本发明属于水产品加工及保健品技术领域，涉及一种低温结晶富集乙酯化鱼油epa、dha的方法。
背景技术：
epa和dha属于n-3系列多不饱和脂肪酸，对人体具有重要的保健作用，随着我国消费者收入、受教育程度以及健康意识逐年提高，对epa、dha预防动脉粥样硬化和心血管疾病、防癌抗癌、改善大脑机能、提高记忆力、促进婴幼儿智力发育等生理功能有了普遍的认识，尤其是近几年我国老龄化人口的增加，势必将给epa和dha产品带来新的市场机遇。如今，中国已经成长为全球第三大epa和dha油市场，dha+epa已经取得新资源食品认证，且即将纳入dri，将有利于进一步提高消费者的认知度。
鱼油因富含n-3系列多不饱和脂肪酸尤其是epa和dha多年来一直是国内外研究的热点之一。但是鱼油中还含有大量的其他的脂肪酸，为了提高epa和dha的浓度和活性，需要对鱼油进行浓缩富集。
目前，分离富集鱼油中多不饱和脂肪酸的方法主要有低温溶剂结晶法、尿素包合、超临界co2萃取、分子蒸馏、酶浓缩法等。其中，低温结晶法具有操作简便，对仪器设备的要求低，且在低温环境下能够较好的保持不饱和脂肪酸的天然活性，分离效果较好等优点。袁晓艳等将混合脂肪酸以1：3(酸∶溶剂)溶解在石油醚中，冷却至5～7℃，结晶出饱和脂肪酸，再经抽滤、蒸馏得到不饱和脂肪酸，产率可达80％，可见低温结晶法具有一定的富集效果(袁晓艳，等.亚麻油中分离不饱和脂肪酸方法的研究[j].辽宁科技学院学报，2005，7(4)：12-13)。
到目前为止，关于富集鱼油多不饱和脂肪酸的报道很多，工业化生产乙酯化鱼油绝大多采用尿素包合与分子蒸馏联合的方法，几十年来没有突破。尿素包合法具有设备简单，条件温和，成本低，能比较完全的保留有效成分生理活性等优点，但是需耗费大量溶剂，存在溶剂回收和环境污染问题，不能将epa和dha分离，且一般只能将epa和dha的含量提高到50～70％。为提高产率，一般采用多次尿素包合法或与分子蒸馏技术结合使用。分子蒸馏技术分离纯化工艺相对繁琐，比如需要多级纯化，如何实现连续进料，固体进料高温加热时对物料降解的影响等。超临界萃取技术具有低温、高压、隔绝空气的特点，特别适用于热敏物质和易氧化物质的分离，它可以充分保护鱼油的品质不受破坏，产品品质较好，但此方法对设备要求高，能耗大。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种低温结晶富集乙酯化鱼油epa、dha的方法，设备简单，操作简便，单次处理量大，成本低，有效成分不易发生氧化、异构化、聚和等反应，能够较好的保持epa、dha的天然活性。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种低温结晶富集乙酯化鱼油epa、dha的方法，所述方法包括如下步骤：
s1、对乙酯化鱼油进行预处理；
s2、在乙酯化鱼油中加入混合溶剂，混匀后在压力作用下进行低温结晶，所述混合溶剂为甲醇、无水乙醇和6号溶剂的复配溶剂；
s3、低温结晶后冷冻离心分离结晶体和未结晶液体，然后除去未结晶液体中的混合溶剂，即得富集后的乙酯化鱼油epa、dha。
本发明通过低温结晶法乙酯化对鱼油中的epa、dha进行富集，操作简便，对仪器设备的要求低，单次处理量大，分离效果较好，且在低温环境下能够较好的保持epa、dha的天然活性。在低温结晶过程中，有机溶剂的加入提高了液相比例和结晶体的自由度，使得后期从未结晶液体中过滤分离结晶体容易进行。
在低温结晶分离时，要求乙酯化鱼油脂肪酸中的饱和酸和一烯酸、二烯酸等低不饱和度脂肪酸以晶体形式析出，而epa与dha仍留在溶液中，溶剂对乙酯化鱼油的分离效果起关键性作用。本发明采用复合溶剂对鱼油进行低温结晶，甲醇去除饱和脂肪酸的效果即对epa和dha的富集效果最好，无水乙醇次之；无水乙醇对低不饱和脂肪酸的去除效果较好，并具有价格便宜、挥发性小、闪点高等优点，但是黏度相对较大，结晶所需温度低；而甲醇粘度较低，结晶所需温度较高；甲醇和乙醇配合使用，能获得合适的粘度和结晶温度，6号溶剂与甲醇、乙醇配合使用能有效减少结晶过程中不饱和脂肪酸在epa和dha在饱和脂肪酸晶体表面的吸附。综合考虑，本发明选择三者复配的混合溶剂作为低温结晶处理的溶剂。
