一种靶向次级淋巴组织的肝癌疫苗的制作方法

本发明涉及癌症预防与治疗的领域，特别涉及肝癌疫苗以及肝癌的预防和治疗。

背景技术：

肝细胞癌(hcc)简称肝癌，是我国常见恶性肿瘤之一。慢性持续性乙肝病毒(hbv)感染是我国肝癌发生的主要病因(ming，l.etal.，dominantroleofhepatitisbvirusandcofactorroleofaflatoxininhepatocarcinogenesisinqidong，china.hepatology，2002，36(5)：1214-1220)。目前，临床上进行肝癌治疗的主要手段是手术切除，很多患者发现时已为晚期，并由于hbv的慢性感染背景，肝脏功能衰竭而无法手术，因缺乏有效治疗手段，肝癌患者的5年生存率极低(omatam，etal.asianpacificassociationforthestudyoftheliverconsensusrecommendationsonhepatocellularcarcinoma.hepatologyinternational，2010，4(2)：439-74)。hbv感染的肝癌患者的5年后的复发率高达70％。(kaowyetal，.acomparisonofprognosisbetweenpatientswithhepatitisbandcvirus-relatedhepatocellularcarcinomaundergoingresectionsurgery.worldjsurg，2011，35(4)：858-867)。这种复发主要是由于微小残留肿瘤灶的存在而无法采用手术和放疗进行治疗，针对肝癌的化疗药物(索拉菲尼)的临床治疗也没有显著的治疗效果。临床上缺少针对hcc手术后复发人群所存在的微小肿瘤病灶的相关干预手段。

对肝癌高危人群进行肝癌预防是非常关键和重要干预手段与措施。尽管已采取的乙肝疫苗免疫策略有效控制了hbv的新发感染，但目前我国成年人群基本未接种乙肝疫苗，慢性hbv感染率仍高达5％以上(liu，j.，etal.，seroepidemiologyofhepatitisbvirusinfectionin2millionmenaged21-49yearsinruralchina：apopulation-based，cross-sectionalstudy.lancetinfectdis，2015，16(1)：80-86)；临床上目前广泛采用的核苷类似物的抗病毒疗法仍难以完全清除病毒(limy.s.，managementofantiviralresistanceinchronichepatitisb.gutliver，2017，11(2)：189-195)，hcc发生风险仍然较高；而且抗病毒治疗因其易产生耐药性、药物有毒副作用、患者对治疗的敏感性较差、治疗费用昂贵等，使其广泛使用受到限制。此外，慢性hbv感染人群在抗病毒治疗不当，或者具有肝癌发生风险非常极高的肝硬化患者在抗病毒治疗后甚至增加肝癌的发生风险(papatheodoridis，g.v.，etal.，hepatocellularcarcinomariskinhbeag-negativechronichepatitisbpatientswithorwithoutcirrhosistreatedwithentecavir：hepnet.greececohort.jviralhepat，2015，22(2)：120-127；kimj.h.low-levelviremiaandtheincreasedriskofhepatocellularcarcinomainpatientsreceivingentecavirtreatment.hepatology，2017；66(2)：335-34)。目前针对肝癌发生的高危人群采取的主要干预手段是进行定期血清学甲胎蛋白测定联合腹部b超的筛查，这一效果存在很大争议(europeanassociationforthestudyoftheliver，europeanorganisationforresearchandtreatmentofcancer.easl-eortcclinicalpracticeguidelines：managementofhepatocellularcarcinoma.journalofhepatology，2012，56(4)：908-43)。因此，有必要研发针对hcc发生极高危人群的其他相关干预手段。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)是一种胚胎性肿瘤相关抗原，在正常成人肝脏组织内不表达，在肝癌、黑色素瘤等组织内高表达。在肝癌的早期诊断中，gpc3的敏感性和特异性分别为77％和96％(internationalconsensusgroupforhepatocellularneoplasia.pathologicdiagnosisofearlyhepatocellularcarcinoma：areportoftheinternationalconsensusgroupforhepatocellularneoplasia.hepatology，2009，49(2)：658-664)。鉴于gpc3的表达方式，国内外学者开展了gpc3特异性抗体的免疫学治疗实验研究(nakano，k.，etal.anti-glypican3antibodiescauseadccagainsthumanhepatocellularcarcinomacells.biochemicalandbiophysicalresearchcommunications，2009，378(2)：279-284和ishiguro，t.，etal.anti-glypican3antibodyasapotentialantitumoragentforhumanlivercancer.cancerresearch，2008，68(23)：9832-9838)，获得的抗体主要有gc33、yp7、hn3以及mdx-1414等，其中gc33的ii期临床研究(clinicaltrials.govidentifier：nct01507168)已经结束，但结果显示gc33治疗并未明显提高患者无进展生存期(pfs)和总生存期(os)(abou-alfa，g.，etal.randomizedphaseiiplacebocontrolledstudyofcodrituzumabinpreviouslytreatedpatientswithadvancedhepatocellularcarcinoma.journalofhepatology，2016，65(2)：289-295)。抗体识别的是细胞膜表面表达的gpc3蛋白，但gpc3在细胞浆内也有大量表达，作为生物大分子的抗体无法进入细胞内，致使抗体治疗具有局限性；此外，抗体治疗是在肝癌发生后的被动输注，难以对早期发生的单个癌变肝细胞或者手术后的微小癌细胞灶进行主动清除。目前开展的针对gpc3的car-t治疗，靶点也是针对细胞膜表面表达的gpc3蛋白(gaohetal.，developmentoftcellsredirectedtoglypican-3forthetreatmentofhepatocellularcarcinoma.clin.can.res.，2014，20(24)：6418-28)。

gpc3作为一种胚胎性肿瘤相关抗原，在机体免疫系统发育成熟过程中，能与之识别并以高亲和力结合的t细胞通过胸腺选择已被清除(starr，t.k.，etal，positiveandnegativeselectionoftcells.annurevimmunol，2003，21：139-76)。因而，机体自身难以产生针对这一蛋白的特异性t细胞免疫应答反应。此外，gpc3为一种糖蛋白，免疫原性非常弱，采用单纯gpc3蛋白抗原进行免疫，也无法诱导针对这一胚胎性肿瘤相关抗原gpc3的特异性细胞免疫。

目前，已有研究者使用hla-a2和hla-a24限制性gpc3源性多肽(分别为gpc3144-152：fvgefftdv和gpc3298-306：eyilsleel)免疫肝癌患者，进行i/ii期临床试验，结果显示gpc3特异性细胞毒性t细胞(ctls)比例增高能提高患者整体生存率，降低肝癌复发率(sawaday.，etal.phaseitrialofaglypican-3-derivedpeptidevaccineforadvancedhepatocellularcarcinoma：immunologicevidenceandpotentialforimprovingoverallsurvival.clinicalcancerresearch，2012，18(13)：3686-3696和sawaday.，etal.phaseiistudyofthegpc3-derivedpeptidevaccineasanadjuvanttherapyforhepatocellularcarcinomapatients.oncoimmunology2016，5(5).e1129483)。但是该项工作仅仅适用于携带有hla-a2和a24这两种亚型的人群，由于t细胞免疫应答存在hla限制性，hla-a2和hla-a24限制性gpc3源性多肽对携带着其他hla亚型人群而无任何作用。

