本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种耐高温的内切型木聚糖酶epxyn1及其编码基因和应用。
背景技术：
：：半纤维素广泛存在于各种植物细胞壁中，是地球上最为重要的生物质资源之一，广泛应用于生物燃料、高附加值化学品及生物基材料的制备。异质木聚糖是半纤维素的主要成分之一，其由木糖通过β-1,4糖苷键连接的主链及含有不同取代基的侧链构成。半纤维素工业利用的重要步骤是通过酶解途径将异质木聚糖降解成可发酵的单糖、木寡糖或其他化学品。异质木聚糖的完全降解需要主链酶(如内切型木聚糖酶和木糖苷酶)和侧链酶系的协同作用。内切型木聚糖酶(endo-β-1,4-xylanase，ec3.2.1.8)是木聚糖酶系中最关键的组分，它能够水解木聚糖主链分子的β-1,4-糖苷键，将木聚糖水解为木二糖或木寡糖等低聚糖。目前，内切型木聚糖酶已被广泛应用于生物能源、饲料、食品、造纸、纺织、医药保健等诸多领域。至今，报道的木聚糖酶大多数为中温酶，其最适活性温度在50-55℃之间，且难以耐受65℃或以上的高温条件。由于许多工业生产环节都存在高温环境，开发耐高温的木聚糖酶符合市场需求。技术实现要素：发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种来自于微细正青霉eupenicilliumparvum4-14的耐高温的内切型木聚糖酶epxyn1。本发明的再一目的是提供编码上述木聚糖酶的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供上述耐高温的内切型木聚糖酶的应用。技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种耐热内切型木聚糖酶epxyn1，其氨基酸序列如seqidno.1所示。所述的耐热内切型木聚糖酶epxyn1的编码基因，其碱基序列如seqidno.2所示。含有所述的耐热内切型木聚糖酶epxyn1的编码基因的表达载体或表达体系。所述的耐热内切型木聚糖酶epxyn1的编码基因在表达耐热内切木聚糖酶epxyn1中的应用。所述的耐热内切型木聚糖酶epxyn1在酶解半纤维素中的应用。所述的耐热内切型木聚糖酶epxyn1在酶解木聚糖中的应用。有益效果：与现有技术相比，本发明从微细正青霉(eupenicilliumparvum)4-14中克隆得到一个新的耐热内切型木聚糖酶epxyn1的编码基因，并通过毕赤酵母对其进行重组表达，获得纯酶。重组的木聚糖酶epxyn1具有高温(75℃)催化能力及优良的温度稳定性和ph稳定性，对各种木聚糖的降解产物主要为木二糖和长链木寡糖。本发明的耐热内切型木聚糖酶epxyn1具有高比活性(降低成本)、高的酶解效率(高温下，底物溶解度大)、高稳定性和不易污染杂菌等优势，在生物质能源、饲料、造纸、食品及医药保健等领域具有重要应用前景。附图说明图1是重组木聚糖酶epxyn1的sds-page电泳图；图中，m：marker；epxyn1：纯化的木聚糖酶；图2是重组木聚糖酶epxyn1的最适ph结果图；图3是重组木聚糖酶epxyn1的最适温度结果图；图4是重组木聚糖酶epxyn1的ph稳定性结果图；图5是重组木聚糖酶epxyn1的温度稳定性结果图；图6是重组木聚糖酶epxyn1对不同木聚糖水解产物的薄层层析分析结果图；图中，a，榉木木聚糖的水解产物分析；b，桦木木聚糖的水解产物分析；c，燕麦木聚糖的水解产物分析；d，木寡糖(木二至木六糖)的水解产物分析。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例所使用的材料和试剂如下：菌株及载体：微细正青霉4-14(eupenicilliumparvum4-14)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno:m2015404。巴斯德毕赤酵母(pichiapastoriskm71h)及表达载体ppiczαb购自invitrogen公司，大肠杆菌dh5α及基因操作质粒peasy-blunt购自promega公司。酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、dna聚合酶、连接酶和dntp购自takara公司；燕麦木聚糖、桦木木聚糖和山毛榉木聚糖购自sigma公司；其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。lb培养基：peptone10g，yeastextract5g，nacl10g，加蒸馏水至1000ml，ph自然(约为7)。固体培养基在此基础上加1.5％(w/v)琼脂。