本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种重组载体，用于鉴定烟草对南方根结线虫是否存在抗性。
背景技术：
烟草根结线虫病是世界烟叶生产中的主要病害之一。由于杀线剂农药(铁灭可等)的限制应用，抗病品种的利用已成为防治根结线虫病最有效的措施。我国烟草抗根结线虫病的育种还很薄弱，主要是应用美国抗根结线虫病的烤烟品种为亲本，开展兼抗性育种，因此具有抗根结线虫病特性的育成品种其抗性不高，在整个烤烟育种中始终没有针对烟草抗根结线虫病开展育种研究，其主要原因是传统的抗性鉴定技术难于适应大量育种材料鉴定的需求，且鉴定结果受环境影响较大，准确性不高，限制了烟草抗根结线虫病育种的开展。
1963年，美国kofiod和white等人首次报道在抗南方根结线虫品种叶片上发现了一种严重的叶脉坏死病斑。经过henderson和troutman等的分离鉴定，将其确定为pvy新的株系。pvy-msnr株系在根结线虫抗性品种上引起的枯斑反应是由于其对根结线虫抗性基因的条件作用造成的多效性影响所致，病毒接种鉴定法为筛选分离世代单株是否具有抗南方根结线虫基因提供了一个简单而又有效的方法。可以通过接种pvy-msnr来鉴定烟草品种对南方根结线虫的抗性，并把这项技术用于烟草抗病育种程序中，能够极大地缩短育种年限。
国外研究人员通过人工接种pvy-msnr，在抗南方根结线虫品种叶片上引起过敏性坏死反应(枯斑反应)，而在感病品种上未出现症状，以此来筛选抗线虫品种。但是pvy-msnr病毒接种鉴定法所需病毒接种材料是在美国东南部地区发现，国内暂未发现此病毒株系，病毒材料需要从国外引进，引进过程中可能会出现植物病毒变异后突变的情况。2002年johnp.fellers等采用分子生物学手段证明pvy-msnr复制酶(pvy-nib)是烟叶接种病毒后在抗线虫品种上产生枯斑反应的诱导因子。
利用植物病毒载体表达外源基因是新近发展起来的一种基因瞬时表达方法。与转基因方法相比，该方法操作简单，可在短期内使外源基因迅速表达，而且能同时对多个品种进行感染。马铃薯x病毒(potatovirusx，pvx)，作为外源基因的病毒表达载体被广泛应用。载体的构建主要采用基因插入和融合蛋白的策略。
烟草根结线虫病抗病性鉴定是烟草抗线虫育种的前提和基础。我国烟草抗根结线虫鉴定主要通过田间病圃和人工接种鉴定，鉴定技术与结果不仅受环境影响较大，而且不能快速、大量的鉴定烟草种质资源和以及用于对杂种后代材料的筛选，限制了抗病育种的有效开展，这是目前我国烟草抗根结线虫病育种急需解决的问题。因此，病毒接种能够加速烟草抗根结线虫品种的鉴定，缩短育种进行，提高育种效率。
技术实现要素：
为解决烟草对根结线虫抗性鉴定周期长、效率低、受环境影响因素多的技术问题，本发明提供一种病毒瞬时表达载体，该病毒瞬时表达载体为重组载体，用于鉴定烟草对南方根结线虫是否存在抗性。
本发明通过人工合成pvy-msnr株系复制酶基因，构建pvx病毒瞬时表达载体，建立新的烟草抗根结线虫病品种基因鉴定技术体系；并通过与国外pvy-msnr病毒直接接种鉴定，传统抗病性鉴定，人工盆栽鉴定对比，验证该鉴定体系的准确性。本发明建立的重组载体可以实现简单、准确、快速、高通量的对烟草抗根结线虫的抗性筛选鉴定。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的重组载体，是由seqidno.1所示序列通过5’notl和3’sall克隆至载体pnd108获得。
一种所述用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的重组载体的建立方法，包括以下步骤：
(1)人工合成病毒pvy-nib的cdna片段：在pvy-nib的cdna片段序列中分别加入克隆位点：notl和sali，加入克隆位点后的序列为seqidno.1；
(2)pvx:pnd108-nib瞬时表达载体的构建：将pnd108空载体进行双酶切，并通过t4dna连接酶将空载体pnd108和步骤(1)中的加入克隆位点后人工合成的pvy-nib的cdna片段进行连接，构建pvx:pnd108-nib瞬时表达载体，即所述重组载体。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明根据烟草品种抗根结线虫与抗pvy-msnr产生枯斑是同一基因所致，通过直接接种pvy-msnr病毒，使叶片产生枯斑证明烟株存在抗pvy-msnr基因，从分子水平上确定其抗根结线虫，该鉴定体系比目前现有的两种鉴定方法的准确性高。
2、本发明通过直接接种pvy-msnr复制酶基因来鉴定烟草品种对南方根结线虫的抗性，鉴定方法简单有效，适应大量育种材料鉴定的需求，且简单、准确、快速、高通量的对烟草抗根结线虫(南方根结线虫)的抗性筛选鉴定。
3、本发明用于烟草抗南方根结线虫育种程序中，能够极大地缩短育种年限。
附图说明
图1为本发明实施例1中的pvx-pnd108表达载体的双酶切结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细说明。