初始的t细胞仅存在于淋巴结等次级淋巴组织中，淋巴结等次级淋巴组织是免疫应答发生的重要场所。外源性抗原只有被专职抗原交叉提呈细胞摄取、加工，才能有效地提呈至细胞表面，活化初始t细胞。尽管已发现树突状细胞(dc)是强大的抗原提呈细胞，但不同亚群dc具有不同的诱导抗原特异免疫应答能力。近年来，大量研究认为，在小鼠体内，cd8α⁺dc是诱导cd8⁺t细胞活化最有效的抗原交叉提呈细胞。同时，在人体内也存在一群与之类似的细胞，即cd141⁺dc(又称为bdca3⁺dc)。然而，这些细胞也主要存在于次级淋巴组织，难以直接从外周组织中摄取抗原物质。位于外周组织中的少量抗原即使通过引流淋巴管进入局部引流淋巴结内，由于淋巴结解剖结构的致密性，也难以与位于淋巴结内部的副皮质区内的cd8α⁺dc细胞接触而被摄取。因此，目前尚缺乏如何将gpc3蛋白免疫原主动传送到cd8α⁺dc细胞的方式而诱导出针对自身胚胎性肿瘤相关抗原的t细胞免疫。

技术实现要素：

本发明采用去除了gpc3中具有细胞膜锚定作用的氨基酸的gpc3蛋白作为免疫原，能在不同hla型别的人群中诱导出针对gpc3不同表位的多种特异性t细胞克隆，克服了t细胞免疫应答所存在的hla限制性，从而能有效发挥清除肿瘤细胞的保护作用。

在一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包括：

(a)：缺少具有细胞膜锚定作用的氨基酸残基的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)；

(b)：特异结合趋化因子受体1(xcr1)的淋巴细胞趋化因子(xcl1)多肽；和

(c)：连接(a)和(b)的接头。

在一个方面，本发明提供了一种编码本发明融合蛋白的核酸，其包含：

(a)编码缺少具有细胞膜锚定作用的氨基酸残基的gpc3的核苷酸序列；

(b)编码特异结合xcr1的xcl1多肽的核苷酸序列；和

(c)编码连接(a)和(b)的接头的核苷酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种载体，其包含编码本发明融合蛋白或本发明所述核酸的核苷酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种疫苗，其包含本发明的融合蛋白、核酸和/或载体。

在一个方面，本发明提供了一种预防和/或治疗肝细胞癌的方法，包括给予需要的对象本发明所述的疫苗。

在一个方面，本发明提供了本发明所述融合蛋白、核酸和/或载体在制备用于治疗和/或预防肝细胞癌的疫苗中的应用。

在一个方面，本发明提供了本发明所述融合蛋白、核酸和/或载体，其用于治疗和/或预防肝细胞癌。

附图简述

图1：融合基因表达质粒的构建。a.xcl1位于融合蛋白xcl1/gpc3氨基端时示意图(xcl1/gpc3-pcdna3.1/zeo(-)，简称xcl1/gpc3)。b.xcl1位于融合蛋白gpc3/xcl1羧基端时示意图(gpc3/xcl1-pcdna3.1/zeo(-)，简称gpc3/xcl1)。c.xcl1位于融合蛋白xcl1/e2crimson氨基端时示意图(xcl1/e2crimson-pcdna3.1(-)，简称xcl1/e2crimson)。d.xcl1位于融合蛋白e2crimson/xcl1羧基端时示意图(e2crimson/xcl1-pcdna3.1(-)，简称e2crimson/xcl1)。

图2：融合蛋白的二级结构预测。利用软件“theproteinmodelportal”对融合蛋白的空间二级结构进行预测。a.xcl1/gpc3。b.gpc3/xcl1。c.xcl1/e2crimson。d.e2crimson/xcl1。

图3：融合基因在293细胞内表达情况。利用指示蛋白(e2crimson，红色荧光蛋白)融合表达基因转染293细胞，观察融合基因在细胞内表达情况。本图展示为转染后72h时，融合蛋白在胞内表达情况。a.xcl1位于靶蛋白氨基端时融合蛋白表达情况。b.xcl1位于靶蛋白羧基端时融合蛋白表达情况。c.转染的空白对照。图中标尺为100μm。(左图中亮点为红色荧光蛋白表达区域)

图4：融合蛋白对xcr1⁺cd8α⁺dc细胞的趋化效应。a.趋化实验示意图。b.xcl1位于靶蛋白的氨基端(-nh2)或羧基端(-cooh)时，融合蛋白对xcr1⁺cd8α⁺dc细胞趋化效果。p＜0.001，统计方法为unpairedttest。

图5：融合基因在免疫位点表达并可到达局部引流淋巴结。a.免疫7天后，免疫位点处肌肉组织中融合蛋白的表达。b.免疫7天后，局部引流淋巴结组织内融合蛋白的表达。图中指示标尺为50μm。c.免疫7天后，局部引流淋巴结组织内每平方毫米视野中含有融合蛋白的细胞数。(图中黑线勾画区域为红色荧光蛋白表达区域)

图6：融合蛋白在淋巴结内定位情况。a.免疫后第7天，分离小鼠局部腘窝引流淋巴结，指示蛋白e2crimson(红色)与cd11c⁺细胞(绿色)共定位关系。二者有明显共定位关系。b.免疫后第7天，分离小鼠局部腘窝引流淋巴结，指示蛋白e2crimson(红色)与b220⁺细胞(绿色)共定位关系。二者无共定位关系。细胞核(dapi，蓝色)。图中指示标尺为50μm。(图中亮点区域为荧光显色区域)

图7：小鼠原发型肝癌模型及gpc3的表达检测。a.小鼠原发型肝癌模型的建立。在hbv-tg雄性小鼠2周龄大小时，按照25mg/kg体重腹腔注射化学致癌剂den，诱导原发型肝癌的发生。在小鼠22周龄大小时处死小鼠，统计肝脏内的肿瘤生长情况。b.hbv/den小鼠6周和22周大小时，肝脏内肿瘤生长情况及肝脏组织病理和gpc3表达情况图中标尺分别为1cm，200μm。

图8：融合基因免疫后小鼠肝脏肿瘤生长状况。a.小鼠免疫流程示意图。b.23周时小鼠肝脏肿瘤大体观。c.肝脏肿瘤数量比较。d.肝脏重量比较。e.肝脏肿瘤大小比较。f.肝脏肿瘤大小分布。

图9：肝脏浸润ifn-γ产生型t细胞分析。a.23周时小鼠肝脏浸润ifn-γ⁺cd4⁺t细胞分析。b.23周时小鼠肝脏浸润ifn-γ⁺cd4⁺t细胞比例统计。c.23周时小鼠肝脏浸润ifn-γ⁺cd4⁺t细胞数目统计。d.23周时小鼠肝脏浸润ifn-γ⁺cd8⁺t细胞分析。e.23周时小鼠肝脏浸润ifn-γ⁺cd4⁺t细胞比例统计。f.23周时小鼠肝脏浸润ifn-γ⁺cd4⁺t细胞数目统计。

图10：肝脏浸润淋巴细胞对gpc3表达型hepa1-6细胞的杀伤效应。a.23周时小鼠肝脏浸润淋巴细胞对gpc3表达型hepa1-6细胞的杀伤效应。效靶比(e/t)为10∶1。b.杀伤效应统计图。e/t＝10∶1时，***p＝0.0002。统计方法为unpairedttest。c.融合基因表达质粒免疫小鼠对gpc3表达型肝癌细胞种植瘤的保护作用。d.xcl1/gpc3融合基因诱导的保护效应与cd8t细胞的密切相关。

图11：融合基因免疫后，小鼠血清中谷丙转氨酶(alt)的变化情况。a.融合基因免疫正常c57小鼠后的alt变化，分别在免疫前(wk6)、每次免疫后10天(wk8，wk10，wk12)及处死时(wk14)采血，监测各组小鼠免疫前后谷丙转氨酶(alt)的变化。b.融合基因免疫正常c57小鼠后(wk14)的肝脏组织he染色后的病理学。c.在具有hbv-tg背景的原发型肝癌模型小鼠中采用融合基因免疫后的alt变化。在小鼠2周龄(wk2)时腹腔注射den(在如图7所述)，分别在免疫前(wk6)、每次免疫后10天(wk8，wk10，wk12)及肝脏肿瘤大量存在状况而处死时(wk23)采血监测各组小鼠免疫前后谷丙转氨酶(alt)的变化。d.融合基因免疫具有hbv-tg背景小鼠(wk23)的肝脏组织病理学。