pda培养基：土豆200g,葡萄糖20g，琼脂粉15g，高温高压灭菌，ypd培养基：10gyeastextract，20gpeptone，溶于900ml水，高温高压灭菌，加入100ml菌灭的20％的葡萄糖。bmgy培养基：10gyeastextract，20gpeptone溶于700ml水，高温高压灭菌，冷却到室温后加入100mlph＝6的1m的磷酸钾缓冲液(温高压灭菌)，100ml10×ynb(滤膜灭菌)，2ml500×b(20mgbiotin溶于100ml的水，滤膜灭菌)，100ml10×gy(100ml甘油溶于900ml水高温高压灭菌)，混合均匀后4℃保存。bmmy：10gyeastextract，20gpeptone溶于700ml水，高温高压灭菌，冷却到室温后加入，100mlph6的1m的磷酸钾缓冲液(温高压灭菌)，100ml10×ynb(滤膜灭菌)，2ml500×b(20mgbiotin溶于100ml的水，滤膜灭菌)，100ml10×m(5％的甲醇)，混合均匀后4℃保存。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1耐热内切型木聚糖酶epxyn1编码基因的克隆真菌培养与总rna提取：取约109个微细正青霉4-14菌株的孢子接入50mlpda液体培养基中，37℃、180rpm培养4天。取1ml培养物接入一瓶固态发酵培养基(l.long,d.ding,z.han,h.zhao,q.lin,s.ding,thermotoleranthemicellulolyticandcellulolyticenzymesfromeupenicilliumparvum4-14displayhighefficiencyuponreleaseofferulicacidfromwheatbran,j.appl.microbiol.121(2016)422-434.)中，摇匀后置于37℃、70％湿度条件下静置培养3天。取白色菌丝体以无菌水漂洗干净后，滤纸吸干水分，液氮速冻后置于-70℃保存。以transzoltmplant试剂盒(transgen，北京)提取菌体总rna。基因克隆：取适量总rna以easyscriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒(transgen，北京)和oligo(dt)为引物进行反转录反应获得cdna。以获得cdna为模板，以引物enxyn1_f1(5′-ttgccgtccacgctctatc-3′)和enxyn1_r1(5′-acagcctacgaggaattaacaac-3′)进行常规pcr反应，获得目标基因片段。进一步，将目标基因片段克隆到载体peasy-blunt(transgen，北京)，并由上海博尚生物技术有限公司完成序列分析。最后得到含有内切型木聚糖酶epxyn1的基因全长的片段。测序结果显示，该内切型木聚糖酶epxyn1基因全长1212bp，dna序列见seqidno.2，表达的蛋白(内切型木聚糖酶epxyn1)序列见seqidno.1，其阅读框包含404个氨基酸，其中前22个氨基酸为信号肽。经蛋白同源性比对发现其属于糖苷水解酶家族10成员，成熟蛋白的理论分子量为40.75kda，理论等电点(pi)为4.97。实施例2耐热内切型木聚糖酶epxyn1的毕赤酵母表达及纯化分别设计合成了内切木聚糖酶epxyn1的特异性引物enxyn1_f2和enxyn1_r2，如下：enxyn1_f2：5′-agagaggctgaagctgaattctcaggcctggatacagcggca-3′；enxyn1_r2：5′-gagatgagtttttgttctagatcagtgatggtgatggtgatgcagacattgagagtacca-3′。利用这对引物从含有内切木聚糖酶epxyn1基因的质粒上扩增获得其不含信号肽的内切木聚糖酶epxyn1基因片段。将扩增的目标基因片段进行切胶纯化，并通过hieffclonetmonestepcloningkit(yeasen,上海)与经ecori-xbai酶切的质粒ppiczαb进行同源重组，获得基因表达质粒ppic-epxyn1。重组质粒ppic-epxyn1经限制性内切酶saci线性化后电击转入pichiapastoriskm71h后，利用含有1m山梨醇和100μg/mlzeocin(invitrogen)抗生素的ypd平板进行阳性克隆的筛选。将筛选到的阳性克隆接入装有5mlypd和100μg/ml抗生素zeocin的试管中28℃，200rpm摇床培养，20h后将菌液分别转接到30mlbmgy培养液中28℃，200rpm摇床培养至其od600达到4.0后，离心收集菌体，再转接到25mlbmmy培养液中28℃，200rpm摇床培养，每隔24h补加甲醇，甲醇浓度为0.8％(v/v)，连续培养5d后离心收集粗酶液。将粗酶液先装入透析袋中，4℃在ph8.0的磷酸缓冲液中轻微搅拌透析24h。