一种溶血栓药物rPA新的生产方法与流程

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种溶血栓药物rpa新的生产方法

背景技术：

心血管疾病引发的血栓并发症严重威胁人类生命，是导致死亡和病残的主要疾病之一。由血栓造成的急性心肌梗塞(acutemyocardialinfarction，ami)的死亡率可高达30％，中国每年约350万人死于各类心血管病，占总死亡原因之首，平均每十秒钟就死一个患者。一半以上的人首次发作就是心肌梗死或者猝死，美国每年约有150万人发生心肌梗死。静脉溶栓治疗是ami治疗的最重要进展，是治疗急性心肌梗塞，减少死亡率的主要方法。

溶栓药物发展经历从非特异性溶栓药到特异性溶栓药，从静脉持续滴注药物到静脉注射药物。第一代溶栓药物以链激酶和尿激酶为代表，此类药物缺乏溶栓特异性，对全身纤溶系统的影响很大，导致出血并发症比率高，同时再通率低。人内源性组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeplasmniogenactviator，tpa)是纤溶酶原家族的一个多区域的丝氨酸蛋白酶。早在1980年，就已发现tpa可以引起纤维蛋白诱导的血栓裂解及可以作为治疗如ami等急性血栓的溶栓剂。第二代溶栓药物即以重组表达的tpa(阿替普酶，rt-pa)为代表，此类药物具有一定的溶栓特异性，但半衰期短，给药方式复杂，需要先一次静推，再两次静滴，而且需要根据体重调节剂量。

第三代溶栓药物rpa(reteplase)是组织型纤溶酶原激活剂(tpa)的区域缺失性突变体，由德国boehringermannheim公司开发，1996年fda批准上市，商品名retavase，是一个分子量为39.6kd的单链非糖基化多肤，为e.coli表达的非活性包涵体经体外复性加工而得到，此突变体含9对二硫键，复性难度很大，复性产率低(5％以下)，上述原因使得rpa价格不菲，在国内市场仍难以普及。因此，本领域技术人员致力于开发新的rpa制备方法，以降低rpa成本。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种溶血栓药物rpa新的生产方法。

在本发明的第一方面，提供了一种制备溶血栓药物rpa的方法，所述方法包括步骤：

a)利用酵母菌分泌表达rpa，筛选获得高表达菌株；

b)利用酵母菌分泌表达配体刺桐胰蛋白酶抑制剂(eti)，筛选获得高表达菌株；

c)利用eti作为配体与固定相偶联制备亲和层析介质；

d)利用步骤c)所得的亲和层析介质对步骤a)所得的rpa进行亲和层析，分离纯化所述rpa。

优选地，所述方法包括步骤：

(1)rpa高表达菌株的获得：

将rpa核苷酸序列，两端引入xhoi/noti限制性酶切位点，插入表达载体，转化酵母菌，筛选高表达菌株；

(2)eti高表达菌株的获得：

在eti核苷酸序列的c末端引入组氨酸标签(his-tag)，然后两端引入xhoi/noti限制性酶切位点，插入表达载体，转化酵母菌株，筛选高表达菌株；

(3)eti亲和层析介质的制备：

将上述eti高表达菌株发酵或摇瓶表达的eti经固化金属离子亲和层析(imac)纯化，然后和溴化氰活化的亲和层析介质混合，制作eti亲和层析柱；

(4)rpa纯化：

上述rpa高表达菌株发酵或摇瓶表达产物先经简单离心或过滤，上清液过eti亲和层析柱，冲洗后洗脱，收集洗脱液，即得所述rpa。

优选地，所述rpa核苷酸序列如seqidno.3所示。

优选地，所述eti核苷酸序列如seqidno.4所示。

优选地，所述亲和层析介质为sepharose4b。

优选地，所述固化金属离子亲和层析柱为镍柱。

优选地，所述rpa的氨基酸序列如seqidno.1所示。

优选地，所述刺桐胰蛋白酶抑制剂(eti)的氨基酸序列如seqidno.2所示。

优选地，所述酵母为毕赤酵母菌株；优选地，所述毕赤酵母菌株为gs115，smd1168等。

更优选地，所述酵母为毕赤酵母菌株gs115。

优选地，所述表达载体为毕赤酵母分泌表达载体；更优选地，所述毕赤酵母分泌表达载体为ppiczαa载体、ppiczαb、ppiczαc、或ppic9k。

最优选地，所述表达载体为ppiczαa载体。

优选地，步骤(3)中，将发酵获得的eti经过离心过滤或进一步超滤浓缩后过镍柱纯化，和溴化氰活化的sepharose4b混合制得eti-sepharose4b亲和层析介质。

优选地，步骤(3)中，将发酵获得的eti经过离心过滤或进一步超滤浓缩后过镍柱纯化，；取cnbractivatedsepharose4b，每克活化介质加入eti样品42mg，使eti蛋白的终浓度保持在5～10mg/ml，室温下搅拌1h，用5倍介质体积的偶联缓冲液冲洗掉没有偶联上的配基，用ph8.0的0.1mol/ltris-hcl封闭2h，用0.1mol/lph4.0醋酸钠缓冲液冲洗5个柱体积，改用ph8.00.1mol/ltris-hcl缓冲液冲洗5个柱体积，如此反复3次，即制得所述eti-sepharose4b亲和层析介质。