发明详述

除非特别限定，本文使用的所有技术和学术术语均具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。另外，本文中使用的某些术语具有在本说明书中阐述的含义。本文引用的所有专利、公开的专利申请及出版物均就如全文显示一样并入本文作参考。

除非另有说明，本文中核酸的书写从左至右为5′至3′方向；氨基酸序列的书写从左至右为氨基至羧基方向。

本发明提供的融合蛋白或由本发明所述的融合基因表达的蛋白在给予对象后，可迁移至局部引流淋巴结，与cd11c⁺细胞共定位，主要位于淋巴结的t细胞区域，有效地将gpc3蛋白靶向递送到次级淋巴组织中的xcr1⁺cd8α⁺dc细胞，从而能诱导gpc3特异性cd4⁺t细胞和cd8⁺t细胞的产生，清除表达gpc3的癌变肝细胞，降低肝脏肿瘤数目和大小，预防/延缓肝癌的发生与发展。

本发明利用宿主源性趋化因子xcl1将抗原靶向自身次级淋巴组织如淋巴结，以肝癌细胞相关肿瘤抗原gpc3作为免疫原，能有效诱导机体产生抗gpc3特异性t细胞免疫应答反应，发挥清除gpc3表达型肿瘤细胞的功能。与被动转输的抗gpc3抗体治疗相比，1)本发明肝癌疫苗能够诱导机体产生主动免疫应答，具有免疫记忆性；2)抗体注射后因抗体蛋白降解，抗体作用衰减，而本发明肝癌疫苗具有增强和放大机体自身的t细胞活性作用；3)本发明肝癌疫苗诱导所产生的t细胞既能够识别肝癌细胞表面，同时也能够识别在肝癌细胞内表达gpc3的癌变肝细胞。与目前的hla-a2/a24特异性抗原肽免疫相比，1)本发明肝癌疫苗克服了hla的限制性，能够在不同hla亚型的人群中产生针对gpc3蛋白多个不同表位的多种特异性t细胞克隆，2)采用了具有免疫原性的包括第25-559位氨基酸的gpc3蛋白，能诱导多种特异性t细胞克隆产生，作用靶点更多更广泛；3)去除了具有细胞膜锚定作用的氨基酸，通过xcl1的趋化因子活性而能够使gpc3有效到达纯真性t细胞所存在的次级淋巴组织中的副皮质区。与gpc3特异性car-t细胞免疫疗法相比，1)本发明疫苗无需获取每个患者的t细胞进行改造并回输，而是诱导机体自身主动产生gpc3特异性t细胞；2)通过本发明诱导所产生的t细胞既能够识别肝癌细胞表面，同时也能够识别肝癌细胞内表达的gpc3的癌变肝细胞。因而，本发明为肝癌的预防和治疗提供一个新的策略和手段。

在一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包括：

(a)：缺少具有细胞膜锚定作用的氨基酸残基的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)；和

(b)：特异结合趋化因子受体1(xcr1)的淋巴细胞趋化因子(xcl1)多肽；

(c)：连接(a)和(b)的接头。

gpc3是一种硫酸乙酰肝素蛋白多糖，作为一种膜性间质蛋白，在细胞生长和分化中起着重要作用。gpc3与多种肿瘤关系密切，包括肝癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌等，其在不同的肿瘤中发挥不同的作用，甚至可能起完全相反的作用。

前体人gpc3(np_004475.1或uniprotkb登录号：p51654；seqidno：1)是一种含有580个氨基酸、分子量为70kd左右的蛋白，通过磷脂酰肌醇(gpi)锚定在细胞膜表面，其中氨基酸1-24是信号肽。

如本文所用，术语“gpc3”包括gpc3前体蛋白和缺少信号肽的成熟蛋白。在一个实施方案中，本发明所述gpc3是人gpc3，例如包括seqidno：1或seqidno：1的25-580位氨基酸所示的氨基酸序列。

如本文所用，术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“氨基酸序列”可互换使用，指的是任意长度例如两个或更多个氨基酸残基的聚合物。该术语还包括天然地或人为干预地修饰的氨基酸聚合物；例如形成二硫键、糖基化、酯化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作与修饰，如与标签或具有生物活性的组分缀合。本文采用的是常规的单字母或三字母氨基酸残基编码。

如本文所用，术语“氨基酸”或“aa”指天然及合成氨基酸以及以类似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物及氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及那些稍后经修饰的氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸及o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基、氨基及r基团结合的α-碳)的化合物。氨基酸模拟物指结构不同于氨基酸的一般化学结构但以类似于天然氨基酸的方式起作用的化学化合物。

如本文所用，“具有细胞膜锚定作用的氨基酸残基”是指形成部分或全部磷脂酰肌醇(gpi)锚的氨基酸，其用于将蛋白固定在细胞表面。

如本文所用，“缺少具有细胞膜锚定作用的氨基酸残基序列”是指缺少形成gpi锚的氨基酸，因而不能如完整的gpc3一样固定在细胞膜表面。

在一个实施方案中，本发明所述“缺少具有细胞膜锚定作用的氨基酸残基的gpc3”缺少seqidno：1所示的560-580位氨基酸。

在本文中，本发明所述缺少具有细胞膜锚定作用的氨基酸残基序列的gpc3是成熟gpc3蛋白片段，不包含其天然信号肽序列，例如seqidno：1所示的1-24位氨基酸。

在一个实施方案中，本发明所述“缺少具有细胞膜锚定作用的氨基酸残基的gpc3”包含seqidno：1的25-559位氨基酸所示的氨基酸序列。

本发明所述缺少具有细胞膜锚定作用的氨基酸残基的gpc3可以包含一或多个其天然的氨基酸修饰例如糖基化，例如在相应于seqidno：1所示第124、241、352、418、495、509位的一或多个氨基酸残基的糖基化。

本发明所述缺少具有细胞膜锚定作用的氨基酸残基的gpc3可包括具有与seqidno：1的25-559位氨基酸所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列相同性的氨基酸序列并且具有成熟gpc3的免疫原性的多肽。

序列相同性可以通过商业可获得的计算机程序来确定，其采用任何适宜的算法计算出两个或多个序列间的相同性百分比，例如采用缺省参数。此类计算机程序的典型的例子是clustal。更有利地，应用blast算法，参数设置为缺省值。在nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)网站上有blast算法的详细介绍。

本发明所述缺少具有细胞膜锚定作用的氨基酸残基的gpc3可包括与seqidno：1的25-559位氨基酸所示的氨基酸序列相比具有一或多个氨基酸残基的取代、插入和/或缺失的氨基酸序列并且具有成熟gpc3的免疫原性的多肽。

在一个实施方案中，所述氨基酸残基的缺失、插入或取代造成沉默变化并导致产生功能上等同的物质。本发明也包括可能存在的保守性取代(置换和取代均在本文用于指已存在的氨基酸残基被可选残基交换)，例如相似对相似的取代，如碱性取代碱性、酸性取代酸性、极性取代极性等等。

如本文所用，术语“免疫原性”是指，一旦给宿主施用，可以诱发针对相应蛋白的体液和/或细胞类型的免疫应答。例如，gpc3的“免疫原性”是指在需要的对象中能诱导针对gpc3的免疫应答。关于可用于评估免疫应答发生和激活的技术的一般性描述见例如coliganetal.(1992and1994，currentprotocolsinimmunology；edjwiley&sonsinc，nationalinstituteofhealth)所述。细胞免疫性的测量可以通过测量由激活的效应细胞包括衍生自cd4⁺和cd8⁺t细胞的那些细胞分泌的细胞因子状况(例如通过elispot量化il-10或ifnγ产生细胞)或流式细胞分析技术测定特定细胞内相关细胞因子如ifnγ的产生情况、通过确定免疫效应细胞的激活状态(例如通过传统的[³h]胸苷吸收的t细胞增殖测定)、通过在敏化的对象中测定抗原特异性t淋巴细胞对靶细胞的杀伤活性(例如在细胞毒性测定中肽特异性裂解等)进行。