本发明采用在压力作用下进行低温结晶，高压能够提高相变压力，加快结晶的进行，并且在高压环境下能够提高饱和脂肪酸的结晶温度，减少能耗消耗。
在分离过程中采用直接分离的方式容易导致少量晶体留存在未结晶液体中，降低了未结晶液体中epa和dha的比例；在常温下采用真空抽滤容易导致晶体在常温下溶解，降低分离效果。因此，本发明采用冷冻离心的方式分离结晶体和未结晶液体，提高了分离效果，加快了分离速度，从而提高了未结晶液体中epa和dha的比例和含量。
作为优选，步骤s1中的乙酯化鱼油中的epa、dha质量百分比含量为40～50％，其中dha的质量百分比含量为30～40％。
作为优选，所述步骤s1中的预处理为将乙酯化鱼油在30～50℃下加热10～20min。
在鱼油的加工、储藏和运输等加工过程中，往往会形成不匀晶核，不利于低温结晶过程中晶核的形成，因此本发明在低温结晶前通过加热的方式将不均匀晶核破坏。在30～50℃下加热处理10～20min能将鱼油完全融化从而破坏其中的不匀晶核。
作为优选，所述步骤s2中的乙酯化鱼油和混合溶剂的质量比为10:(55～81)。
混合溶剂的用量与原料油中饱和脂肪酸的含量有关，用量过少，就不能全部结晶析出，用量过多，则可能导致原料油过分稀释影响结晶的粒度和分布，使形成的结晶粒度过小，同时还造成溶剂的浪费，因此将鱼油与混合溶剂的比例限定在上述范围内。
作为优选，所述步骤s2中的混合溶剂中甲醇、无水乙醇和6号溶剂的体积比为(8～10)：(1～3)：(1～3)。
混合溶剂中各溶剂之间的比例对结晶温度的选择及结晶效果有着重要影响。在本发明的混合溶剂中无水乙醇的比例过高容易导致epa、dha也会少量结晶出来，从而影响为结晶液体中epa、dha的含量和比例，而无水乙醇的比例过低则会导致低不饱和脂肪酸不易结晶出来。
作为优选，所述步骤s2中的低温结晶在280～360mpa压力作用下进行。
在上述压力范围内进行低温结晶能缩小不同饱和脂肪酸的结晶温度范围，在较窄的温度范围内快速结晶。压力过大会导致形成晶粒过于细小，成长不够充分，分离时会夹杂大量epa和dha，减少epa、dha的提取率；压力过小对结晶的促进效果不明显。
作为优选，所述步骤s2中的低温结晶在超声波搅拌中进行，所述超声波搅拌的超声功率为350～400w，搅拌速率为17～25r/min。
本发明采用超声波处理过冷条件下的乙酯化鱼油，超声波的絮凝作用能促进晶核的大量形成，超声波的空化作用又将形成的晶核击碎形成新的结晶中心，促进第二次成核，加速饱和脂肪酸结晶，缩短结晶诱导时间，改变晶体形态，使得结晶颗粒细小均匀，硬度增加。搅拌力度不够，会产生局部晶核，搅拌太剧烈，会使结晶撕碎，因此应控制适当的搅拌速度。结晶养晶过程中应保持持续慢速搅拌，有利于提高传热效率和结晶体的成长。
作为优选，所述步骤s2中低温结晶的过程为，先降温至-35～-40℃，保温结晶2.5～3h，然后加入琥珀酸，继续保温结晶3～3.5h。
温度是脂肪酸结晶形成和分离的关键因素之一，温度太高，难以将热量从溶剂和乙酯化鱼油的混合物中传递到环境中去，无法形成良好的过冷度，结晶核的形成受到限制，导致低温结晶后的未结晶液体中除了epa、dha外，仍含有大量其他组分，epa、dha比例降低。适当的结晶温度，有利于饱和脂肪酸和低不饱和脂肪酸形成结晶。但温度过低，会使epa、dha迁移至晶核，最终以结晶析出，降低epa、dha的富集率，且可能会导致形成的结晶较大而难以过滤，同时过低的温度会增加能耗，因此本发明将结晶温度控制在上述范围内。
本发明低温结晶的过程分两阶段进行，第一阶段先降温至-35～-40℃，保温结晶2.5～3h，此时大部分饱和脂肪酸和低不饱和脂肪酸已经结晶或形成初步结晶，但仍有部分饱和脂肪酸和低不饱和脂肪酸较难结晶，因此本发明此时在微结晶液体中加入琥珀酸，能有效促进难结晶脂肪酸的结晶，以及初步结晶晶粒的生长，继续保温结晶3～3.5h，结晶效果达到最佳。
作为优选，所述步骤s2中降温速率为1～1.5℃/min。
