一种辣木叶多糖MLP20-1的制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种具有α-糖苷酶抑制活性的辣木叶多糖mlp20-1的制备方法及其应用，属于天然产物化学领域，制得的多糖具有α-糖苷酶抑制活性，在糖尿病的治疗中具有重要的应用价值。

背景技术：

辣木是一种多年生落叶乔木，广泛种植于热带以及亚热带国家。辣木的茎、叶、根、花等部位皆可食用，在东南亚国家常被用于木本蔬菜。辣木种子油脂含量丰富，还含有大量的氨基酸、钾、锌、氨基酸、维生素以及高不饱和脂肪酸、蛋白质、甾醇等，被作为高营养蔬菜和药材开发利用。辣木耐热性、耐旱性较强，生长迅速，因其含有丰富的营养价值、广泛的应用前景得到人们越来越多的青睐，如今，在我国的云南、广东、福建辣木得到了大面积的种植。除含有丰富的营养价值外，辣木还具有较强的抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗溃疡活性，辣木可用于临床上止痛降压、预防免疫力低下、治疗高血压和糖尿病等方面，尤其是应用于婴儿和哺乳母亲方面，其对抗营养失调及预防疾病表现出较显著的效果。

糖尿病，病理复杂，其主要特征表现为高血糖、葡萄糖耐受量低，患病初期无明显症状，后期才会出现“三多一少”的症状。目前，基础血糖量高是引发并发症的主要原因，因此在糖尿病的临床治疗中抑制糖分解，缓解糖吸收是重要举措之一。α-糖苷酶是一组存在于小肠绒毛膜刷状缘上的双糖水解酶，包括麦芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶等。它将食物中的双糖以及寡糖水解为葡萄糖，经过小肠上皮细胞的吸收进入血液循环，从而引起餐后血糖水平的升高。因此，餐后血糖水平与α-糖苷酶的活性有着密切的关系，α-糖苷酶抑制剂作为一种降血糖的药品得到越来越多的关注，目前已有几个α-糖苷酶抑制剂开发上市，比如阿卡波糖、米格列醇等。

本发明制备的辣木叶多糖具有较强的α-糖苷酶抑制活性，可应用于制备降血糖药物以及治疗肥胖症的药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有α-糖苷酶抑制活性的辣木叶多糖mlp20-1的制备方法及其应用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种具有α-糖苷酶抑制活性的辣木叶多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取100g粉碎烘干的辣木叶，按照1∶10-1∶20的料液比于100℃下浸提120min，65℃超声水浴处理1h，将得到的辣木叶粗多糖提取液置于56℃，800w下悬蒸浓缩，加入3倍体积的无水乙醇沉淀过夜，离心，复溶。利用复合酶制剂(碱性蛋白酶∶胰蛋白酶＝8∶2)法脱蛋白，重复2-3次，直至无白色絮状沉淀析出。

(2)20％醇沉

向脱蛋白后的辣木叶多糖溶液中加入无水乙醇，使无水乙醇的体积为20％，4℃下醇沉过夜，离心、去上清，得到20％醇沉辣木叶多糖提取液。

(3)阴离子交换柱层析分离纯化

将第(2)步中得到的辣木叶多糖提取液复溶，溶液经过deae-sepharosefastflow离子交换柱层析分离，用0-1.0m的nacl溶液洗脱，洗脱液经透析浓缩，真空冷冻干燥，得到辣木叶多糖mpl20-1粉末。

一种具有α-糖苷酶抑制活性的辣木茎多糖mpl20-1的应用，其特征在于，此种辣木叶多糖的提取率高，对α-糖苷酶具有较好的抑制活性，并可有效调节stz诱导的糖尿病小鼠的血糖水平，可应用于降血糖药物以及治疗糖尿病、肥胖症药物的制备。