在本文中，术语“免疫应答”指的是在宿主中出现的对感兴趣的物质，如蛋白质、组合物或疫苗，产生的细胞和/或抗体介导的免疫应答。优选地，宿主将会展示出治疗性或保护性免疫应答，使得对新的感染或新出现的肿瘤细胞的抵抗力得到增强和/或疾病的临床症状得到减轻。

xcl1是c型趋化因子家族成员，其结构特点是n端仅有一个cys，其基因定位于人和小鼠的1号染色体(1q)，主要由活化的cd8⁺t细胞和nk细胞产生。前体人xcl1(uniprotkb登录号：p47992；seqidno：2)和小鼠xcl1(np_032536.1或uniprotkb登录号：p47993；seqidno：3)是含有114个氨基酸、分子量为12.5kd左右的蛋白，其中氨基酸1-21是信号肽。

xcl1的特异性受体是c趋化因子受体1(xcr1)，其是g蛋白偶联受体家族成员。人类xcr1在胎盘、骨髓及免疫系统内高表达，尤其是淋巴结与脾脏组织中(http：//www.proteinatlas.org)。

如本文所用，术语“xcl1”多肽包括xcl1前体蛋白以及不包含信号肽的成熟蛋白。

在一个实施方案中，本发明所述xcl1多肽是人或小鼠xcl1多肽。

在一个实施方案中，本发明所述特异结合xcr1的xcl1多肽不包含信号肽，例如缺少相应于seqidno：2或3所示的1-21位氨基酸。

在一个实施方案中，本发明所述特异结合xcr1的xcl1多肽包含选自seqidno：2或seqidno：3的22-114位氨基酸所示的氨基酸序列。

本发明所述特异结合xcr1的xcl1多肽可包括具有与seqidno：2或3的22-114位氨基酸所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列相同性并且特异性结合xcr1的氨基酸序列的多肽。

在进一步的实施方案中，本发明所述特异结合xcr1的xcl1多肽可包括与seqidno：2或3的22-114位氨基酸所示的氨基酸序列相比具有一或多个氨基酸置换、添加和/或缺失并且特异性结合xcr1的多肽。

本发明所述“特异结合xcr1受体”是指与xcr1的结合远大于(例如亲和力高100倍、1000倍、10000倍或更高)与其他物质的结合，或者能够和全长xcl1(例如seqidno：2或3的22-114位氨基酸)竞争结合xcr1。本领域技术人员根据本领域技术知识以及实验手段可以确定哪些多肽是本发明所述的特异结合xcr1受体的多肽。

除非特别限定，本发明所述融合蛋白中的gpc3片段和xcl1片段可以任意顺序通过接头连接，即gpc3-接头-xcl1或xcl1-接头-gpc3。

在一个实施方案中，本发明所述融合蛋白中，所述gpc3片段在n端而特异结合xcr1受体的xcl1多肽片段在c端，通过所述接头连接，即gpc3-接头-xcl1。

在一个实施方案中，本发明所述融合蛋白中，所述gpc3片段在c端而特异结合xcr1受体的xcl1多肽片段在n端，通过所述接头连接，即xcl1-接头-gpc3。

如本文所用，接头是连接gpc3片段与特异结合xcr1受体的xcl1多肽片段的肽或其它分子。所述连接可以通过本领域已知的连接两个部分的任何方法连接，只要接头部分不明显妨碍所述融合蛋白中xcl1片段与xcr1的相互作用和/或不明显妨碍gpc3片段的构象即可。

在一个实施方案中，所述接头长度优选不少于9个氨基酸残基，例如9、11、13、15个氨基酸残基或更长。

本领域技术人员已知的任何接头均可用于本发明中。接头部分可以是肽。接头不形成抗原性表位。用于接头的典型氨基酸残基是甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等等。举例的这种已知的接头部分包括但不限于(g)ns(g)n，其中n＝4、5、6或7。

在一个实施方案中，所述接头为gggggsggggg(seqidno：4)。

在一个实施方案中，本发明所述融合蛋白包含seqidno：10的20-658位氨基酸、seqidno：12的20-658位氨基酸、seqidno：36的1-639位氨基酸和seqidno：10、12或35-36任一氨基酸所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述融合蛋白是分离的。

如本文所用，术语“分离的”多核苷酸或多肽指该多核苷酸或多肽基本上没有在其天然环境与之联合的物质。“基本上没有”意味着要求至少50％，有利地至少70％，更有利地至少80％，甚至更有利地至少90％的这些物质没有了。已经被“分离的”生物组分包括那些通过常规纯化方法纯化的组分。该术语还包括重组核酸或蛋白质，以及化学方法合成的核酸或肽。

在一个方面，本发明提供了一种核酸，其编码本发明所述的融合蛋白。

如本文所用，术语“核酸”包括dna、rna(例如mrna、trna)、异源双链体和能够编码多肽的合成分子，并包括本领域普通技术人员将承认能够取代天然存在的核苷酸和其主链的所有类似物和主链取代物例如pna。核酸可以是单链或双链，且可以化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。

在一个实施方案中，本发明提供了一种编码本发明所述融合蛋白的核酸，其包含：

(a)：编码缺少具有细胞膜锚定作用的氨基酸残基的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)的核苷酸序列；和

(b)：编码特异结合趋化因子受体1(xcr1)的淋巴细胞趋化因子(xcl1)多肽的核苷酸序列；

(c)：编码连接(a)和(b)的接头的核苷酸序列，

(d)：任选存在的编码信号肽的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明所述“缺少具有细胞膜锚定作用的氨基酸残基的gpc3”包含seqidno：1的25-559位氨基酸所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明所述编码所述gpc3的核苷酸序列包含seqidno：11的58-1662位核苷酸、seqidno：13的370-1974位核苷酸或seqidno：34的73-1677位核苷酸所示的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明所述xcl1多肽是人或小鼠xcl1多肽。

在一个实施方案中，本发明所述特异结合xcr1的xcl1多肽包含选自seqidno：2或seqidno：3的22-114位氨基酸所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明所述编码特异结合c趋化因子受体1(xcr1)的xcl1多肽的核苷酸序列包含seqidno：11的第1696-1974位核苷酸、seqidno：13的第58-336位核苷酸、seqidno：15的第64-342位核苷酸或seqidno：33的第64-342位核苷酸所示的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述接头包括但不限于(g)ns(g)n，其中n＝4、5、6或7。

在一个实施方案中，所述接头为gggggsggggg(seqidno：4)。

在一个实施方案中，编码所述接头的核苷酸序列包含seqidno：5或16所示的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明所述编码所述融合蛋白的核酸可以包含编码信号肽的核苷酸序列，如编码mgwsciilflvatatgvhs(seqidno：6)的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明所述编码所述融合蛋白的核酸包含编码seqidno：10的20-658位氨基酸、seqidno：12的20-658位氨基酸、seqidno：10、12和35-36任一所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明所述编码所述融合蛋白的核酸包含seqidno：11的第58-1974位核苷酸、seqidno：13的第58-1974位核苷酸、seqidno：37的第58-1974位核苷酸、seqidno：37的第1-1974位核苷酸、seqidno：11、13或37所示的核酸序列。

