本发明涉及天然活性产物
技术领域：
，特别是涉及一种具改善骨质疏松作用的多肽及其制备方法和应用。
背景技术：
：骨质疏松是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，钙质由骨骼往血液净移动的矿物质流失，骨质量减少，骨骼内孔隙增大，出现中空疏松现象，导致骨质脆性增加和易于骨折的全身性骨代谢疾病，速度取决于破骨细胞和成骨细胞活性的消长。骨质疏松性骨折的发病率逐年增长，但目前对其发病机制及愈合方式尚不清晰，防治效果不理想，且再次骨折率高。临床上，将骨质疏松症分为两大类，分别为原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症，其中原发性骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症和老年性肤质疏松症；继发性骨质疏松症是由疾病或药物等引起。现阶段对骨质疏松的药物治疗主要是钙剂、维生素d和骨吸收抑制剂(包括雌激素、选择性雌激素受体调节剂、双膦酸盐等)等三大类药。但研究表明，长期使用激素替代疗法会增加患乳腺癌、冠心病等疾病的几率，其他临床上使用的化学合成药物均存在一定的副作用。而鹿骨具有天然，多效，无毒等特点，鹿骨中寻找能够预防和/或治疗骨质疏松症的有效成分是迫切需要解决的课题。技术实现要素：基于此，有必要针对上述问题，提供一种具改善骨质疏松作用的多肽，该多肽可通过调节骨代谢而增加骨质疏松大鼠的骨密度。一种具改善骨质疏松作用的多肽的制备方法，包括以下步骤：脱脂：将鹿骨以co2超临界萃取的方式进行脱脂；研磨：将上述脱脂后的鹿骨通入液氮进行研磨，得骨粉；提取蛋白：将上述骨粉置于tris-hcl缓冲溶液中，在15-30℃下以匀浆器研磨提取热不稳定性蛋白，待用；再将骨粉置于tris-hcl缓冲溶液中，在100-150℃、0.1-0.2mpa的条件下提取热稳定性蛋白，待用；蛋白纯化：将上述热不稳定性蛋白和热稳定性蛋白混合，以葡聚糖凝胶柱纯化，得到平均分子量为15-19kd的鹿骨蛋白；发酵：将上述鹿骨蛋白以乳酸菌进行发酵，得到平均分子量为5kd-10kd的鹿骨多肽，即得。上述制备方法，首先，选取鹿骨提取多肽，其中，鹿骨为鹿科动物梅花鹿或马鹿的骨。药用首载于《名医别录》，《本草纲目》记载：“鹿骨味甘，微热，无毒。主补内虚，续绝伤，补骨强筋，除风，久服耐老”。鹿骨中含有大量蛋白质、骨胶原、磷脂质、软骨素和磷蛋白，有益于骨形成，促进体内胶原蛋白及弹性蛋白的更新，延缓骨吸收，促进软骨内骨化等过程。并且，上述多肽的制备方法，先对鹿骨进行脱脂，可获得更干燥的原料粉末，并可增加其亲水性，使鹿骨中蛋白提取更充分。再对从鹿骨中提取得到的两种蛋白提取液进行发酵处理，并在发酵之后以超滤柱进行超滤，得到分子量大小集中在5kd-10kd的范围内的多肽。以该多肽作用于骨质疏松模型大鼠，对其骨密度增强具有非常好的促进作用。在其中一个实施例中，在所述脱脂步骤之前，还包括预处理步骤，所述预处理步骤为：取鹿骨，剔除非骨成分，清洗干净，粉碎至体积为1-2cm3的碎块。在其中一个实施例中，所述脱脂步骤中，co2超临界萃取的条件为：压力为15-35mpa，温度为20-25℃，时间为100-140min，co2流量为20l/min。以上述条件进行脱脂，具有非常好的脱脂效果。其中一个实施例中，所述提取蛋白步骤中，先将所述骨粉按照1g骨粉：10-20ml溶剂的料液比置于tris-hcl缓冲溶液中，在15-30℃下以匀浆器研磨20min，3400-5000转/min离心15-25min，取上清液，重复提取2-3次，合并上清液，回收溶剂，得到热不稳定性蛋白，待用；再将骨粉按照1g骨粉：10-20ml溶剂的料液比置于置于tris-hcl缓冲溶液中，在100-150℃的条件下提取1.5-2.5hr，3400-5000转/min离心15-25min，取上清液，重复提取2-3次，合并上清液，回收溶剂，得到热稳定性蛋白，待用。由于鹿骨中蛋白种类丰富，热稳定性不同，通过上述方式分别提取热不稳定蛋白和热稳定蛋白，可以更充分的利用鹿骨资源，更好的发挥鹿骨蛋白的作用。