技术领域：
：本发明属于生物工程
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，具体涉及一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其基因、工程菌和制备方法。技术背景：谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase，ec2.3.2.13，tgase)，是一种可以催化酰基转移反应的酶，它能使蛋白质分子中赖氨酸残基上的ε-氨基和谷氨酰胺残基上的γ-羟酰胺基相互作用，形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸键，使得蛋白质(或多肽)之间发生共价交联。谷氨酰胺转氨酶能改变蛋白质的结构和功能性质，从而提高蛋白质的营养价值。因此，谷氨酰胺转氨酶在食品、纺织、生物制药等领域具有广泛的应用前景。在食品工业中，通过谷氨酰胺转氨酶能够提高肉制品的外观、风味和质构，来提高产品的附加值。例如在鱼肉形成凝胶的过程中，通过添加谷氨酰胺转氨酶可以提高鱼肉产品的凝胶强度，减少蒸煮损失，提高产品品质。在烘培食品和面制品加工过程中，在面粉中添加谷氨酰胺转氨酶能提高面团的稳定性，改善面团的弹性和延展性，从而提高面包的品质。在纺织品工业中，在羊毛织物中添加谷氨酰胺转氨酶能提高羊毛织物的纤维强度，降低水解处理过程对羊毛织物纤维的破坏。然而谷氨酰胺转氨酶本身的一些缺陷如比酶活、热稳定性等因素，限制了谷氨酰胺转氨酶的应用范围，例如谷氨酰胺转氨酶催化的生物膜成膜过程，由于高温条件下谷氨酰胺转氨酶活力低使得膜产品的品质下降。酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略。利用分子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体。它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件进化机制，在体外改造酶基因，获得具有某些预期特征的结构酶。其中，易错pcr是指在扩增目的基因的同时，利用taq酶不具备3’→5’校对功能，同时改变反应体系中mn2+、mg2+和各种dntp的浓度，以一定的频率向目的基因随机引入碱基错配，导致目的基因发生随机突变。然而，经一次突变的基因一般很难获得满意的结果，由此又发展出连续易错pcr(sequentialerror-pronepcr)策略。即将一次pcr扩增得到的产物作为下一次pcr扩增的模板，连续反复地进行易错，使每一次获得的小突变不断进行积累而产生重要的有益突变。因此，具有独有的优势。枯草芽胞杆菌属于革兰氏阳性菌。枯草芽胞杆菌表达系统具有以下优点：1、能够高效的分泌各种蛋白质；2、许多枯草芽胞杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽胞杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，枯草芽胞杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体，即可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。因此，本发明中，基于谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的表达平台，利用易错pcr技术，对来源于茂源链霉菌的谷氨酰胺转氨酶基因promtg进行分子改造，并在枯草芽胞杆菌体系中进行表达，以期得到酶活力提高的谷氨酰胺转氨酶。技术实现要素：：本发明目的在于提供一种新型谷氨酰胺转氨酶及其基因、工程菌和制备。本发明实现上述目的的技术线路如下：提取茂源链霉菌基因组，通过pcr扩增得到野生型带有酶原区的谷氨酰胺转氨酶promtg基因(seqidno.3所示)序列(氨基酸序列如seqidno.4所示)，将扩增得到的野生型promtg基因通过易错pcr进行随机突变，获得了两个突变体基因promtgm1和promtgm2。将突变体基因构建重组载体并在枯草芽孢杆菌wb600中成功表达，得到产酶活力提高的的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得新型谷氨酰胺转氨酶。在本发明中采用如下定义：1、氨基酸和dna核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认iupac命名法，采用三字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。2、谷氨酰胺转氨酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示谷氨酰胺转氨酶突变体中突变的氨基酸。