如本文所用，术语“任选存在的”是指其所限定的特征在所述技术方案中可以存在或不存在。

本发明所述核酸的核苷酸序列可以插入载体中，例如质粒、病毒载体、细菌载体、原生动物载体、昆虫载体、杆状病毒表达载体、酵母载体、哺乳动物细胞载体等等。

在一个方面，本发明提供了一种载体例如表达载体，其包含编码本发明所述融合蛋白的核酸。

所述载体可包括调控所述编码融合蛋白的核酸表达的调控序列，例如启动子、增强子等。所述启动子可以是在哺乳动物细胞中有功能的任何启动子，例如包括但不限于t7，cmv等。

术语“载体”由本领域普通技术人员广泛了解和使用。例如，本领域通常使用的术语“载体”是指一种媒介物，其允许或便于核酸分子从一种环境到另一种的转移，或者可以允许或便于对核酸分子的操作。

制备和/或施用载体或重组体或质粒的方法以体内或体外表达本发明的融合蛋白的方法可以是任何所需的方法。“表达载体”在本文中指用于将遗传物质转移至遗传物质可在其中表达的靶宿主细胞的媒介。表达载体含有必需调控序列以允许转录和翻译插入的一个或多个基因。表达载体一般来说包含复制起点、启动子、终止子以及能够在转化的细胞提供表型选择的特定基因。当多核苷酸编码多蛋白片段时，有利地，在载体中将起始密码子(atg)置于读码框5′端，将终止密码子置于3′端。可能存在控制表达的其他元件，例如增强子序列、稳定序列和允许蛋白质分泌的信号序列。

依据本发明，可以进行使用能够表达本发明融合蛋白的任何载体。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白可以在体外(如使用无细胞的表达系统)和/或在体外生长的培养细胞中。对于这样的应用，可使用任何允许在体外和/或在培养的细胞内表达融合蛋白的载体。

依据本发明的另一实施方案，表达载体是用于在适当的细胞系统中体外表达蛋白质的表达载体。表达的蛋白质可以在蛋白质分泌之后或不在分泌之后(如果蛋白质不分泌，一般会出现细胞裂解或进行细胞裂解)从培养物上清中收获，任选地使用浓缩方法(如超滤)进行浓缩和/或使用纯化手段(例如亲和层析、离子交换层析或凝胶过滤型层析方法)纯化。

对于需要在体内表达的应用，例如当编码本发明的融合蛋白的核酸用于dna或含dna的疫苗时，可以使用任何能够表达本发明的融合蛋白且体内使用安全的载体。在优选的实施方案中，所用的载体在人类、哺乳动物和/或实验动物中使用安全。

本发明使用的载体可以包含适合的基因调控区(例如启动子和增强子)，使得可以表达本发明的融合蛋白。

当用于在对象体内表达本发明的融合蛋白时，例如为了产生针对gpc3的免疫应答和/或针对肝癌的保护性或治疗性免疫应答，应当选择适合于在该对象上表达，并且体内使用安全的表达载体，例如在哺乳动物或人类对象中表达本发明的融合蛋白。可以使用任何适合于这些用途的载体，技术人员有能力挑选适合的载体。在某些实施方案中，优选用于这些体内应用的载体被减弱以防止载体在对象内的扩增。例如，如果使用质粒载体，首选那些缺乏在对象中起作用的复制起点的载体，以增强在对象内使用的安全性。如果使用病毒载体，优选地其在对象中是减毒的或是复制缺陷的，也是为了增强在对象内使用的安全性。

适于作为疫苗施用的任何载体可以在本发明中采用。在本发明的某些实施方案中，使用适合作为dna疫苗使用的载体，例如包括但不限于pcdna3.1(+)、pcdna3.1(-)、pcdna3.1/zeo(+)、pcdna3.1/zeo(-)、pcmv6、pires、pvax和pcdna载体(invitrogen)。在一个实施方案中，本发明的表达载体是pcdna3.1(-)。

在一个方面，本发明提供了一种癌症疫苗，其包含免疫有效量的本发明所述的融合蛋白、本发明所述的编码本发明所述融合蛋白的核酸和/或包含本发明所述的编码本发明所述融合蛋白的核酸的表达载体，以及任选存在的药物可接受的运载体或赋形剂。

在一个实施方案中，本发明所述癌症是特征在于具有gpc3表达的肝细胞癌。

本发明的疫苗可以包括本领域已知的任意药用可接受的运载体。

为便于本发明的疫苗的施用，疫苗可以配制成为合适的组合物。一般来说，这些组合物包含活性成分(如dna疫苗)和药用可接受的运载体。有利地，依据本发明的疫苗包含有效量的本文所述的一或多种表达载体和/或多肽以引起免疫应答和/或保护性免疫应答；并且，有效量可以由本文公开的内容，包括本文引用的文献，和本领域的知识确定，无需过度的实验。该疫苗可以设计为将融合蛋白、核酸和/或表达载体引入所需的作用部位，并以适当的可控的速度释放。

如本文所用，术语“有效量”或“免疫有效量”是指组合物在有需要的对象中足以诱导希望的免疫作用或免疫应答的量。在一个实施方案中，免疫有效量是指在有需要的对象中足以诱导免疫应答的量。在另一个实施方案中，免疫有效量是指在有需要的对象中足以产生免疫性的量，例如提供针对如病毒感染等疾病的保护作用。免疫有效量根据多种因素而可以变化，如对象的身体状况、年龄、体重、健康状况等；特定的应用，是诱导免疫应答或是提供保护性免疫性；给予的特定重组载体；由给予的重组载体编码的免疫原；给予的特定抗原性多肽；以及需要这种免疫性的特定疾病如病毒感染。本领域技术人员通过本发明揭示可易于确定免疫有效量。

如本文所用，疫苗是包含免疫有效量的用于本发明的纯化或者部分纯化的所述融合蛋白、本发明所述的编码本发明所述融合蛋白的核酸和/或包含本发明所述的编码本发明所述融合蛋白的核酸的表达载体的组合物。疫苗中每种成分的最佳比率可以通过本领域技术人员熟知的技术根据本发明揭示确定。疫苗的制备和使用为本领域技术人员熟知。

在一个方面，本发明提供了本发明所述的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸和/或包含编码所述融合蛋白的核酸的表达载体在制备用于预防和/或治疗对象的肝细胞癌的疫苗中的应用。

在一个方面，本发明提供了一种预防或治疗肝细胞癌的方法，包括给需要的对象施用本发明所述的疫苗。

如本文所用，“对象”是指将通过或者已经通过本发明实施方案的方法治疗的任何动物，优选哺乳动物，包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、非人灵长类动物(nhp)如猴或猿、人等，更优选人。

根据本发明的实施方案，在给予对象时，表达载体表达所述融合蛋白。本文描述的任何融合蛋白均可以由表达载体编码并使用本发明的方法给予对象。表达的融合蛋白呈递给对象的免疫系统，从而诱导需要的应答以产生免疫性，或者诱导免疫应答以治疗或预防肝细胞癌。

在某些实施方案中，体内施用本发明的核酸和/或融合蛋白，例如当目的是在对象产生免疫应答时。在某些实施方案中，对象是人类，例如患有肝癌的人或具有患有肝癌风险的人。

对于这样的体内应用，本发明的核酸和/或融合蛋白，优选地作为免疫原性组合物的组分施用，所述免疫原性组合物包括与药用可接受的运载体混合的本发明的核酸和/或融合蛋白。本发明的免疫原性组合物可用于刺激针对肝癌的免疫应答且可以用作针对肝癌的预防性或治疗性疫苗的一种或多种组分，用于预防、改善和治疗肝癌。本发明的核酸和载体可用于提供遗传疫苗，即用于将编码本发明融合蛋白的核酸递送至对象(如人)的疫苗，使得所述融合蛋白然后在对象内表达并引起免疫应答。

