一种从海带加工废液中提取岩藻聚糖硫酸酯的新工艺的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种从海带加工废液中提取岩藻聚糖硫酸酯的新工艺。

背景技术：

岩藻聚糖硫酸酯，又称褐藻多糖硫酸酯、褐藻糖胶，是一种极性大分子化合物，因为其结构中含有大量的羟基所以其在水中有很好的溶解度。正是因为褐藻多糖硫酸酯的这一结构特点，目前，国内外大部分采取的提取方法都是以水作为溶剂，通过改变水的一些理化性质来提取褐藻多糖硫酸酯，比如采用稀碱、稀酸与热水浸提方法提取。利用这些方法最重要的原因是操作方便，又兼备成本不高工艺不难等优点，但也存在着很多问题，首先其存在提取率较低、过滤纯化困难等缺点，重要的是还会很大程度地破坏褐藻多糖硫酸酯的活性，为褐藻多糖硫酸酯的大规模工业化生产增加了很大的难度。近年，基于最常用的浸提法，人们又发展了新型提取技术，如微波辅助提取、超声波辅助提取与酶解辅助提取，这些方法在提高提取率的同时也增加了提取的成本，还会造成褐藻多糖硫酸酯的某些理化指标降低，这为褐藻多糖硫酸酯的大规模工业生产带来了巨大的挑战。大孔树脂吸附法提取褐藻多糖硫酸酯作为一种全新的提取思路，大孔树脂吸附法具有工艺简单、操作方便、成本低等优点，与传统的提取方法的区别在于其提取率相对更高，更重要的是纯化工艺相对简单。如果这种方法可行，这对于褐藻多糖硫酸酯的大规模工业化生产具有非常重大的意义。

大孔吸附树脂(mar)又称聚合物吸附剂，是一种人工合成的有机高分子聚合物，具有特殊的空间立体结构。凭借其特殊的理化性质(不溶于酸碱和有机溶剂)和吸附功能(选择性吸附有机物)，在近年来被广泛应用于医疗，药物还有食品加工等领域。大孔树脂吸附除了具有一定的选择性，还会受吸附热力学，动力学还有构效关系的影响。其中目标靶分子的构效关系对大孔树脂的影响最为突出。由于大孔树脂吸附也存在高选择性和专一性，所以研究好构效关系对于特定树脂的选择至关重要。

常见的大孔树脂分为三类，非极性大孔吸附树脂、中等极性大孔吸附树脂和极性大孔吸附树脂。非极性大孔吸附树脂又称芳香族吸附剂，适用于极性溶剂中吸附非极性物质。中等极性大孔吸附树脂又称脂肪族，除了可以在极性溶剂中吸附非极性物质外还可以从非极性溶剂中吸附极性物质。极性大孔吸附树脂空间结构中含有一些极性基团，如酰胺基等，这使得它可以凭借静电作用吸附某些极性物质。

技术实现要素：

针对以上现有技术，本发明的目的是提供一种从海带加工废液中提取岩藻聚糖硫酸酯的新工艺，该工艺具有不使用酸碱、有机溶剂、化学试剂和操作简单等特点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种从海带加工废液中提取岩藻聚糖硫酸酯的工艺方法，步骤如下：

(1)海带加工废液：采用加工食用海带的海带加工蒸煮和冲洗废液，取上清液；

(2)调节上清液的ph至3.5～4.5，然后经150～250目的滤网过滤，在滤液中加入大孔树脂，65～75℃搅拌吸附1～2h，然后再用150～250目的滤网过滤，得树脂；

其中，所述大孔树脂为具有三维空间立体网络结构的苯乙烯-二乙烯共聚体骨架上带有叔氨基的阴离子交换树脂；

(3)将所得树脂装入层析柱中，用氯化钠溶液对层析柱进行洗脱，得到的洗脱液进行超滤脱盐，最后得浓缩液，将浓缩液干燥即得岩藻聚糖硫酸酯。

本发明还提供了采用上述工艺方法制备得到的岩藻聚糖硫酸酯。

与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：

本发明具有不使用酸碱、有机溶剂、化学试剂、操作简单的特点。

本发明通过选用合适的大孔树脂、吸附工艺条件和洗脱条件等，使得海带加工废液中的岩藻聚糖硫酸酯的提取率和纯度均较高。

附图说明

构成本发明的一部分说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是褐藻糖标准曲线。

图2是ph5条件下不同温度吸附不同时间的吸附率。

图3是60℃水浴下不同ph吸附不同时间的吸附率。

图4是不同浓度的nacl溶液洗脱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中提取岩藻聚糖硫酸酯的工艺存在一定的不足，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种从海带加工废液中提取岩藻聚糖硫酸酯的工艺方法，步骤如下：

