc100130111表达

1、细胞培养

将骨肉瘤细胞株143b用含10％胎牛血清，青、链霉素各100u/ml的rpmi1640于37℃、5％co2的饱和湿度箱中培养。

2、sirna设计

sirna(smallinterferingrna)的设计：通过blast检索，在loc100130111的特异性序列区域设计sirna序列：

sirna-loc100130111

正义链：5’-uccauuagcagcauuuggcac-3’(seqidno.6)；

反义链：5’-gccaaaugcugcuaauggaca-3’(seqidno.7)。

上述sirna由上海吉玛制药技术有限公司合成，同时该公司提供阴性对照sirna(sirna-nc)。

3、细胞转染

取对数生长的骨肉瘤细胞株143b细胞，接种于培养板，加培养液，培养24h(细胞长至70-90％满)，按lipofectamine2000(invitrogen)说明书进行转染实验，48h后收rna用real-timepcr检测。

4、利用qpcr实验检测sirna的干扰情况

4.1提取细胞总rna利用常规方法进行操作。

4.2cdna合成

步骤同实施例2。

4.3qpcr

步骤同实施例2。

4.4结果

结果如图2所示，抑制loc100130111表达成功，差异具有统计学意义(p<0.05)。

实施例4抑制loc100130111表达对骨肉瘤细胞增殖能力的测定

1、步骤：

将转染24小时后的骨肉瘤细胞143b接种于96孔细胞培养板中，每孔2*10³个细胞/孔/200μl，细胞分组如下：

实验组1(对照组)：骨肉瘤细胞转染sirna-nc；

实验组2：骨肉瘤细胞转染sirna-loc100130111。

将细胞在37℃、5％co2培养箱再次孵育24小时后，根据brdu细胞增殖试剂盒(chemiconinternational)的说明书，测量细胞增殖速率。

2、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

3、结果

结果如图3所示，相比于实验组1，实验组2的细胞增殖减缓，差异具有统计学意义(p<0.05)。上述实验结果表明，抑制loc100130111表达可以抑制骨肉瘤细胞增殖。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>固安博健生物技术有限公司

<120>loc100130111在制备骨肉瘤诊断产品、治疗药物中的用途

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2580

<212>dna

<213>人源(homosapiens)

<400>1

gggatccgcccctccgccagccccgctggcttcccctctccgccaccccggactcagaac60

ctcccctcccccgccggggcctgggcgcgcctgcccttcgctccccgacctcctgctgca120

gctctgggcccctcggccgctccctcccctcctcccttgctcaccccacggttggccgcg180

gatctccagcacgccgccccagtcctcggcgtcccgcagcgcctgccagggtcgccgagc240

ctcccctgcctcctggccgcctctgcagtgccgtcctcccggggctggctctctccccag300

gcccccgctttggccacccaggcactttccgccctgagcgtggcagctgctgccgggggt360

cctgggaccgcgggatgggaactcccacgcagcgtcccacaggctcctggccgccgcgag420

cccgcgcgactcgcacgagcatgtccacccgcagcgaggggccggtcactgctacggagc480

ccgccagaaggcaaagccccagacagcaaatagggaggcggctggcacccagggaggccg540

aggcgggaggatcgctggagcccaggagttcgagacctgccttggcaacatactccctcc600

agcgtgccaaatgctgctaatggacagccgctcctgccgctctgatgttgctagacctcc660

tcagcactcagcccaaggcagccaggaagaatgaacgaatggtgattcagagggaaagga720

ggaagctgcgtggcatttcagagatacttattttaaaactgctggtggccatgtcttctt780

ttcatatcagagctaatgagttttgatatgtgaacatttcttctccttcataggtaatgt840

gttgatttggcactttaatcttagaataatcatttctaaaaccaacccaactgcttttct900

ttacaattttggccttagcaaacagatgagtccgttgacttgagcattgcttgggcactg960

tctgtgtgcaggtcaggcaggggatgctggtggctgggaaacatagaggatggaggtgtc1020

ttgggtgtacatgaaggggtggggtcaagtccacagggggtcggcccctggcagcagtcc1080

tggagggcttcgtggaggaagggagaattgagtgagaaagtggtccccaggtaagaggga1140

agagcatccagggagaggagactgcttctgggaagaccagaggcatcacctcgcaggggc1200

tggtatggtggtggctcaggtgggaggaagagagacctcagggaaaataacaggttccat1260

tgacaggaggcctgctctggtggggaggcaggctggtggtggagtcatggctgcaggcca1320

gggagatgcctgaccaacaggtgtgttggccagggtccctgtagcaaaaacacggagctg1380

aggacctcatggcagggaccccatgcagagggagccgcgggtggcatggggatagtcacc1440

tggctctcctgctctcggcctcctgcagctcccctcactccctgccctgccacacaaggt1500

caaacccaccaggaggcagaaggcgaagggcgaggtcccagggtgaggagcagggaggag1560

atggtggcagcagggaaggtgatgcctgctgcagagtgagacctgggactgccaaacaca1620

cagtgacgggagctgaggaggcctgccgggggaggaagacagtggctggcagtgacagga1680

agggagggtcagcatggggcggcagtcccagagctcagggctccctgccaggccagcctt1740

tgtggcctgtggggtggaggtggcaattgctgtcatgtcataaacacgtcaagcttacaa1800

tgaaatctccagtgtggcttgggagcaaatacatgtgcaggtgtttgagtatctgtgctc1860

ttacctaacctcagggagcaggaaaacgaaagcttatcatgtaaacacatcagcagcagg1920

gcttatgtgtgtctccacactggaacccccaagacaagagactggaggcagagttgattt1980

ccaagcccagagtgctgggcagcctttgggttttatgtctgcttgcttggagctcagtga2040

tagaaatctaggccccagaagaggaaaggactgtcctgcataaccagcacacccggggaa2100

tgcttcaggtgcagctggatccaggcatcctcaaatagtgtgattaggactccactttcc2160

tttgtcaccttggcttggctcttccctgctctgtgttgttttcagacgaggtggggcccc2220

agcagctctggtcctcctgacatcctagagaagagccagcccttccctcctggggtctac2280

accgtcccctaagggacctcagactgggctgatggaaggtctcaagcaggccatgtgaag2340

ggcactgcacaggaaacacagaaacgggaatcctataaggtcagcagagctctgagccct2400

ttgttcttgggcctgtttttatgatcctccctctacatgtagctcacacttccctgcttc2460

tgtgcaggcaccaggtgagggggttgtcatggcctcctgccactcttgaggctgtcagat2520

attacctgtgctgtccctgcattctcaagctccaaattgtcaactaagaaatggtcactt2580

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggaagaatgaacgaatgg18

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

attacctatgaaggagaagaa21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ctctggtaaagtggatattgt21

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ggtggaatcatattggaaca20

<210>6

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

uccauuagcagcauuuggcac21

<210>7

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gccaaaugcugcuaauggaca21