如glu209leu，表示位置209的氨基酸由野生型谷氨酰胺转氨酶的glu替换成leu，位置的编号对应于seqidno.4中野生型谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列编号；如g625，表示第625位的碱基为g，位置的编号对应于seqidno.3中野生型谷氨酰胺转氨酶的核苷酸序列编号。本发明中，promtg代表野生型谷氨酰胺转氨酶编码基因，promtgm1和promtgm2分别为谷氨酰胺转氨酶突变体mtg1和mtg2的编码基因；突变前后的碱基及氨基酸对照如下表：谷氨酰胺转氨酶碱基氨基酸野生型g217、a218、g219、g625、a626glu73、glu209mtg1g217、a218、g219、c625、t626glu209leumtg2t217、t218、c219、c625、t626glu73phe、glu209leu所述谷氨酰胺转氨酶突变体mtg1的氨基酸序列如序列表seqidno.6所示；所述谷氨酰胺转氨酶突变体mtg2的氨基酸序列如序列表seqidno.8所示；所述promtgm1基因的核苷酸序列如序列表seqidno.5所示；所述promtgm2基因的核苷酸序列如序列表seqidno.7所示；表达所述突变体基因的宿主细胞为枯草芽孢杆菌wb600，表达载体为pbsa43。本发明还提供上述谷氨酰胺转氨酶突变体制备方法，包括如下步骤：(1)通过易错pcr随机突变茂源链霉菌谷氨酰胺转氨酶基因，获得seqidno.5和seqidno.7所示的谷氨酰胺转氨酶酶突变体基因；(2)将所述的谷氨酰胺转氨酶突变体基因酶切，连接到表达载体，得到携带谷氨酰胺转氨酶突变体编码基因的重组载体；(3)将重组载体转化至宿主细胞，得到重组菌株；(4)表达所述的重组菌株，纯化后获得如seqidno.6和seqidno.8所示的谷氨酰胺转氨酶突变体mtg1和mtg2；突变体mtg1的比酶活较野生型mtg的提高了19％，突变体mtg2的比酶活较野生型mtg比酶活提高了27％。有益效果：1、本发明中谷氨酰胺转氨酶突变体基因在枯草表达系统中进行了表达，得到谷氨酰胺转氨酶突变体重组菌株，重组菌株发酵后，经相应的处理可得到到谷氨酰胺转氨酶突变体。2、本发明使用易错pcr技术，对野生型谷氨酰胺转氨酶进行随机突变，分别得到谷氨酰胺转氨酶突变体mtg1和谷氨酰胺转氨酶突变体mtg2，比酶活较野生型谷氨酰胺转氨酶比酶活分别提高了19％和27％；附图说明：图1为野生型谷氨酰胺转氨酶基因promtg的pcr扩增电泳图；其中：m为dnamarker，1为谷氨酰胺转氨酶酶原基因promtg；图2为重组质粒pet22b-promtg酶切验证图；其中：m为dnamarker，1为pet22b-promtg经bamhi和hindш双酶切；图3为本发明重组质粒pet22b-promtgm1和pet22b-promtgm2酶切验证图；其中：m为dnamarker，1为pet22b-promtgm1经bamhi和hindш双酶切；2为pet22b-promtgm2经bamhi和hindш双酶切；图4为本发明重组质粒pbsa43-promtgm1和pbsa43-promtgm2酶切验证图；其中：m为dnamarker，1为pbsa43-promtgm1经bamhi和hindш双酶切；2为pbsa43-promtgm2经bamhi和hindш双酶切；图5为grossowicz比色法测定酶活显色原理。具体实施方式：为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。实施例1野生型谷氨酰胺转氨酶基因promtg的获得1.将茂源链霉菌(streptomycesmobaraense)cicc11018菌体于液氮中研碎，根据基因组提取试剂盒说明书提取茂源链霉菌基因组。2.以提取的茂源链霉菌的基因组为模板，根据genbank序列号ay241675.1登录的谷氨酰胺转氨酶序列，在orf框上下游设计一对引物，分别引入限制性酶切位点bamhi、hindⅲ，本发明的谷氨酰胺转氨酶基因的扩增引物如下：上游引物p1(seqidno.1)：5’-cgcggatccgggcagcggcaccggggaag-3’下游引物p2(seqidno.2)：5’-cccaagctttcacggccagccctgtgtcacct-3’以p1和p2作为上、下游引物，以茂源链霉菌谷氨酰胺转氨酶基因组为模板进行扩增；其扩增的反应条件为：上游引物p11.5ul下游引物p21.5uldna模板2.0ulpyrobest酶0.5ulddh2o34.5ul扩增条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸1min20s反应30个循环；72℃延伸10min。pcr扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到1147bp的条带(图1)，用小量dna回收试剂盒回收pcr产物，得到本发明的谷氨酰胺转氨酶的酶原区基因promtg，将扩增获得的promtg与载体pet22b载体连接，得到重组质粒pet22b-promtg，并化转入dh5α中，测序后见seqidno.3。