酶液的纯化参照ni-ntaagarose(qiagen)的方法。蛋白定量分析采用bca检测试剂盒(thermotech,usa)完成。将纯化得到的蛋白利用sds-page进行检测。结果如图1所示，可见重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达，经纯化后为单一条带，分子量接近52.5kda。实际分子量大小比理论分子量大，由糖基化引起。实施例3耐热内切木聚糖酶epxyn1的活性测定方法的建立以beechwood木聚糖为底物，采用somogyi-nelson法测定还原糖含量并计算酶活性。1.5ml反应体系为：1.0ml50mmph5.0柠檬酸钠缓冲液，400μl0.5％(w/v)底物，轻轻混匀后预热10min，然后加入100μl粗酶液(预先稀释到不同梯度的倍数)，在75℃下反应时间为10min。然后依次取出，加入500μlsomogyireagent溶液，放入99℃水浴锅中15min，冷却置室温，加入0.5mlnelsonreagent，20min反应后，离心10min，吸取200μl到酶标板上，置于酶标仪里测波长520nm下样品的吸光度(od值)。同时，配制不同浓度的木糖溶液，以上述方法(somogyi-nelson法)测定各木糖溶液的od520读数。以木糖溶液浓度为横坐标和od520读数为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线为：y＝0.0136x-0.0592；其中，y为od520读数，x为木糖浓度(μg/ml)。根据标准曲线计算样品中木聚糖酶活性。一个木聚糖酶活单位(u)指每分钟产生1μmol木糖所需的酶量。木聚糖酶活性计算公式如下：其中，x为根据木糖标准曲线算出的木糖含量(μg)；m为木糖的摩尔质量(150g/mol)；c为酶液体积(ml)；t为酶解作用时间(min)；n＝酶液的稀释倍数。实施例4耐热内切木聚糖酶epxyn1的性质测定1)耐热内切木聚糖酶epxyn1的最适ph和最适温度最适ph测定：将实施例2纯化得到的酶液在75℃下，以榉木木聚糖为底物，在ph分别为3.0至9.5的广泛缓冲液(b.l.turner,variationinphoptimaofhydrolyticenzymeactivitiesintropicalrainforestsoils,appl.environ.microbiol.2010,76(19):6485-93)中测定酶活性。结果如图2所示，表明epxyn1的最适ph为5.5。最适温度测定：在ph5.5的50mm柠檬酸钠缓冲液中，以榉木木聚糖为底物，分别在30-90℃的条件下测定酶活性。以最高酶活性为100％，计算各温度条件下的相对酶活性。结果显示：木聚糖酶epxyn1的最适反应温度为75℃，80℃下仍然有90％的活性(图3)。2)耐热内切木聚糖酶epxyn1的ph稳定性测定和热稳定性测定ph的耐受性测定：将实施例2制备纯酶液在不同的ph条件下(广泛缓冲液ph3.0-12.0)4℃保存12小时。以榉木木聚糖为底物，在最适条件下测定各处理样品的酶活性。以未处理的酶液作为对照，计算各处理的相对酶活。如图4所示，该酶经ph9和10条件的处理，剩余酶活可达90％以上；经ph3和4条件的处理，剩余酶活可达80％以上；经ph5-8条件的处理，剩余酶活可达70％以上。温度稳定性测定：将同样酶量的酶液置于设定的温度中(65℃、70℃和75℃下)保温0-90分钟，然后置于冰上。以榉木木聚糖为底物，在最适温度和ph下测各样品的活力。以未处理样品的酶活性为100％，计算处理样品的相对酶活性。结果表明：木聚糖酶epxyn1具有良好的耐热性；在65℃下处理90min还能保持84％活性；在70℃下处理30min还能保持74％活性(图5)。3)耐热内切木聚糖酶epxyn1的比活力及动力学常数测定重组木聚糖酶epxyn1的比活力及动力学常数在75℃下及ph5.5的50mm柠檬酸钠缓冲液中进行。epxyn1比活力的测定按照实施例3中的方法进行，计算出单位酶量(mg)所具有的酶活性。酶动力学常数的测定，以不同浓度的底物(0.125-2.5mg/ml)进行活性测定。其中底物分别为：榉木木聚糖、桦木木聚糖和燕麦木聚糖。酶动力学常数的数据利用graphpadprism5.0软件进行非线性回归分析计算该酶的动力学常数。结果表明：epxyn1在以榉木木聚糖、桦木木聚糖和燕麦木聚糖为底物的比活性分别为384.42u/mg、486.71u/mg和372.16u/mg；km分别为0.86mg/ml、1.00mg/ml和2.19mg/ml；vmax分别664.80μmol/mg、694.50μmol/mg和711.30μmol/mg；kcat分别为554.00s-1、578.75s-1和592.75s-1(表1)。