根据本发明的实施方案，当涉及本发明描述的方法使用的术语“诱导免疫应答”涵盖了提供保护性免疫性和/或接种对象的预防目的，以及在有需要的对象中引起希望的免疫应答或治疗目的。优选地，本发明的方法可用于预防目的，如提供保护性免疫性。

包含本发明所述融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸和/或包含编码所述融合蛋白的核酸的表达载体的疫苗可以肌内或皮下给予。也可以考虑其它给予方法如经皮或真皮内给予。

典型地，给予根据本发明实施方案的疫苗具有预防性目的以在肝细胞癌症状发生之前产生针对癌性肝细胞的免疫应答。

给予的实际量、速率和时程依赖于治疗的疾病的性质和严重度，典型地要考虑治疗的疾病、患者个体的状况、给予部位、给予方法及为医生已知的其它因素。示例的上述技术和方案可见于remington′spharmaceuticalsciences，16thedition，osol，a.ed.，1980。

如果需要，所述疫苗组合物可以存在于药盒、包装瓶或分配器中，其例如可包含一或多个单位剂量形式的本发明所述的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸和/或包含编码所述融合蛋白的核酸的表达载体。所述药盒、包装或分配器可以附有给药说明书。

以下实施例意图说明本发明的多种实施方案。因此，讨论的具体实施方案不应当理解为限制本发明的范围。本领域技术人员会清楚可以进行各种等价、改变和修改而不背离本发明的范围，并且应当理解这类等价实施方案包括在本文中。此外，本公开中引用的所有参考文献均以其全文加入本文参考，就如在本文中完整示出一样。

实施例

实施例1：融合基因和融合蛋白

1.构建融合基因表达质粒

根据人gpc3蛋白(seqidno：1)和小鼠xcl1蛋白(seqidno：3)的氨基酸序列，构建gpc3-xcl1融合蛋白。同时，为保证趋化因子与靶蛋白在空间结构上的相互独立性而发挥正常的趋化功能，我们在gpc3和xcl1之间设计了一段接头，对应氨基酸序列为：gggggsggggg(seqidno：4)，核酸序列为：ggcggaggcggaggatcagggggagggggagga(seqidno：5)。为便于融合蛋白在哺乳动物细胞中表达和分泌以及能被靶向到淋巴结中的xcr1⁺cd8α⁺dc细胞，我们首先将位于融合蛋白氨基端蛋白的信号肽更换为哺乳动物信号肽mgwsciilflvatatgvhs(seqidno：6)，去除gpc3蛋白的信号肽(gpc3的信号肽magtvrtaclvvamllsldfpgqa，seqidno：7)和xcl1蛋白的信号肽(xcl1的信号肽mrlllltflgvccltpwvveg，seqidno：8)，同时去除gpc3蛋白560-580位包括gpi锚的氨基酸splklltsmaisvvcffflvh(seqidno：9)。

1.1：构建趋化因子xcl1位于融合蛋白羧基端的融合表达基因(gpc3/xcl1)：

根据人gpc3蛋白和小鼠xcl1蛋白的氨基酸序列及上述所提及的信号肽、gpi和连接物的氨基酸序列，我们推测出xcl1位于融合蛋白羧基端的融合蛋白氨基酸序列(seqidno：10)，根据该序列进行密码子优化(seqidno：11)，由genscript公司进行合成，并连接到pcdna3.1/zeo(-)表达载体上。

1.2：构建趋化因子xcl1位于融合蛋白氨基端的融合表达基因(xcl1/gpc3)：

根据人gpc3蛋白和小鼠xcl1蛋白的氨基酸序列及上述所提及的信号肽、gpi和连接物的氨基酸序列，我们推测出xcl1位于融合蛋白氨基端的融合蛋白氨基酸序列(seqidno：12)，根据该序列进行密码子优化(seqidno：13)，由genscript公司进行合成，并连接到pcdna3.1/zeo(-)表达载体上。

1.3：构建趋化因子xcl1位于与红色荧光蛋白e2crimson的融合蛋白羧基端和氨基端的指示蛋白

根据红色荧光蛋白e2crimson(seqidno：14)和小鼠xcl1(seqidno：15)的核酸序列，设计pcr所使用的引物序列。同时，为了保证趋化因子与指示蛋白在空间结构上相互独立，发挥正常的趋化功能，我们在e2crimson和xcl1之间设计一段接头，对应氨基酸序列为：gggggsggggg(seqidno：4)，核酸序列为：ggcggaggcggtggatcaggaggtggcggaggc(seqidno：16)。

1.3.1：构建趋化因子xcl1位于指示融合蛋白羧基端的融合表达基因(e2crimson/xcl1)：

首先，分别利用通用引物pqe30-f/pqe30-r(seqidno：17和41)和m13-47/rv-m(seqidno：29和30)对原始质粒pqe30-e2crimson(sinobiologicalinc.馈赠)和mousexcl1cdnaclone(sinobiologicalinc.，cat：mg50677-m)进行测序鉴定其序列的正确性。

然后，利用引物1和引物2(seqidno：17和18)从原始质粒pqe30-e2crimson上获取目的片段“e2crimson-接头”，利用引物3和引物4(seqidno：19和20)从原始质粒mousexcl1cdnaclone(sinobiologicalinc.，cat：mg50677-m)上获取目的片段“接头-xcl1”。

然后，对上述pcr产物进行凝胶电泳，并利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根，cat：dp209)回收目的片段。

然后，在超保真dna聚合酶(neb，cat：m0530)的作用下，利用引物9和引物10(seqidno：25和26)扩增目的片段。凝胶电泳后，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒收集目的片段，在普通dna聚合酶的作用下加a尾，随后与t载体相连，转化，并挑选单克隆，扩大培养后进行测序。

然后，选取测序结果正确的质粒在限制性内切酶的作用下，对位点ecori(neb，cat：r3101)和bamhi(neb，cat：r3136)进行剪切，获得目的片段。同时，对表达载体pcdna3.1(-)质粒(lifeinvitrogeninc.，cat：v795-20)进行同样剪切。回收目的片段，利用t4dna连接酶(neb，cat：m0202)对酶切后纯化的目的片段和载体片段进行连接。

最后，利用连接的目的表达质粒进行转化，挑选单克隆，进行测序。对测序正确的质粒和菌种进行保存。

1.3.2：构建趋化因子xcl1位于融合蛋白氨基端的融合表达基因(xcl1/e2crimson)：

首先，利用引物5和引物6(seqidno：21和22)从原始质粒pqe30-e2crimson上获取目的片段接头-e2crimson，利用引物7和引物8(seqidno：23和24)从原始质粒mousexcl1cdnaclone(sinobiologicalinc.，cat：mg50677-m)上获取目的片段xcl1-接头。

然后，对上述pcr产物进行凝胶电泳，并利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。

然后，在超保真dna聚合酶的作用下，利用引物11和引物12(seqidno：27和28)扩增目的片段。凝胶电泳后，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒收集目的片段，在普通dna聚合酶的作用下加a尾，随后与t载体相连，转化，并挑选单克隆，扩大培养后进行测序。

然后，选取测序结果正确的质粒在限制性内切酶的作用下，对位点ecori和bamhi进行剪切，获得目的片段。同时，对表达载体pcdna3.1(-)质粒进行同样剪切。回收目的片段，利用t4dna连接酶对酶切后纯化的目的片段和载体片段进行连接。

最后，利用连接的目的表达质粒进行转化，挑选单克隆，利用载体通用引物t7/bgh(seqidno：31和32)进行测序。对测序正确的质粒和菌种进行保存。

本发明中所使用的引物序列

我们分别构建了xcl1位于gpc3蛋白氨基端的融合表达基因xcl1/gpc3-pcdna3.1/zeo(-)(简称xcl1/gpc3，图1a)和xcl1位于gpc3蛋白羧基端的融合表达基因gpc3/xcl1-pcdna3.1/zeo(-)(简称gpc3/xcl1，图1b)。还构建了相对应的红色荧光蛋白表达融合基因xcl1/e2crimson-pcdna3.1(-)(简称xcl1/e2crimson，图1c)和e2crimson/xcl1-pcdna3.1(-)(简称e2crimson/xcl1，图1d)，以指示在细胞内和体内表达定位情况。