(1)海带加工废液：采用加工食用海带的海带加工蒸煮和冲洗废液；

(2)调节上清液的ph至3.5～4.5，然后经150～250目的滤网过滤，在滤液中加入大孔树脂，65～75℃搅拌吸附1～2h，然后再用150～250目的滤网过滤，得树脂；

其中，所述大孔树脂为具有三维空间立体网络结构的苯乙烯-二乙烯共聚体骨架上带有叔氨基的阴离子交换树脂；

(3)将所得树脂装入层析柱中，用氯化钠溶液对层析柱进行洗脱，得到的洗脱液进行超滤脱盐得浓缩液，将浓缩液干燥即得岩藻聚糖硫酸酯。

步骤(1)中，加工普通食用海带的海带加工蒸煮和冲洗废液，与普通海带提取液相比海带加工废液具有泥沙含量高，有机质含量高，成分复杂(含海藻酸及其盐)，岩藻聚糖硫酸酯含量低的特点。

加工食用海带的工艺流程为：蒸煮-冲洗-整理-腌渍-烘干-包装，海带加工废液来自蒸煮和冲洗。

在本发明一个优选的实施例中，所述蒸煮过程为：将鲜海带放入蒸煮流水线90～100℃高温蒸煮，得到蒸煮废液。所述冲洗过程为：将蒸煮后的海带清洗若干遍，得到冲洗废液。

步骤(2)中，经过大量的实验摸索和研究，筛选优化得到最佳的吸附条件：ph为4，温度为70℃，搅拌吸附时间为1.5h，吸附率高达91.26％。可以依据此条件实现工艺放大，促进海带的高值化开发利用。另外，经过试验验证，ph为4的条件可以排除废液中大量海藻酸钠的干扰，从而使得岩藻聚糖硫酸酯的纯度较高。

大孔树脂的品种很多，因化学组成和结构不同而具有不同的功能和特性，适应于不同的用途。应用树脂要根据工艺要求和物料的性质选用适当的类型和品种。在实验研究过程中，本发明人选用了大量类型的大孔树脂，包括强酸性阳离子树脂、弱酸性阳离子树脂、强碱性阴离子树脂和弱碱性阴离子树脂等；其骨架包括：苯乙烯系、丙烯酸系，酚醛系、环氧系、乙烯吡啶系、脲醛系等，而其上的功能基团也包括伯胺基、仲胺基、叔胺基等。结果发现，在海带加工废液中，不同类型的大孔树脂对岩藻聚糖硫酸酯具有不同程度的吸附作用，进而所得到的岩藻聚糖硫酸酯的提取率差异显著；另外，由于本发明的原料是海带加工废液，加工废液中的成分复杂，杂质较多，还需考察不同的大孔树脂对杂质的吸附作用，结果发现，不同类型的大孔树脂对杂质也会有不同程度的吸附作用，进而使得到的岩藻聚糖硫酸酯的纯度差异显著。综合实验考察，本发明优先选取了d301系列的大孔树脂(d301r、d301g和d301t)，然后进一步对d301大孔树脂进行优化筛选，结果发现，即使差异较小的同一系列的树脂，其对岩藻聚糖硫酸酯的吸附能力也是不同的。最终本发明优选的大孔树脂为d301-t大孔树脂，经过试验验证，对岩藻聚糖硫酸酯的吸附能力最好，进而使得岩藻聚糖硫酸酯的提取率和纯度均较高。与其他类型的大孔树脂相比，提取率和纯度均较突出，差异显著。d301-t大孔树脂属于中等极性大孔吸附树脂，在苯乙烯和二乙烯共聚体的基础上加上一种特殊的基团-叔氨基，凭借其较弱的碱性，它可以在中性甚至偏酸的介质中发挥很好的吸附作用。d301树脂还具有再生效率高、碱水耗低、交流量大、抗有机污染和抗氧化能力强、机械强度高。

步骤(3)中，优选的，采用1.0mol/l的氯化钠溶液洗脱2个柱体积。

优选的，得到的洗脱液采用1万分子量的中空纤维膜超滤三次脱盐。

优选的，得到的浓缩液采用冻干或者微波真空干燥即得岩藻聚糖硫酸酯。

本发明还提供了采用上述工艺方法制备得到的岩藻聚糖硫酸酯。

了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

1实验材料

1.1实验原料

海带加工废液(即蒸煮废液和冲洗废液。蒸煮废液：将鲜海带放入蒸煮流水线90～100℃高温蒸煮5min，得到蒸煮液；冲洗废液：将蒸煮后的海带清洗3遍，得到冲洗液)、d301-t树脂。