一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的重组载体，是由seqidno.1所示序列通过5’notl和3’sall克隆至载体pnd108获得。
一种所述用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的重组载体的建立方法，包括以下步骤：
(1)人工合成病毒pvy-nib的cdna片段：pvy-nib的cdna片段序列参照ncbi，登录号：af463399.1，分别加入克隆位点：notl和sali，加入克隆位点后的序列为seqidno.1，其具体序列如下(下划线为克隆位点)：
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(2)pvx:pnd108-nib瞬时表达载体的构建
将pnd108空载体进行双酶切，并通过t4dna连接酶将空载体pnd108和步骤(1)中的加入克隆位点后的pvy-nib的cdna片段进行连接，构建pvx:pnd108-nib瞬时表达载体，即重组载体。
本发明中所用空载体为pnd108，由中国农业大学李大伟教授提供，载体大小约10.4kb，载体抗性为kan。
本发明利用烟草抗南方根结线虫基因与抗pvy-msnr基因紧密连锁的特征，且pvy-msnr复制酶(pvy-nib)是烟草叶片接种pvy-msnr病毒后在抗南方根结线虫品种上产生枯斑的诱导因子。通过人工合成pvy-msnr株系复制酶基因(pvy-nib)，构建pvx病毒瞬时表达载体，建立新的烟草抗根结线虫病品种基因鉴定技术体系。
实施例1
本发明pvx病毒瞬时表达载体的构建方法为：
1、人工合成病毒pvy-nib的cdna片段，分别在序列5’端加入克隆位点notl和3’端加入克隆位点sali。所得pvy-nib的cdna合成的片段为seqidno.1所示，其测序结果见表1：
表1pvy-nib基因合成测序结果
2、马铃薯pvx-pnd108表达载体的双酶切：
pvx-pnd108表达载体双酶切反应体系如下表2，双酶切的结果图如图1所示。从图1中可以看出，从左至右有lane1、lane2、lane3，lane1为合成载体、lane2为合成载体双酶切、lane3为1kbdnamarker。
表2双酶切反应体系
3、pvx-pnd108表达载体与pvy-nib的cdna片段的连接，其连接反应体系见表3：
表3连接反应体系
上述三个步骤中所得连接产物即是本发明用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的重组载体。
本发明的重组载体建立后需要通过转化和验证。其中，转化过程为：将以上连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，在37℃恒温箱中培养12～14h。
在上述感受态细胞中随机挑选5个左右白色单菌落接到lb液体培养基中(其加入100mg·ml-1kan+)，在37℃，180r/min的恒温摇床中震荡培养过夜，摇菌结束后，挑取1μl菌液作为模板进行pcr扩增，并通过蓝白斑鉴定筛选阳性克隆，并将筛选的扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶(含有0.5μg·ml-1溴化乙锭)上进行电泳检测，通过挑取有目的片段插入的样品进行质粒提取，用于农杆菌的转化。
其中，lb液体培养基的成分为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，用去离子水定容至1l，最后用5mol/l的naoh调ph值至7.0。
pvx:pnd108-nib瞬时表达载体的验证体系见表4。
表4pvx:pnd108-nib瞬时表达载体的验证体系
其中，pcr扩增过程为：以上体系配制完以后，充分混匀，按照下列程序进行pcr扩增：94℃预变性4min，94℃变性30s，退火温度(tm)(62℃)40s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min，置于pcr仪(eppendorf)上进行扩增，并进行电泳检测。
将构建的载体pvx:pnd108-nib质粒dna和空载体pnd108质粒dna分别转化农杆菌菌株。将制备农杆菌悬浮液用于接种烟草叶片，于接种后7～10天后观察症状的产生，并拍照记录。根据烟草叶片的症状判定是否有根结线虫的抗性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这上述实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110>河南农业大学
<120>一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的重组载体
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1592
<212>dna
<213>unknown
<400>1
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