本发明将降温速度控制在较低的范围内，在充分搅拌下缓慢地降低体系的温度，使晶体缓慢增长，提高晶粒粒径，减少晶体表面对epa、dha的吸附量，从而提高分离效率；同时保证致冷液的温度与结晶体系具有较小的温差，以防止局部过冷晶体迅速析出，
作为优选，所述步骤s2中低温结晶所使用的制冷液为丙酮和干冰的复配物。
作为优选，所述步骤s2中琥珀酸的添加量为混合溶剂质量的0.9～1.1％。
琥珀酸添加含量过多容易导致结晶晶粒过小，并且容易导致epa、dha夹杂在晶粒中，降低了未结晶液体中epa、dha的含量和比例。
作为优选，所述冷冻离心的温度为-22～-19℃，离心转速为5000～6000rmp，时间为2～3min。
在上述温度范围内，饱和脂肪酸晶体可以发生微溶，排出夹带的epa、dha，提高液相中epa、dha的含量，温度过高，会导致饱和脂肪酸发生大量溶解，大幅提高液相中饱和脂肪酸的含量，降低液相中epa、dha的比例，温度过低，夹带的epa、dha较难排出。而冷冻形成的脂肪酸结晶结构强度有限，离心转速过高容易造成对结晶体的破坏。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明以乙酯化鱼油为原料，通过低温结晶法富集epa、dha，合理选择有机溶剂，并通过特定的工艺过程，分离富集得到高含量epa、dha的鱼油；操作简便，分离效果较好，且在低温环境下能够较好的保持epa、dha的天然活性，对鱼油的深加工利用和多不饱和脂肪酸系列保健品的开发有重要的参考意义。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
下面通过具体实施例1～5对本发明中的富集鱼油epa、dha的方法作进一步解释。
实施例1
本发明中低温结晶富集乙酯化鱼油epa、dha的方法，包括如下步骤：
(1)、准备原材料乙酯化鱼油，乙酯化鱼油中的epa、dha质量百分比含量为40％，其中dha的质量百分比含量为30％，将乙酯化鱼油在30℃下加热20min；
(2)、按照乙酯化鱼油和混合溶剂10:55的质量比在乙酯化鱼油中加入混合溶剂，混合溶剂为体积比为8：1：1的甲醇、无水乙醇和6号溶剂的复配溶剂；
混匀后在280mpa压力和350w超声功率的超声波搅拌下进行低温结晶，搅拌速率为25r/min，低温结晶的过程为，先以1℃/min的速率降温至-35℃，保温结晶3h，然后加入混合溶剂质量0.9％琥珀酸，继续保温结晶3.5h；低温结晶所使用的制冷液为丙酮和干冰的复配物；
(3)、低温结晶后在-22℃温度和5000rmp的离心转速下冷冻离心2min，分离得到结晶体和未结晶液体，分子蒸馏除去未结晶液体中的混合溶剂，即得富集后的乙酯化鱼油epa、dha。
经检测，富集后的乙酯化鱼油epa、dha中epa和dha的总含量为89.31％。
实施例2
本发明中低温结晶富集乙酯化鱼油epa、dha的方法，包括如下步骤：
(1)、准备原材料乙酯化鱼油，乙酯化鱼油中的epa、dha质量百分比含量为45％，其中dha的质量百分比含量为35％，将乙酯化鱼油在35℃下加热15min；
(2)、按照乙酯化鱼油和混合溶剂10:60的质量比在乙酯化鱼油中加入混合溶剂，混合溶剂为体积比为8：2：3的甲醇、无水乙醇和6号溶剂的复配溶剂；
混匀后在300mpa压力和360w超声功率的超声波搅拌下进行低温结晶，搅拌速率为23r/min，低温结晶的过程为，先以1.2℃/min的速率降温至-36℃，保温结晶3h，然后加入混合溶剂质量1.0％琥珀酸，继续保温结晶3.5h；低温结晶所使用的制冷液为丙酮和干冰的复配物；
(3)、低温结晶后在-20℃温度和5500rmp的离心转速下冷冻离心2.5min，分离得到结晶体和未结晶液体，分子蒸馏除去未结晶液体中的混合溶剂，即得富集后的乙酯化鱼油epa、dha。
经检测，富集后的乙酯化鱼油epa、dha中epa和dha的总含量为89.88％。
实施例3
本发明中低温结晶富集乙酯化鱼油epa、dha的方法，包括如下步骤：
(1)、准备原材料乙酯化鱼油，乙酯化鱼油中的epa、dha质量百分比含量为50％，其中dha的质量百分比含量为40％，将乙酯化鱼油在40℃下加热17min；