在其中一个实施例中，所述蛋白纯化步骤中，将所述热不稳定性蛋白和热稳定性蛋白按照质量比为1:0.5-1.5混合，以葡聚糖凝胶柱g-50纯化，得到平均分子量为15-19kd的鹿骨蛋白。在其中一个实施例中，所述发酵步骤中，将乳酸菌浓度为3.5×1010-4.5×1010个/ml的菌悬液按体积百分比为4-8％的量接种至鹿骨蛋白发酵培养基中进行培养，所述鹿骨蛋白发酵培养基通过以下方法制备得到：按照鹿骨蛋白2.5-3.5g/100ml，玉米粉0.15-0.25g/100ml，nacl0.4-0.6g/100ml的浓度配制溶液，调节ph值为7.0，灭菌，即得。通过乳酸菌发酵过程中产生对人体有益的细菌素，乳酸菌发酵后产生的乳酸可提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和vd的吸收。且乳酸菌具有磷酸蛋白酶，能将乳中的α-酪蛋白分解成微细的奶酪脂肪肽和氨基酸等，从而提高了蛋白的消化吸收率；在其中一个实施例中，所述发酵步骤中，将乳酸菌接种至鹿骨蛋白发酵培养基后，于35-45℃，ph7-9，90r/min转速的条件下培养24-40h，发酵液经,4000-5000r/min离心15-25min，取上清液，通过超滤柱过滤，截留得到平均分子量为5kd-10kd的多肽，即得。将发酵条件控制在上述范围内，能够使乳酸菌活性最佳，获得较好的发酵效果，并且，采用上述发酵条件后，得到的活性多肽中，分子量在5kd-10kd范围内的多肽占多肽总量的80％-90％，分子量在低于5kd范围内的多肽占多肽总量的5％-8％，当多肽组合物中多肽分子量按照上述范围分布，具有最佳的调节骨代谢作用，并有最佳的增强骨质疏松大鼠骨密度的作用。本发明还公开了上述的具改善骨质疏松作用的多肽的制备方法制备得到的多肽。本法明还公开了上述的多肽在制备预防和治疗骨质疏松症的药物或保健食品中的应用。在其中一个实施例中，所述药物或保健食品的剂型为片剂、颗粒剂、硬胶囊、软胶囊、口服液、丸剂或滴丸。上述剂型可以采用本领域技术人员熟知的方法来进行药剂的制备。根据需要，可以加入各种药学上可接受的载体。所述的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。本发明的药剂在制备时，可选择的填充剂包括但不限于：淀粉、糖粉、磷酸钙、糊精、微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、甘露醇等；可选择的粘合剂包括但不限于：羧甲基纤维素钠、pvp-k30、羟丙基纤维素、淀粉浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、胶化淀粉等；可选择的崩解剂包括但不限于：干淀粉、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等；可选择的润滑剂包括但不限于：硬脂酸镁、滑石粉、十二烷基硫酸钠、微粉硅胶等。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的具改善骨质疏松作用的多肽，按照特定的条件对鹿骨进行脱脂，液氮研磨中粉碎，能很好的保证有效成分的活性，并在提取特定蛋白后进行发酵，随后以超滤得到分子量主要集中在5kd-10kd范围内的多肽。该多肽对骨密度具有非常好的增强作用。因此，可将该多肽用于预防和/或治疗骨质疏松症中，也将会有显著疗效，从而产生巨大的社会效益和经济效益。并且，该多肽为动物骨骼中提取的活性成分，具有无毒、有效剂量低、用量小、安全性高、可长期服用的优点，适用于骨质疏松症患者的临床用药特点和要求。该多肽组合物还具有分子小、易于吸收和生物利用度高的特点。附图说明图1为实施例1中he染色病理切片，其中：a为对照组切片；b为模型组切片；c为鹿骨多肽a组；d为阳性药组。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。实施例1一种具改善骨质疏松作用的多肽，通过以下方法制备得到：一、材料鹿骨，购自吉林市向阳鹿厂。