2.融合蛋白空间结构预测

根据融合蛋白的氨基酸序列，我们利用软件“theproteinmodelportal”对蛋白质的二级结构进行预测。蛋白质空间结构的正常折叠是趋化因子发挥正常趋化功能必不可少的前提条件。xcl1蛋白分子(由114aa组成)，相对于gpc3蛋白分子(580aa组成)很小，为确定融合蛋白的空间结构及其xcl1能够有效暴露并发挥正常趋化功能，我们加入了连接物(g5sg5)。随后采用“theproteinmodelportal”进行蛋白质二级结构的预测。预测结果发现：趋化因子xcl1连接于靶蛋白的氨基端(图2a，图2c)或羧基端(图2b，图2d)，均可有效暴露于靶蛋白外侧。

3.融合基因转染细胞效果检测

在24孔细胞培养板内接种293细胞，1.5×10⁵/ml，1ml/孔，24小时后更换为无抗生素的细胞培养基(含10％fbs的dmem)，待细胞长至70～90％时，使用lipofectamin2000试剂(lifetechnologies，invitrogen)分别转染融合基因表达质粒xcl1/e2crimson和e2crimson/xcl1以及空载质粒(mock)，根据实验室前期工作基础，实验最佳转染所用质粒为500ng/ml。在转染后24小时，48小时，72小时，96小时及112小时利用免疫荧光显微镜下观察融合基因表达情况。

通过xcl1/红色荧光蛋白融合表达质粒转染293细胞，观察融合基因在细胞内的表达情况。结果显示：融合基因表达质粒转染293细胞后24小时时，便有少量红色荧光蛋白表达，48小时-72小时时表达量最高，72小时之后虽然仍由红色荧光蛋白持续表达，但是细胞状态较差。并且无论趋化因子xcl1位于靶蛋白氨基端(图3a)或羧基端(图3b)，均能在转染融合表达质粒的细胞内观察到红色荧光蛋白的表达。对照组(mock)无红色荧光表达(图3c)。图3展示为转染72h时，融合蛋白在细胞内表达情况。每组重复4次。

4.融合蛋白趋化功能检测

为此，进一步检测该融合蛋白对xcr1⁺cd8α⁺dc细胞的趋化效应。采用小鼠全脾细胞作为靶细胞，分析转染不同融合基因的293细胞表达的融合蛋白对xcr1⁺cd8α⁺dc细胞的趋化效应(示意图见图4a)。在24孔细胞培养板内接种293细胞，1.5×10⁵/ml，1ml/孔，24小时后更换为无抗生素的细胞培养基，使用lipofectamin2000试剂进行转染(xcl1/e2crimson、e2crimson/xcl1、xcl1/gpc3、gpc3/xcl1四种目的质粒以及空载质粒mock)。转染后48小时时，进行趋化实验。趋化小室(碳酸脂膜transwell小室：5μm；costar，cat：3422)的上室中放入脾脏淋巴细胞，根据实验室前期工作基础加入细胞数量为1×10⁶/100μl/孔。同时设置自发迁移对照组(spontanous)以及阳性对照组，所加入的细胞数目相同，阳性对照组采用重组人xcl1蛋白(rhxcl1，购自peprotech，cat：300-20)，根据实验室前期已有的工作基础，100ng/ml为最佳趋化效率剂量。4小时后收集趋化下室中的细胞，并进行流式染色：mhc-ii-fitc，cd11c-pe，cd8αa-percp/cy5.5。利用bdlsrii仪器中速收集2分钟内细胞数，并分析不同组之间所趋化的mhc-ii⁺cd11c⁺cd8α⁺细胞数目。每组重复6次。

结果显示：无论xcl1位于靶蛋白的氨基端(xcl1/e2crimson和xcl1/gpc3)，还是羧基端(e2crimson/xcl1和gpc3/xcl1)，均能有效的从上室中募集xcr1⁺cd8α⁺dc细胞到下室中(p＜0.001)。与对照组(mock组)相比，当xcl1位于融合蛋白羧基端时，其趋化效率提高3.45倍，而当xcl1位于融合蛋白氨基端时，其趋化效率提高3.61倍，且融合蛋白的趋化效果与100ng/ml重组xcl1蛋白的趋化效果相似(图4b)。

以上结果显示，无论xcl1位于靶蛋白的氨基端，还是羧基端，该融合基因均可在细胞内表达并进行有效分泌，所分泌的含有xcl1的融合蛋白产物可有效趋化xcr1⁺cd8α⁺dc细胞。

实施例2：融合基因在小鼠体内表达与定位

1.质粒免疫及取材：

在体外实验中，我们发现无论趋化因子xcl1位于融合蛋白的氨基端还是羧基端，其均能在细胞中正常表达，并分泌至胞外，趋化xcr1⁺cd8α⁺dc细胞，因而，在进一步的实验中，我们选取了xcl1位于融合蛋白氨基端的融合基因表达质粒免疫小鼠。根据实验室前期已有工作基础，在小鼠(c57bl/6，6周龄)前24小时，对小鼠股四头肌注射5mg/ml盐酸布比卡因，50μl/只，使肌肉发生轻度损伤，促使肌肉细胞再生，以增加细胞吸收质粒dna的量。第二天进行免疫，免疫时先用三溴乙醇对小鼠进行麻醉，在预处理的股四头肌内注入10μltracer质粒(即xcl1/e2crimson)dna(1μg/μl)。分别在免疫后5天，6天，7天时分离小鼠免疫部位肌肉以及腘窝引流淋巴结，利用冰冻切片技术分析融合蛋白表达情况。每个时间点的实验重复至少2次。

2.腘窝引流淋巴结内融合蛋白定位情况分析：

融合蛋白在免疫部位正常表达并迁移至次级淋巴器官中是dna疫苗发挥效应的首要步骤。为此，我们利用指示蛋白融合基因表达质粒(xcl1/e2crimson)对小鼠腿部肌肉进行免疫，免疫7天分离注射位点处肌肉组织和腘窝引流淋巴结，分析其中融合蛋白的表达情况。

实验前，将切好的冰冻切片组织在室温下平衡5分钟。使用预冷的固定剂(丙酮)，室温固定5-10分钟。洗涤：tbs洗涤3次，5分钟/次。封闭：加入含有3％bsa(牛血清白蛋白)的pbs，室温封闭1小时。加入fitc标记的cd11c抗体或fitc标记的b220抗体(200×，ebioscience)，4℃，避光，过夜。洗涤：弃去一抗，加入tbs洗涤3次，5分钟/次。封片：加入一滴封片剂(vectorshieldmountingmediumwithdapi，vector，cat：94010)，封片，4℃避光暂存。荧光显微镜下观察。

结果发现：免疫后第7天时，免疫位点处肌肉组织内有红色荧光蛋白(e2crimson)的表达(图5a)。局部腘窝引流淋巴结内也可以检测到红色荧光蛋白的存在(图5b)。在显微镜(400×)下随机选取6个视野，观察摄取融合蛋白的细胞数，结果发现在局部引流淋巴结内，每平方毫米的范围内大约有652个融合蛋白存在(图5c)。因此，融合基因能够在免疫部位表达，并迁移至局部引流淋巴结中。实验重复2次。