(2)、按照乙酯化鱼油和混合溶剂10:68的质量比在乙酯化鱼油中加入混合溶剂，混合溶剂为体积比为9：1：1的甲醇、无水乙醇和6号溶剂的复配溶剂；
混匀后在320mpa压力和370w超声功率的超声波搅拌下进行低温结晶，搅拌速率为20r/min，低温结晶的过程为，先以1～1.3℃/min的速率降温至-37℃，保温结晶3h，然后加入混合溶剂质量1.0％琥珀酸，继续保温结晶3.5h；低温结晶所使用的制冷液为丙酮和干冰的复配物；
(3)、低温结晶后在-21℃温度和5600rmp的离心转速下冷冻离心2.5min，分离得到结晶体和未结晶液体，分子蒸馏除去未结晶液体中的混合溶剂，即得富集后的乙酯化鱼油epa、dha。
经检测，富集后的乙酯化鱼油epa、dha中epa和dha的总含量为90.19％。
实施例4
本发明中低温结晶富集乙酯化鱼油epa、dha的方法，包括如下步骤：
(1)、准备原材料乙酯化鱼油，乙酯化鱼油中的epa、dha质量百分比含量为50％，其中dha的质量百分比含量为40％，将乙酯化鱼油在45℃下加热15min；
(2)、按照乙酯化鱼油和混合溶剂10:73的质量比在乙酯化鱼油中加入混合溶剂，混合溶剂为体积比为8：3：2的甲醇、无水乙醇和6号溶剂的复配溶剂；
混匀后在330mpa压力和380w超声功率的超声波搅拌下进行低温结晶，搅拌速率为18r/min，低温结晶的过程为，先以1.4℃/min的速率降温至-38℃，保温结晶2.5h，然后加入混合溶剂质量1.0％琥珀酸，继续保温结晶3.5h；低温结晶所使用的制冷液为丙酮和干冰的复配物；
(3)、低温结晶后在-19℃温度和6000rmp的离心转速下冷冻离心3min，分离得到结晶体和未结晶液体，分子蒸馏除去未结晶液体中的混合溶剂，即得富集后的乙酯化鱼油epa、dha。
经检测，富集后的乙酯化鱼油epa、dha中epa和dha的总含量为89.73％。
实施例5
本发明中低温结晶富集乙酯化鱼油epa、dha的方法，包括如下步骤：
(1)、准备原材料乙酯化鱼油，乙酯化鱼油中的epa、dha质量百分比含量为50％，其中dha的质量百分比含量为40％，将乙酯化鱼油在50℃下加热10min；
(2)、按照乙酯化鱼油和混合溶剂10:81的质量比在乙酯化鱼油中加入混合溶剂，混合溶剂为体积比为10：3：3的甲醇、无水乙醇和6号溶剂的复配溶剂；
混匀后在360mpa压力和400w超声功率的超声波搅拌下进行低温结晶，搅拌速率为17r/min，低温结晶的过程为，先以1.5℃/min的速率降温至-40℃，保温结晶2.5h，然后加入混合溶剂质量1.1％琥珀酸，继续保温结晶3h；低温结晶所使用的制冷液为丙酮和干冰的复配物；
(3)、低温结晶后在-20℃温度和6000rmp的离心转速下冷冻离心2.5min，分离得到结晶体和未结晶液体，分子蒸馏除去未结晶液体中的混合溶剂，即得富集后的乙酯化鱼油epa、dha。
经检测，富集后的乙酯化鱼油epa、dha中epa和dha的总含量为89.35％。
对比例1
低温结晶过程在常压下进行，其他与实施例3相同。经检测，富集后的乙酯化鱼油epa、dha中epa和dha的总含量为86.15％。
对比例2
低温冷冻过程中未添加琥珀酸，其他与实施例3相同。经检测，富集后的乙酯化鱼油epa、dha中epa和dha的总含量为85.93％。
对比例3
低温冷冻过程中使用的混合溶剂为甲醇和无水乙醇的复配溶剂，其他与实施例3相同。经检测，富集后的乙酯化鱼油epa、dha中epa和dha的总含量为85.16％。
综上所述，本发明以乙酯化鱼油为原料，通过低温结晶法富集epa、dha，在富集的过程中，合理优化工艺参数；在高压和超声波条件下进行低温结晶，并添加琥珀酸辅助结晶，有效增加了提高了结晶效率，提高了富集后的乙酯化鱼油epa、dha中epa、dha的含量和比例；操作简便，分离效果较好，且在低温环境下能够较好的保持epa、dha的天然活性。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。