乳酸菌，购自山东中科嘉亿生物工程有限公司。鼠李糖乳杆菌，购自山东中科嘉亿生物工程有限公司。tris(三羟甲基氨基甲烷)，购自北京鼎国生物技术有限责任公司。二、方法(1)预处理：取鹿骨做为原料，用清水洗净，剔除残留肉、筋、骨膜等非骨成分。将鹿骨粉至1～2cm2碎块，室温至干燥。(2)脱脂：将碎块状鹿骨放置于超临界流体萃取仪中，分别以25mpa进行脱脂处理，萃取温度为22℃，萃取时间为120min，co2流量为20l/min，即得脱脂鹿骨原料。(3)研磨：将上述脱脂骨原料置于spex6775液氮研磨仪中，液氮低温环境下研磨3min，即得脱脂骨粉末。(4)提取蛋白。鹿骨热不稳定性蛋白的提取：将鹿骨脱脂粉置于tris-hcl溶液中，在ph＝8，时间为20min，料液比为1g：15ml，温度为22℃条件下，匀浆器研磨，辅助提取鹿骨热不稳定性蛋白，重复提取3次，4000r/min离心20min，取上清液浓缩，冷冻干燥，得鹿骨热不稳定性蛋白粉。鹿骨热稳定性蛋白的提取：将上述骨粉过滤干燥，于121℃，0.15mpa，料液比为1：10，2h的条件提取三次，合并浓缩，冷冻干燥，即得鹿骨热稳定性蛋白粉。(5)蛋白纯化：将上述两种鹿骨蛋白粉按照1：1比例混合，去离子水溶解，制得总蛋白质量分数为10％，用葡聚糖凝胶柱g-50纯化，去离子水为洗脱液，蛋白溶液的上样量为5％柱体积，洗脱液流速为0.5ml/min，接样体积为5ml，弃去3个柱体积洗脱液，收集4-6柱体积洗脱液，即得较纯鹿骨蛋白。(6)发酵：①菌种的活化：将乳酸菌接入液体mrs培养基中，40℃培养24h，35℃、90r/min摇瓶培养40h，固体mrs培养基用于菌种活菌数检测，待其乳酸菌浓度达到4.0×1010个/ml，备用。上述液体mrs培养基通过以下方法制备得到：牛肉膏10g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g、吐温801ml、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸铵2g、水合硫酸镁0.2g、水合硫酸锰0.2g、加入蒸馏水至1000ml。用饱和naoh溶液调整ph至6.4左右，121℃灭菌20min，即得。上述固体mrs培养基通过以下方法制备得到：取上述液体mrs培养基，中加入琼脂(1.5wt％～2wt％)，即为固体mrs。其中液体用于菌种活化，固体用于菌种活菌数检测。②摇瓶的发酵：将菌悬液按6％(v/v)的量接种到鹿骨蛋白30g，玉米粉2g，nacl5g，加水至1000ml，ph值为7.0的鹿骨蛋白发酵培养基中，于35℃、90r/min培养20h。发酵液经4000r/min离心20min后得到的上清液即为鹿骨多肽溶液。将上述多肽液经浓缩、冷冻干燥后，得鹿骨多肽a，该多肽粉末a中分子量在5kd-10kd范围内的多肽占多肽总量的80％-90％，分子量在低于5kd范围内的多肽占多肽总量的5％-8％。对比例1一种鹿骨蛋白，制备方法与实施例1中的方法基本相同，区别仅在于：该鹿骨蛋白为实施例1蛋白纯化后得到的15-19kd的鹿骨蛋白。对比例2一种鹿骨多肽，制备方法与实施例1中的方法基本相同，区别仅在于：发酵步骤中，将菌悬液按6％(v/v)的量接种到鹿骨蛋白30g，玉米粉2g，nacl5g，加水至1000ml，ph值为7.0的鹿骨蛋白发酵培养基中，于35℃、90r/min培养30h。发酵液经4000r/min离心20min后得到的上清液即为鹿骨多肽溶液。得到平均分子量为1kd-5kd的鹿骨多肽b。对比例3一种鹿骨多肽，制备方法与实施例1中的方法基本相同，区别仅在于：发酵步骤中，将菌悬液按6％(v/v)的量接种到鹿骨蛋白30g，玉米粉2g，nacl5g，加水至1000ml，ph值为7.0的鹿骨蛋白发酵培养基中，于35℃、90r/min培养40h。发酵液经4000r/min离心20min后得到的上清液即为鹿骨多肽溶液。得到平均分子量为0.5kd-1kd的鹿骨多肽c。对比例4一种鹿骨多肽，制备方法与实施例1中的方法基本相同，区别仅在于：提取蛋白步骤如下：(1)高压蒸煮：以鹿骨：水的体积比为1：8，在121℃，0.15mpa，3h，高压蒸煮两次，合并两次滤液。