1.2试剂与药品

岩藻糖标准品(l(-)-fucose)：sigma(美国)。

l-半胱氨酸盐酸盐(c3h7no2s·hcl)，氢氧化钠(naoh)，氯化钠(nacl)，硫酸(h2so4)，等：分析纯(国产)。

1.3仪器与设备

美国millipore的纯水系统；

瑞士metterteledo的电子分析天平型号：ab204-s；

美国spectrum的切向流过滤系统型号：kr2i，0.2μm滤柱；

美国thermo的ph计型号：orion4starplus；

美国backman的高速冷冻离心机型号：j-20xp；

上海精宏设备产的电热恒温鼓风干燥箱型号：dhg-9140a；

龙口市先科仪器产的jj-1增力电动搅拌器和电热恒温水浴锅；

德国eppendorf的移液枪；

北京普析通用仪器有限责任公司的紫外分光光度计(t6新世纪)。

2实验内容

2.1褐藻多糖硫酸酯的含量测定

褐藻多糖硫酸酯含量测定采用半胱氨酸盐酸盐法。

树脂的吸附提取率计算公式：

树脂的吸附提取率(％)＝(abs(吸附前)-abs(吸附后))/abs(吸附前)*100％。

2.2海带褐藻多糖硫酸酯的吸附提取条件的探索

(1)不同温度下褐藻多糖硫酸酯的吸附：

称取10gd301-t大孔树脂于250ml锥形瓶中，添加100ml95％(v/v)的乙醇浸泡过夜。将浸泡过夜的大孔树脂用去离子水洗涤5-6次，每次0.5h。抽滤得树脂。将树脂倒入100ml0.25％(w/w)的海带加工废液(ph为5)。同法制备四份，分别在30℃、40℃、50℃和60℃水浴条件下电动搅拌吸附2h。每隔0.5h取一次样，每次取样1.5ml。

(2)不同ph下褐藻多糖硫酸酯的吸附：

称取10gd301-t大孔树脂于250ml锥形瓶中，添加100ml95％的乙醇浸泡过夜。将浸泡过夜的大孔树脂用去离子水洗涤5-6次，每次0.5h，抽滤得树脂。同法制备四份。配制0.25％的海带加工废液四份，每份100ml。用hcl(36％)调节四份提取液的ph到2.0、3.0、4.0、5.0。将提前准备好的树脂倒入海带加工废液中在60℃水浴条件下电动搅拌吸附2h，每隔0.5h取一次样，每次取样1.5ml。

(3)正交试验：

影响海带中褐藻多糖硫酸酯的提取率的因子主要有温度(因素a)、时间(因素b)、ph(因素c)，本实验采用l9(3³)设计正交实验，具体的提取条件的因素和水平选择情况见表1。

表1正交试验设计

通过正交试验确定最佳吸附提取方案后，利用这一最佳方案同法重复实验三次，比较三次实验的结果，确定此方法的准确度和重现性。

2.3吸附多糖后的大孔树脂的洗脱条件初步探索：

(1)电动搅拌洗脱法：

配制0.5mol/l和1mol/l的nacl溶液各100ml，倒入吸附完多糖的d301-t树脂(抽滤得)10g。50℃水浴下电动搅拌洗脱1h，每隔15min取一次样。抽滤分离树脂和盐溶液。将抽滤得到的树脂再分别用0.5mol/l和1mol/l的nacl溶液电动搅拌洗脱1h，每隔15min取一次样。最后用半胱氨酸盐酸盐法测定其中的褐藻多糖硫酸酯含量。

(2)装柱洗脱法：

配制0.5mol/l、1mol/l和1.5mol/l的nacl溶液各50ml备用，用2*15cm柱子，将医用棉花放入层析柱的底部，然后将抽滤得到的树脂装入层析柱中，把提前准备好的盐溶液倒入柱子中，注意装的过程中不能将底部的棉花冲开。控制洗脱液在30到40分钟滴完(洗脱速度为1.5ml/min)。用250ml的锥形瓶或者烧杯接洗脱液。待洗脱结束后取样利用半胱氨酸盐酸盐法测定洗脱液中的糖含量。

3.实验结果

3.1褐藻糖标准曲线的绘制

标准曲线的数据如表2所示，分别在427nm和396nm的波长处测定吸光度，以吸光度之差为纵坐标(a)，以标准品浓度(c)为横坐标，得到标准曲线：

a＝0.0161c-0.0051，r²＝0.9997

表2岩藻糖标准曲线数据表

3.2海带褐藻多糖硫酸酯的吸附提取条件的探索

(1)相同ph不同温度下褐藻多糖硫酸酯的吸附：

如图2所示，褐藻多糖的吸附率和吸附的时间还有吸附的温度都有一定的线性关系。随着吸附温度的提高和吸附时间的增加，多糖的吸附率也在相应的增加。可以继续提高吸附的温度和时间，探索一下大孔树脂吸附的上限能达到多少。但是考虑到要应用到实际生产当中，温度不宜过高。高温一方面增加了生产的成本，一方面还提高了生产的危险性。可以考虑适当的延长一下吸附的时间。