实施例2谷氨酰胺转氨酶突变体基因的获得1、基于易错pcr技术进行随机突变，构建新型谷氨酰胺转氨酶，设计引物如下：上游引物p1(seqidno.1)：5’-cgcggatccgggcagcggcaccggggaag-3’下游引物p2(seqidno.2)：5’-cccaagctttcacggccagccctgtgtcacct-3’在易错pcr反应体系中，以p1和p2作为上下游引物，以野生型谷氨酰胺转氨酶成熟肽基因为模板，进行易错pcr。其扩增的反应条件为：扩增条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸1min30s反应30个循环；72℃延伸10min。2、将谷氨酰胺转氨酶突变体基因克隆入表达载体pet22b中，转化大肠杆菌bl21(de3)，接种于每孔含200μllb液体培养基(含50μg/ml的amp)的96孔细胞培养板中，于37℃条件下200r/min摇床培养，当od600达到0.6，向每个孔中加入iptg(终浓度1mmol/l)，在16℃下诱导16h，4℃下4000r/min离心15min后收集菌体，重悬于15ml预冷的ph为7.4的pbs缓冲液中，用低温超高压连续流动细胞破碎仪破碎细胞，破碎结束后，在4℃下12000r/min离心45min，收集上清液获得谷氨酰胺转氨酶粗酶液，再用200μg/ml的中性蛋白酶溶液37℃孵育20min活化谷氨酰胺转氨酶酶原，随后进行酶活力检测。3、谷氨酰胺转氨酶酶活测定grossowicz比色法测定酶活原理：通过grossowicz比色法测定酶活，以α-n-cbz-gln-gly为作用底物，l-谷氨酸-γ-单羟胺酸做标准曲线,显色反应见图5.酶活测定所需试剂如下：试剂a：1g的α-n-cbz-gln-gly溶解于2ml0.2mol/l的naoh，加入0.2mol/lph6.0的tris-hci缓冲液4ml，0.lmol/l的羟胺2ml，0.01mol/l的谷胱甘肽2ml，并调节ph至6.0。试剂b：3mol/l的盐酸、12％tca、5％fecl3按1：1：1的比例混合。酶活力测定方法如下：取200μl的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph6.0)于96孔板中，37℃保温1min，加入10μl的稀释适当倍数的酶液，再加入10μl的底物试剂a，反应10min后加入100μl终止试剂b，记录525nm波长处吸光度值。1个单位谷氨酰胺转氨酶酶活定义为：37℃时每分钟催化形成1μmoll-谷氨酸-γ-单羟胺酸的酶量(u/ml)。将所有突变体测酶活后与野生型谷氨酰胺转氨酶酶活比较，筛选出两株产酶活力较野生型提高了19％和27％的菌株。4、序列测定将两株谷氨酰胺转氨酶突变体基因序列进行测序(北京华大生物工程公司)，结果表明，扩增得到了谷氨酰胺转氨酶突变体基因promtgm1和谷氨酰胺转氨酶突变体基因promtgm2，核苷酸序列见seqidno.5和seqidno.7。实施例3枯草芽胞杆菌新型谷氨酰胺转氨酶重组菌的构建1、表达载体pbsa43的构建pbsa43是以大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭克隆载体pbe2为骨架，克隆入一个强的芽胞杆菌组成型启动子p43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中果聚糖蔗糖酶信号序列sacb而获得。它带有ampr基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记；同时也具有kmr基因，可以在枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。pbsa43质粒的构建参见中国发明专利《解淀粉芽孢杆菌添加前体物发酵法生产抗病毒药物利巴韦林的生产工艺》cn103146785b。2、谷氨酰胺转氨酶表达载体pbsa43-promtgm1和pbsa43-promtgm2的构建将经pcr扩增并经bamhi和hindiii双酶切后回收的谷氨酰胺转氨酶突变体基因与同样双酶切的枯草芽胞杆菌表达载体pbsa43用连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌jm109感受态细胞中，经amp抗性筛选，挑选阳性转化子，提取转化子质粒，并进行单、双酶切验证和测序，确定构建获得正确的重组菌株jm109/pbsa43-promtgm1和jm109/pbsa43-promtgm2。