附图说明

图1：辣木叶多糖20％醇沉组分的deae-sepharosefastflow洗脱曲线

图2：辣木叶多糖mlp20-1的α-糖苷酶体外抑制活性

具体实施方式

下面，结合实施例对本发明做进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护之中。

实施例1辣木叶多糖mlp20-1的制备

(1)称取100g粉碎烘干的辣木叶，按照1∶20的料液比于100℃下浸提120min，65℃超声水浴处理1h，将得到的辣木叶粗多糖提取液置于56℃，800w下悬蒸浓缩，加入3倍体积的无水乙醇沉淀过夜，离心，复溶。利用复合酶制剂(碱性蛋白酶∶胰蛋白酶＝8∶2)法脱蛋白，重复3次，直至无白色絮状沉淀析出。

(2)20％醇沉

向脱蛋白后的辣木叶多糖溶液中加入无水乙醇，使无水乙醇的体积为20％，4℃下醇沉过夜，离心、去上清，得到20％醇沉梯度的辣木叶多糖提取液。

(3)阴离子交换柱层析分离纯化

将第(2)步中得到的辣木叶多糖提取液复溶，溶液经过deae-sepharosefastflow离子交换柱层析分离，用0-1.0m的nacl溶液洗脱，洗脱液组分mlp20-1经透析浓缩，真空冷冻干燥，得到20％醇沉梯度辣木叶多糖粉末mlp20-1。

实施例2辣木叶多糖mlp20-1的α-糖苷酶体外抑制活性

(1)溶液的配制：pbs溶液：0.1m，ph＝6.9；pnpg：5mm，pbs溶液溶解对硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷溶液。α-糖苷酶溶液：1.0u/ml，pbs溶液溶解α-葡萄糖苷酶。阿卡波糖标准溶液：0.1-0.5mg/ml。

(2)α-糖苷酶抑制活性的测定：以pnpg为底物，以p-硝基苯酚法测定α-糖苷酶活性，硝基苯酚的生成速率与α-糖苷酶的活性成正比。具体操作步骤为：向50μl实施例1和实施例2得到的各组分多糖溶液(0.1-0.5mg/ml)中加入100μlα-糖苷酶溶液，25℃下反应10min，405nm处测定吸光度值，然后继续加入50μl的pnpg，25℃下反应5min，405nm处再次测定吸光度值。空白组中以0.1m，ph＝6.9的pbs代替多糖溶液，标准组中以0.1-0.5mg/ml的阿卡波糖标准溶液代替多糖溶液。按以下公式计算α-糖苷酶的抑制率：

％inhibition＝[(δabs空白组-δabs实验组)/δabs空白组]×100

计算辣木叶多糖mlp20-1对α-糖苷酶的抑制活性，结果如图1所示。mlp20-1的ic50为0.082mg/ml。

实施例3辣木叶多糖mlp20-1对stz诱导的糖尿病小鼠糖耐量的影响

昆明雄、雌性鼠各15只，体重20-25kg，分为空腹组、对照组、拜唐平组、小剂量组、中剂量组、大剂量组。禁食20h后尾部静脉注册50mg/kg的stz，选取血糖水平大于15mol/l且血糖水平相差不大的小鼠继续下一步的实验。空腹组灌胃生理盐水，对照组灌胃生理盐水和淀粉5g/kg，拜唐平组灌胃淀粉和拜唐平50mg/kg，小剂量组、中剂量组、大剂量组分别灌胃50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的辣木叶多糖，给药1h后测定多糖水平。血糖水平测定结果如表1所示。

表1.辣木叶多糖mlp20-1对stz诱导的糖尿病小鼠糖耐量的影响

实施例4辣木叶多糖mlp20-1的傅里叶光谱分析

对辣木叶多糖mlp20-1进行傅里叶红外光谱分析(德国bruker，型号vertex7.0)，结果表明，该多糖在3411.32cm-1处具有o-h伸缩振动峰；2937.51cm-1处具有-ch伸缩振动峰；2152.43cm-1处具有累积双键伸缩振动峰；1610.70cm-1处具有c＝o伸缩振动峰；1414.33cm-1处具有c-h伸缩振动峰；1242.13-1039.65cm-1处具有吡喃环结构伸缩振动峰；915.44cm-1处出现伸缩振动峰说明存在β-糖苷键结构；777.56cm-1处出现伸缩振动峰说明存在α-糖苷键结构；536.47cm-1处的吸收峰是cco变形振动引起的。