(2)相同温度不同ph下褐藻多糖硫酸酯的吸附：

如图3所示，在相同的温度下，褐藻多糖硫酸酯的吸附率和吸附时间成线性关系，随着吸附时间的增加吸附率也在增加。当ph在5的时候各个时间点的吸附率都相对偏低。但是随着ph的降低吸附率逐渐增高。这主要是因为ph降低后，废液中的海藻酸钠转变成海藻酸，不与大孔吸附树脂吸附，从而减少了与褐藻多糖硫酸酯的竞争性吸附，从而使褐藻多糖硫酸酯的吸附率升高。又因为褐藻多糖硫酸酯在酸性条件下容易发生酸水解，造成硫酸根的损失，所以提取过程中也不宜太过偏酸。

(3)正交试验：

本实验采用l9(3³)设计正交实验，不考察各因素之间的交互作用，其各因素自由度之和与总自由度相等，为便于估计实验误差以及确定最佳的实验方案，该实验需重复进行两次，实验结果及结果方差分析见表3和表4。

表3海带褐藻多糖硫酸酯提取率结果计算表

表4海带褐藻多糖硫酸酯提取率结果方差分析表

由表3及表4分析可知，此正交实验的极差所确定的对提取率的影响因素大小依次为：时间、ph、温度，由均值可初步确定提取条件最优组合为a3b3c2，即采用大孔树脂吸附提取褐藻多糖硫酸酯时，温度70℃、时间1.5h、ph为4，将时间设定为误差所在列，可以看出温度因素的影响具有显著性。然后利用这一最优条件重复试验三次得到三次的吸附率分别为91.41％、91.19％和91.26％极差趋近于0，具有很好的重现性。可以利用这一最佳吸附提取条件扩大海带多糖吸附提取的规模。

3.3吸附多糖后的大孔树脂的洗脱条件初步探索

如图4所示，两个的nacl溶液洗脱结果呈现出一个抛物线的形状，正常情况下洗脱液的糖浓度应该呈一个线性增加的趋势。很可能是洗脱到一定时间后，树脂的吸附和洗脱同时进行，刚开始时洗脱速率大于吸附速率。过了一段时间后吸附速率赶上了洗脱速率最后又超过了洗脱的速率。用相同浓度的nacl溶液先后洗脱两次，第二次洗脱下来的量是第一次量的三分之一。说明树脂中的多糖是一次洗脱洗不完全的。正如上述假想所述，第二次洗脱也会在一定时间达到一个平衡，需要继续替换洗脱液继续洗脱。换用高浓度nacl溶液洗脱时，洗脱量大于第一个低浓度的盐溶液洗脱量的50％。说明一定范围内高浓度的nacl溶液更易多糖的洗脱。同时可以采用柱层析的方法进行洗脱，实验配制的盐溶液浓度为0.5mol/l、1mol/l和1.5mol/l，对应洗脱液的吸光度分别为0.29、0.651和0.501。初步确定最佳洗脱液的盐浓度为1mol/l。

4结论

综上所述，本实验通过正交设计优化海带中褐藻多糖硫酸酯的提取，得到最优提取方案为温度70℃、ph为4、提取时间为1.5h，可以利用这一实验条件进行大规模海带多糖的水提取中。

实施例2海带岩藻聚糖硫酸酯的提取

1)取海带加工废液100kg(即蒸煮废液和冲洗废液。蒸煮废液：将鲜海带放入蒸煮流水线90～100℃高温蒸煮5min，得到蒸煮液；冲洗废液：将蒸煮后的海带清洗3遍，得到冲洗液)，取上清液。

2)上清液先调ph到4.0，然后经200目滤网过滤，滤液加入d301-t大孔树脂，70℃搅拌吸附1.5小时，然后用200目滤网过滤，得树脂。

3)树脂装入层析柱中用1.0mol/l的氯化钠溶液洗脱2个柱体积，得到的洗脱液用1万分子量的中空纤维膜超滤三次脱盐，最后得浓缩液，浓缩液经冷冻干燥即得岩藻聚糖硫酸酯100g。

使用本方法从海带加工废水中提取的岩藻聚糖硫酸酯岩藻糖含量大于20％(采用半胱氨酸盐酸盐法)，硫酸根含量大于20％(采用氯化钡明胶法)，分子量大于10万道尔顿。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。