3、重组表达载体pbsa43-promtgm1和pbsa43-promtgm2转化枯草芽胞杆菌wb600将1μl(50ng/μl)的pbsa43-promtgm1和pbsa43-promtgm2重组质粒加入到50μl的枯草芽胞杆菌wb600感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25uf，200ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1ml复苏培养基(lb+0.5mol/l山梨醇+0.38mol/l甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的lb平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行单、双酶切验证，确定获得枯草芽胞杆菌重组菌株wb600/pbsa43-promtgm1和wb600/pbsa43-promtgm2。实施例4谷氨酰胺转氨酶突变体在枯草芽胞杆菌重组菌株中的表达及制备将以实施例3同样方式构建的野生型谷氨酰胺转氨酶重组菌wb600/pbsa43-promtg为对照，将枯草芽胞杆菌重组菌株wb600/pbsa43-promtgm1、wb600/pbsa43-promtgm2和wb600/pbsa43-promtg分别接种于5ml的lb液体培养基(含卡那霉素，50μg/ml)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50ml新鲜lb培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，即可制备获得高稳定性谷氨酰胺转氨酶粗酶液，将粗酶液进行酶活测定。野生型谷氨酰胺转氨酶酶活力为20.1u/ml，突变体mtg1酶活力为23.9u/ml，较野生型mtg酶活力提高了19％，突变体mtg2酶活力为25.5u/ml，较野生型mtg酶活力提高了27％。然后采用分级盐析法沉淀新型谷氨酰胺转氨酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得新型谷氨酰胺转氨酶纯酶酶粉。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。sequencelisting<110>天津科技大学<120>一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其基因、工程菌和制备方法<130>1<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>29<212>dna<213>人工序列<400>1cgcggatccgggcagcggcaccggggaag29<210>2<211>32<212>dna<213>人工序列<400>2cccaagctttcacggccagccctgtgtcacct32<210>3<211>1128<212>dna<213>茂源链霉菌（streptomycesmobaraense）cicc11018<400>3ggcagcggcaccggggaagagaagaggtcctacgccgaaacgcaccgcctgacggcggat60gacgtcgacgacatcaacgcgctgaacgaaagcgctccggccgcttcgagcgccggtccg120tccttccgggcccccgactccgacgagcgggtgactcctcccgccgagccgctcgaccgg180atgcccgacccgtaccggccctcgtacggcagggccgagacgatcgtcaacaactacata240cgcaagtggcagcaggtctacagccaccgcgacggcaggaaacagcagatgaccgaggaa300cagcgggagtggctgtcctacggttgcgtcggtgtcacctgggtcaactcgggccagtat360ccgacgaacaggctggctttcgcgttcttcgacgaggacaagtacaagaacgagctgaag420aacggcaggccccggtccggcgaaacgcgggcggagttcgaggggcgcgtcgccaaggac480agcttcgacgaggcgaaggggttccagcgggcgcgtgacgtggcgtccgtcatgaacaag540gccctggagaacgcccacgacgagggggcgtacctcgacaacctcaagaaggagctggcg600aacggcaacgacgccctgcggaacgaggatgcccgctcgcccttctactcggcgctgcgg660aacacgccgtccttcaaggaccgcaacggcggcaatcacgacccgtccaagatgaaggcc720gtcatctactcgaagcacttctggagcggccaggaccggtcgggctcctccgacaagagg780aagtacggcgacccggaggccttccgccccgaccgcggcaccggcctggtcgacatgtcg840agggacaggaacattccgcgcagccccaccagccccggcgagagtttcgtcaatttcgac900tacggctggttcggagcgcagacggaagcggacgccgacaagaccgtatggacccacggc960aaccactaccacgcgcccaatggcagcctgggtgccatgcacgtgtacgagagcaagttc1020cgcaactggtccgacggttactcggacttcgaccgcggagcctacgtggtcacgttcgtc1080cccaagagctggaacaccgcccccgacaaggtgacacagggctggccg1128<210>4<211>376<212>prt<213>茂源链霉菌（streptomycesmobaraense）cicc11018<400>4glyserglythrglygluglulysargsertyralagluthrhisarg151015leuthralaaspaspvalaspaspileasnalaleuasngluserala202530proalaalaserseralaglyproserpheargalaproaspserasp354045gluargvalthrproproalagluproleuaspargmetproasppro505560tyrargprosertyrglyargalagluthrilevalasnasntyrile65707580arglystrpglnglnvaltyrserhisargaspglyarglysglngln859095metthrglugluglnargglutrpleusertyrglycysvalglyval100105110thrtrpvalasnserglyglntyrprothrasnargleualapheala115120125phepheaspgluasplystyrlysasngluleulysasnglyargpro130135140argserglygluthrargalagluphegluglyargvalalalysasp145150155160serpheaspglualalysglypheglnargalaargaspvalalaser165170175valmetasnlysalaleugluasnalahisaspgluglyalatyrleu180185190aspasnleulyslysgluleualaasnglyasnaspalaleuargasn195200205gluaspalaargserprophetyrseralaleuargasnthrproser210215220phelysaspargasnglyglyasnhisaspproserlysmetlysala225230235240valiletyrserlyshisphetrpserglyglnaspargserglyser245250255serasplysarglystyrglyaspproglualapheargproasparg260265270glythrglyleuvalaspmetserargaspargasnileproargser275280285prothrserproglygluserphevalasnpheasptyrglytrpphe290295300glyalaglnthrglualaaspalaasplysthrvaltrpthrhisgly305310315320asnhistyrhisalaproasnglyserleuglyalamethisvaltyr325330335gluserlyspheargasntrpseraspglytyrserasppheasparg340345350glyalatyrvalvalthrphevalprolyssertrpasnthralapro355360365asplysvalthrglnglytrppro370375<210>5<211>1128<212>dna<213>人工序列<400>5ggcagcggcaccggggaagagaagaggtcctacgccgaaacgcaccgcctgacggcggat60gacgtcgacgacatcaacgcgctgaacgaaagcgctccggccgcttcgagcgccggtccg120tccttccgggcccccgactccgacgagcgggtgactcctcccgccgagccgctcgaccgg180atgcccgacccgtaccggccctcgtacggcagggccgagacgatcgtcaacaactacata240cgcaagtggcagcaggtctacagccaccgcgacggcaggaaacagcagatgaccgaggaa300cagcgggagtggctgtcctacggttgcgtcggtgtcacctgggtcaactcgggccagtat360ccgacgaacaggctggctttcgcgttcttcgacgaggacaagtacaagaacgagctgaag420aacggcaggccccggtccggcgaaacgcgggcggagttcgaggggcgcgtcgccaaggac480agcttcgacgaggcgaaggggttcca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