表1重组木聚糖酶epxyn1的比酶活及动力学常数底物比活性(u/mg)km(mg/ml)vmax(μmol/mg)kcat(s-1)榉木木聚糖384.42±29.420.86±0.10664.80±31.01554.00±25.84桦木木聚糖486.71±37.721.00±0.07694.50±16.63578.75±13.86燕麦木聚糖372.16±20.642.19±0.37711.30±59.50592.75±49.58注：epxyn1的kcat值以其实际分子量53kda进行计算。4)金属离子或化学试剂对耐热内切木聚糖酶epxyn1活性的影响在50mm柠檬酸钠缓冲液中，分别添加1或5mm的mgcl2或fecl3或mncl2或cocl2或zncl2或cucl2或cacl2或niso40.1或edta或sds，以榉木木聚糖为底物，在最适反应条件下测定木聚糖酶epxyn1的活性。以为处理组作为对照，计算各处理的相对酶活。结果显示：ca2+、zn2+、mg2+、cu2+、co2+、mn2+或ni2+在低浓度(1mm)下对酶活性影响不显著，在高浓度(5mm)下能够小幅度的降低酶活性。fe3+在高浓度(5mm)下能够显著的抑制酶的活性。edta(1mm)的添加使得酶活性提高约17％。sds在低浓度(1mm)下对酶活性影响不显著，但在高浓度(5mm)下能够极大地抑制酶活性(表2)。表2金属离子或化学试剂对重组木聚糖酶epxyn1活性的影响实施例5耐热内切木聚糖酶epxyn1降解木聚糖的产物分析以纯化的重组木聚糖酶epxyn1对不同的木聚糖(榉木木聚糖、桦木木聚糖或燕麦木聚糖)或木寡糖(木二糖到木六糖，青岛博智汇力生物科技有限公司，青岛)进行水解。通过薄层层析技术(tlc)分别分析水解产物的构成。木聚糖的水解过程如下：2ml柠檬酸钠缓冲液(ph5.0,50mm)加入10mg榉木木聚糖或20mg桦木木聚糖或20mg燕麦木聚糖或2mg的木寡糖，并加入25μg纯化的epxyn1，75℃下反应24h。沸水浴10min，终止反应。将水解产物于5,000×g离心10min,并取3μl上清液点接薄层层析板tlcsilicagel60f254glassplates(merck,whitehousestation,nj,usa)，并在展开剂乙腈–乙酸乙酯–异丙醇–水(17:5:11:10,v/v/v/v)(b.-d.amel,b.nawel,b.khelifa,g.mohammed,j.manon,k.-g.salima,n.farida,h.hocine,o.bernard,c.jean-luc,f.marie-laure,characterizationofapurifiedthermostablexylanasefromcaldicoprobacteralgeriensissp.nov.strainth7c1t,carbohyd.res.419(2016)60-68)。将tlc平板晾干10min，喷洒含0.2％苔黑酚的甲醇-硫酸混合液(9:1,v/v)，85℃烘烤5min，观察产物(h.liao,s.sun,p.wang,w.etal.,anewacidophilicendo-β-1,4-xylanasefrompenicilliumoxalicum:cloning,purification,andinsightsintotheinfluenceofmetalionsonxylanaseactivity,j.ind.microbiol.biotechnol.41(7)(2014)1071-1083)。以木糖及木寡糖(木二糖至木六糖)标准品混合液作为tlc分析的参照。结果显示：重组木聚糖酶epxyn1分别水解三种木聚糖的主要产物是木二糖，木三糖和长链木寡糖次之，并有极少量的木糖(图6a-c)；所有木寡糖的水解产物为木二糖和极少量的木糖(图6d)。该木聚糖酶适合生产木二糖及木三糖等木寡糖产品。序列表<110>南京林业大学<120>一种耐热内切型木聚糖酶epxyn1及其编码基因和应用<130>100<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>404<212>prt<213>微细正青霉(eupenicilliumparvum)<400>1metvaltyrleuseralaargthrleualaleuvalalacysvalleu151015proglnleuthrglnalaserglyleuaspthralaalavalalaile202530glylysvaltyrpheglythralathraspasnprogluleuthrasp354045thralatyrvallysglnleuserasnthraspasppheglyglnile505560thrproglyasnserglnlystrpaspalathrgluproserglnasn65707580serphethrphethrasnglyaspvalvalalahisleualaglugly859095asnglyglnlysleuargcyshisasnleuvaltrphisasnglnleu100105110proasntrpvalthrserglysertrpthrasngluthrleuleuala115120125alametlysasnhisilethrasnvalvalthrhistyrlysglygln130135140cystyralatrpaspvalvalasnglualaleuasngluaspglythr145150155160tyrargaspserilephetyrglnthrileglyglualatyrilepro165170175ilealaphelysthralaalaalaalaaspprothrvallysleutyr180185190tyrasnasptyrasnileglutyralaglyalalysalathrglyala195200205glnargilevallysleuileglnsertyrglyalalysileaspgly210215220valglyleuglnserhispheilevalglyserthrproserglnser225230235240alaglnalaserasnmetalaalaphethralaleuglyvalaspval245250255alailethrgluleuaspileargmetthrleuproserthraspala260265270leuleualaglnglnlysthrasptyrhisserthrvalalaalacys275280285valglnthralaargcysvalglyvalthriletrpasptrpthrasp290295300lystyrsertrpvalproserthrpheserglyglnglyalaalacys305310315320protrpaspgluasnpheglnlyslysproalatyraspglyileleu325330335seralaleuglyglyseralaseralathrserthrserthralagly340345350glnseralaserthrthrserthrserglyserglyglyserthrala355360365valalaglnhistrpglyglncysglyglyglnglytrpthrglyala370375380thrsercysalathrglytyrilecysthrphevalasnasptrptyr385390395400serglncysleu<210>2<211>1215<212>dna<213>微细正青霉(eupenicilliumparvum)<400>2atggtatacttgtctgcaaggacactggcattggtagcctgcgtccttccacagctgacg60caagcatcaggcctggatacagcggcagtagccatcggaaaggtctacttcggcacggcc120accgataaccccgagttgacggacactgcctatgtcaagcagctcagcaacacggatgac180tttggtcaaatcacaccgggaaactcgcagaagtgggatgcgacagagccatcgcagaac240tcgtttaccttcacgaacggagatgtcgtcgcccacctcgcggagggtaatggccagaaa300ttgcggtgccataatctggtctggcataatcagctacccaactgggtcaccagtggctcg360tggaccaacgaaacactccttgcggcaatgaagaaccacattaccaatgtggtcacccat420tataaaggacagtgttatgcctgggatgttgtcaacgaagcactcaacgaagatggaacc480taccgagacagcatattctaccaaaccatcggcgaagcctacatccccattgccttcaaa540acagccgcagccgcagatccaaccgtcaagctctactacaacgactacaacatcgaatac600gccggcgccaaggcgacaggcgcacaacgaatcgtcaagctaatccagtcctatggagcg660aagatcgacggcgtcggtctccaatcccacttcatcgtcggcagtaccccgagccagagt720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