(2)鹿骨粗蛋白制备：将上述滤液4500r/min离心20min,取上清液，经喷雾干燥制得鹿骨粗蛋白粉。随后取上述粗蛋白粉，参照实施例1的方法进行蛋白纯化和发酵等步骤，得到鹿骨多肽d。对比例5一种鹿骨多肽，制备方法与实施例1中的方法基本相同，区别仅在于：提取蛋白步骤如下：(1)高压蒸煮：以鹿骨：水的体积比为1：8，在121℃，0.15mpa，3h，高压蒸煮两次，合并两次滤液。(2)鹿骨粗蛋白制备：①mrs培养基：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，tween801.0g，k2hpo42.0g，mgso4·7h2o0.2g，mnso4·h2o0.05g，caco320.0g，蒸馏水1.0l，ph6.8，115℃灭菌20min后备用。②菌种的活化：将鼠李糖乳杆菌接入液体mrs培养基中，37℃培养16h，37℃、90r/min摇瓶培养48h，固体mrs培养基用于菌种活菌数检测，待其乳酸菌浓度达到4.0×1010个/ml，备用。③摇瓶的发酵：将菌悬液按6％(v/v)的量接种到鹿骨蛋白30g，玉米粉2g，nacl5g，加水至1000ml，ph值为7.0的鹿骨蛋白发酵培养基中，于35℃、90r/min培养20h。发酵液经4000r/min离心20min后得到的上清液即为鹿骨多肽溶液。随后取上述粗蛋白粉，参照实施例1的方法进行蛋白纯化和发酵等步骤，得到鹿骨多肽e。实验例1对地塞米松诱导的骨质疏松大鼠骨微结构的影响将上述实施例和对比例制备得到的多肽粉末进行对地塞米松诱导的骨质疏松大鼠骨微结构的影响，进一步验证鹿骨多肽对骨质疏松的治疗作用的实验。一、材料1.鹿骨多肽：实施例和对比例制备得到的鹿骨蛋白和鹿骨多肽a-d；2.wistar雄性大鼠大鼠由吉林大学亿斯实验动物中心提供，实验动物许可证号：scxk-(吉)20140003；3.地塞米松(批号1501212111)，购自辰欣药业股份有限公司；4.复方鹿茸健骨胶囊(批号14110131)为白求恩医科大学制药厂生产；5.骨钙素(bgp)、甲状旁腺激素(pth)、碱性磷酸酶(alp)、降钙素(ct)、钙(ca2+)elisa检测试剂盒，购自基尔顿生物科技(上海)有限公司。二、方法采用糖皮质激素骨质疏松症(giop)模型将wistar雄性大鼠随机分为对照组，模型组，鹿骨多肽a-d组，鹿骨蛋白组，阳性药复方鹿茸健骨胶囊组。除正常对照组外，其他组大鼠均肌肉注射地塞米松2.5mg/kgbw，每周2次。正常对照组大鼠则相应肌肉注射等体积的生理盐水。在造模的同时，鹿骨多肽组大鼠灌胃给予鹿骨多肽125mg/kg。阳性药组大鼠则给与复方鹿茸健骨胶囊作为阳性对照，剂量为540mg/kg。以上给药每天1次，连续给药75天。分别设组。1.实验动物的饲养wistar雄性大鼠于18～24℃通风良好，湿度在60％～70％适中的环境下清洁动物室饲养，自由摄食、饮水。2.实验分组及药物处理实验分为对照组：相应肌肉注射等体积的生理盐水；模型组：肌肉注射地塞米松2.5mg/kgbw，每周2次；鹿骨多肽a-d组，鹿骨蛋白组：在造模的同时，将供试品以剂量为125mg/kgbw灌胃给药；阳性药组：复方鹿茸健骨胶囊作为阳性对照，剂量为540mg/kg；鹿骨多肽组、阳性药组给药每天1次，连续给药75天。3.血清指标检测采用酶联免疫法检测ca2+、alp、pth、bgp、ct，利用生化自动分析仪检测血清磷(p3+)水平。操作步骤按说明书执行。4.microct检测骨微结构各组大鼠处死后迅速取出右侧胫骨，去除附着的软组织，然后将骨组织置于4％多聚甲醛溶液中固定。将标本放入样品杯中并固定好，在相同条件(扫描电压70kv，扫描电流200μa，层距14.80μm，平面分辨率300ms，连续扫描约808层)下扫描。5.he染色给药结束后，将各组大鼠处死，取左股骨远端1/3，除净周围附着的组织，然后将骨组织置于4％多聚甲醛溶液中固定，包埋，切片、染色，制作不脱钙骨切片。三、结果实验结果如下表：1.