为了检测迁移至淋巴结内的融合蛋白与xcr1⁺cd8α⁺dc细胞、b细胞以及t细胞的相对位置关系，我们分离免疫后7天的淋巴结组织，免疫荧光技术分析发现：红色荧光蛋白(红色)与生发中心b细胞聚集区(b220⁺b细胞，绿色)无共定位关系(图6b)。然而，红色荧光蛋白(红色)与dc细胞(cd11c⁺细胞，绿色)有明显的共定位关系(图6a)。实验重复2次。

因此，迁移至淋巴结的融合蛋白主要位于t细胞区域，与dc细胞共定位。

实施例3：融合基因对原发性肝癌发生的干预效果及对正常肝细胞的功能影响

1.构建hbv/den小鼠原发性肝癌模型

为了进一步检测融合基因表达质粒免疫后对小鼠原发性肝癌的干预作用，我们构建了化学致癌剂den(二乙基亚硝胺，简称den))诱导的hbv转基因背景的小鼠原发性肝癌模型(图7a)。hbv转基因雄性小鼠(c57bl/6j-tgn(alblhbv)44bri，由chisari等于1985年建立。购自北京大学医学部实验动物中心)出生2周时，腹腔注射den溶液(25mg/kg体重)，诱发原发性肝癌小鼠模型(简称：hbv/den小鼠肝癌模型)。在22周龄大小时处死小鼠，肝脏中有大量肿瘤且肝脏内有gpc3蛋白的表达(图7b)。这一结果说明该hbv/den小鼠肝癌模型的肝脏组织有gpc3蛋白的表达，适用于本实验研究。

当小鼠6周龄大小时，小鼠已经发生了在显微镜下可以见到散在的单个的肿瘤细胞灶(图7b)，然后我们随机分为三组，具体免疫物质及小鼠只数如下：

表1：hbv/den小鼠免疫

根据实验室前期工作基础，每两周进行一次免疫能有效诱导针对gpc3的反应，经过三次免疫后即可在免疫小鼠体内诱导出特异性反应。因而，我们在hbv/den小鼠原发性肝癌模型6，8，10周龄时，根据前述荧光分析结果，利用基因枪(gds-80)背部皮下注射总量为10μg(1μg/μl，10μl/只)的疫苗。共免疫3次。在小鼠23周龄时处死小鼠，观察肝脏肿瘤生长状况(图8b)，并统计肝脏肿瘤数目和大小。结果发现，虽然三组均有肿瘤生长，但是xcl1/gpc3融合基因免疫组能够减少肝脏肿瘤数目(图8c)，仅为mock组肿瘤数目的64％。肝脏重量减轻，仅为mock组的55％(图8d)，和肿瘤大小变小，最大肿瘤大小仅为mock组的45％(图8e)。进一步分析肝脏肿瘤大小分布发现，给予xcl1/gpc3融合质粒免疫后，≤1mm的肿瘤数目减少，仅为mock组的53.5％(p＝0.0338，图8f)，而较大肿瘤(＞1mm)数目显著降低，仅为mock组的38.6％(p＝0.0003，图8f)。

2.探讨融合基因的保护机制

cd8⁺t细胞作为主要效应细胞，在抗肿瘤免疫中发挥重要作用，它可以通过分泌效应细胞因子ifn-γ等发挥抗瘤效应。为此，分离小鼠肝脏浸润淋巴细胞，在体外条件下，使用gpc3127蛋白(由杭州中肽公司合成，序列：amfknnypsl(seqidno：38)，工作浓度：2μg/ml)体外刺激3天，加入brefeldinasolution(1000×)(购自ebioscience，cat：00-4506-51。1000×稀释)继续培养4小时，阻断蛋白质向高尔基氏复合体的转运，增强胞内细胞因子的检测。借助流式细胞学技术分析cd4⁺ifn-γ⁺t细胞和cd8⁺ifn-γ⁺t细胞产生情况。结果发现融合基因xcl1/gpc3免疫组的肝脏中有大量gpc3特异性ifn-γ产生型cd4⁺t(图9a，b，c)和cd8⁺t(图9d，e，f)细胞的产生。与mock组相比，ifn-γ⁺cd4⁺t比例升高3.75倍，而ifn-γ⁺cd8⁺t比例升高4.5倍。因而，xcl1/gpc3免疫后能够诱导机体产生大量gpc3特异性t细胞。实验重复3次。

为了能更好的检测融合基因xcl1/gpc3免疫后所诱导的gpc3特异性t细胞的功能，我们分离肝脏浸润淋巴细胞，利用杀伤实验观察效靶比(e/t)为10∶1时，xcl1/gpc3免疫组肝脏浸润淋巴细胞能够有效杀伤gpc3表达型hepa1-6肝癌细胞系(图10a和图10b)。其中，e/t＝10∶1时，p＝0.0002。实验重复3次。

为进一步检测xcl1/gpc3融合表达质粒对gpc3表达型肝细胞的杀伤效应，我们在融合基因表达质粒免疫后的小鼠以及mock组小鼠皮下接种肿瘤细胞(hepa1-6/gpc3)(hepa1-6肿瘤细胞系购自atcc，hepa1-6/gpc3细胞为在hepa1-6中转染gpc3表达质粒，筛选得到的gpc3表达型hepa1-6细胞。)，1×10⁶/只，200μl/只。其中，抗-cd8抗体阻断组：在免疫前2天，腹腔注射抗-cd8α中和性抗体(bioxcell)，500μg/只，接种肿瘤当天补打一次，100μg/只。随后观察并记录肿瘤生长情况。结果显示xcl1/gpc3免疫组在肿瘤接种后3天时，发生率为33％，仅为mock组的46％，肿瘤生长缓慢，其大小仅为mock组的17.3％(图10c)。为检测这一过程中cd8t细胞的作用，我们分别在免疫后的小鼠腹腔注射抗-cd8α抗体，结果发现中和cd8t细胞功能后，肿瘤发生率(100％)、肿瘤体积明显增加(图10d)。因而，xcl1/gpc3免疫后能有效抑制肝癌种植瘤的生长，这一过程主要通过cd8t细胞发挥作用。实验重复3次。

3.融合基因xcl1/gpc3表达质粒对正常肝细胞损伤作用分析

为检测融合基因xcl1/gpc3表达质粒免疫对正常肝细胞的损伤作用，我们分别选取正常雄性c57小鼠(6周龄)(图11a)或hbv/den小鼠原发性肝癌模型(图11b)为研究对象，利用基因枪(gds-80)背部皮下注射总量为10μg(1μg/μl，10μl/只)的xcl1/gpc3融合基因表达质粒(xcl1/gpc3)疫苗进行免疫，以空载(mock)作为对照，每2周免疫一次，共免疫3次。在小鼠14周龄时处死正常c57小鼠或在23周龄时处死hbv/den小鼠。在初次免疫前(wk6)及每次免疫后10天(wk8，wk10，wk12)尾静脉采血，采用中生北控生物科技股份有限公司生产的丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒(丙氨酸底物法)检测小鼠血清中谷丙转氨酶(alt)的变化，监测疫苗免疫过程对肝脏功能的影响。结果显示，xcl1/gpc3免疫组小鼠alt无明显升高，在正常c57小鼠中均低于40u/ml(图11a)，且三次免疫后，小鼠肝脏组织he病理染色结果显示融合基因免疫并未明显改变肝脏组织结构。而在hbv/den小鼠原发性肝癌模型小鼠体内，虽然23周龄时，各组均由不同程度的肿瘤发生(图11d)，但与对照组相比，xcl1/gpc3免疫组小鼠alt无显著升高(图11c)。以上结果提示融合基因xcl1/gpc3对小鼠正常肝脏细胞无明显损伤作用。

综上所述，融合基因xcl1/gpc3表达质粒能够有效趋化xcr1⁺cd8α⁺dc细胞，并诱导gpc3特异性ifn-γ产生型t细胞的产生，在hbv/den原发性小鼠肝癌模型中预防/延缓原发性肝癌的发生，对正常肝细胞无损伤作用。