鹿骨多肽对骨质疏松大鼠血清ca2+、p3+、alp的影响组别剂量(mg/kg)ca2+(μmol/l)p3+(mmol/l)alp(u/l)对照组—529.78±103.921.88±0.3618.82±2.08模型组—288.95±79.482.82±0.03*24.79±4.34*鹿骨多肽a125409.35±89.92#1.86±0.22#16.99±3.53#鹿骨多肽b125392.22±89.231.92±0.2821.12±2.01鹿骨多肽c125319.16±89.281.90±0.3123.95±2.10鹿骨多肽d125322.43±89.341.88±0.3321.26±2.92鹿骨多肽e125310.28±79.981.93±0.2321.89±3.13鹿骨蛋白125315.21±82.321.92±0.3422.38±2.88阳性药540455.69±86.51#1.88±0.32#23.75±2.60注：与对照组比较：*p＜0.05；与模型组比较：#p＜0.05，模型组大鼠血清ca2+下降，而p3+、alp明显增高，与对照组比较差异显著(p＜0.05)；说明造模成功。与模型组相比，鹿骨多肽组和鹿骨蛋白组血清ca2+均有不同程度的增加，p3+具有下降趋势。特别是鹿骨多肽a组和阳性药物组血清ca2+有不同程度的增加，p3+明显下降，与模型组比较差异显著(p＜0.05)，而鹿骨多肽高剂量组血清alp明显下降(p＜0.05)，具有最佳效果。2.鹿骨多肽对骨质疏松大鼠血清pth、bgp、ct的影响组别剂量(mg/kg)pth(pg/ml)bgp(ng/ml)ct(ng/ml)对照组—63.29±12.794.87±0.68128.50±15.79模型组—103.82±9.06*2.89±0.90*126.79±15.02鹿骨多肽a25072.52±10.95#5.89±0.96#118.92±12.40鹿骨多肽b12585.16±13.164.02±0.61138.21±19.32鹿骨多肽c62.593.18±16.243.09±0.34121.29±13.36鹿骨多肽d12591.29±16.293.5±0.23126.33±16.34鹿骨多肽e12592.76±12.333.13±0.19125.69±12.43鹿骨蛋白12582.86±12.333.97±0.11128.87±13.78阳性药54078.25±16.293.29±1.89127.29±9.08注：与对照组比较：*p＜0.05；与模型组比较：#p＜0.05与对照组比较，模型组大鼠血清pth水平显著升高(p＜0.05)，bgp水平显著降低(p＜0.05)；说明造模成功。与模型组比较，与模型组相比，鹿骨多肽组和鹿骨蛋白组大鼠血清pth具有降低趋势，血清bgp水平升高。特别是鹿骨多肽a组大鼠血清pth水平明显降低(p＜0.05)，血清bgp水平显著升高(p＜0.05)；鹿骨多肽组有降低血清ct的趋势。3.microct检测3.骨质疏松大鼠骨微结构注：与对照组比较：*p＜0.05；与模型组比较：#p＜0.05与对照组比较，模型组大鼠骨微结构指标tb.n、bv/tv显著降低(p＜0.05)，而tb.sp、bs/bv显著升高(p＜0.05)；与模型组比较，鹿骨多肽高剂量组胫骨近端的tb.n、bv/tv均明显升高(p＜0.05)，tb.sp、bs/bv均明显降低(p＜0.05)，各组tb.th无明显变化。4.he染色病理切片如图1所示，从图中可看出，大鼠左股骨远端1/3病理切片光境检查显示，与对照组(图1a)比较，模型组(图1b)骨小梁数目明显减少，稀疏断裂，大部分不能连接成网状，骨髓腔明显增大，骨小梁结构出现较大的空白区域，且可见大量脂肪细胞。而鹿骨多肽组(图1c)股骨骨小梁明显宽厚，数目也显著增加，骨小梁断裂与脂肪细胞少见，骨小梁光滑，骨密度增加，接近对照组。阳性药组(图1d)与模型组比较，股骨骨小梁连接呈网状，数目也显著增加，且脂肪细胞少见，骨小梁光滑，骨密度增加，接近对照组。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12