本发明的显著效果：用真核表达系统毕赤酵母高效分泌表达rpa，然后通过配体eti的亲和纯化一步就可达到90％-95％以上的纯度，得率高，工艺简单。完全绕过了现有工艺中大肠杆菌表达的包涵体变性复性过程，也没有去除原核表达中的内毒素问题，生产成本大幅降低。

附图说明

图1为rpa表达的sds-page电泳图谱。1是rpa标准品(大肠杆菌来源)，2、3、4分别是0、12、24小时不同时间的取样。m是蛋白质分子量标准。

图2为rpa经eti亲和纯化的sds-page电泳图谱。1是未纯化的rpa，2是亲和纯化后的rpa。

具体实施方式

本发明采用毕赤酵母(p.pastoris)表达系统分泌表达rpa，同时表达一配体蛋白刺桐胰蛋白酶抑制剂(eti)，eti是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，能够特异性结合胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂，可以作为配体与固定相偶联制备亲和层析介质，用于tpa(组织型纤溶酶原激活剂)及其突变体的纯化。毕赤酵母系统既可以高水平地分泌表达目的蛋白，又可以象大肠杆菌一样高密度发酵，非常适合基因工程药物大规模生产。表达的rpa以可溶性具活性地分泌到胞外，然后经配体蛋白的亲和纯化，工艺大大简化，得率会显著提升。相比现有的大肠杆菌50升发酵仅能获得80个剂量的rpa，生产成本至少降低10倍以上。

本发明提供了一种组织纤溶酶原激活剂突变体rpa新的生产方法，包括用于该方法的rpa高表达菌株，eti高表达菌株，以及亲和纯化方法。

在本发明优选地实施方式中，根据本发明的溶血栓药物rpa氨基酸序列如下：

seqidno.1(溶血栓药物rpa，全长355个氨基酸)：

syqgnsdcyfgngsayrgthsltesgasclpwnsmiligkvytaqnpsaqalglgkhnycrnpdgdakpwchvlknrrltweycdvpscstcglrqysqpqfrikgglfadiashpwqaaifakhrrspgerflcggilisscwilsaahcfqerfpphhltvilgrtyrvvpgeeeqkfevekyivhkefdddtydndiallqlksdssrcaqessvvrtvclppadlqlpdwtecelsgygkhealspfyserlkeahvrlypssrctsqhllnrtvtdnmlcagdtrsggpqanlhdacqgdsggplvclndgrmtlvgiiswglgcgqkdvpgvytkvtnyldwirdnmrp；

经过多重优化和大量筛选获得的rpa优化密码子序列如下：

tcataccagggtaacagtgattgctattttggtaatggatctgcctacagaggaacccattccttgacagagtcaggtgcaagttgtttgccatggaactcaatgatccttatcggaaaagtttacactgcccaaaatcctagtgcccaggcattgggtcttggaaagcataactactgcagaaatccagacggagatgctaaaccttggtgtcacgttttgaagaacagaagacttacatgggaatattgtgacgtcccatcttgttccacttgcggattgagacaatactcacaacctcagtttagaattaaaggtggattgttcgctgatatcgcctctcatccatggcaggctgccatttttgctaagcacagaagatcccctggagagagattcttgtgtggtggaattcttatctcttcctgctggattttgtccgcagctcattgttttcaagaaagattcccacctcatcacttgactgttatccttggaagaacctatagagttgtcccaggtgaagaggaacagaagttcgaggttgaaaagtacatcgtccacaaggagttcgatgacgatacttacgacaatgatatcgctttgcttcaattgaaatctgattcaagtagatgcgcccaggaatcttccgttgtcagaaccgtttgtttgccacctgctgacttgcaacttcctgattggacagagtgtgaattgtctggttatggaaaacatgaagcactttctccattctactccgagagattgaaggaagctcatgttagactttacccttcaagtagatgcacttcccagcacttgcttaacagaactgtcaccgacaatatgttgtgtgctggagataccagatcaggtggaccacaagcaaacttgcacgacgcttgccagggagatagtggtggacctttggtttgtcttaatgacggaagaatgactttggtcggtattatctcttggggtcttggatgtggtcaaaaagatgttccaggtgtctacacaaaggttactaactatttggactggatcagagataacatgagacct(seqidno.3)。

在本发明优选地实施方式中，根据本发明的刺桐胰蛋白酶抑制剂(eti)氨基酸序列如下：

seqidno.2(刺桐胰蛋白酶抑制剂(eti)，全长172个氨基酸)：

vlldgngevvqnggtyyllpqvwaqgggvqlaktgeetcpltvvqspnelsdgkpiriesrlrsafipdddkvrigfayapkcapspwwtvvedeqeglsvklsedestqfdypfkfeqvsdqlhsykllycegkhekcasiginrdqkgyrrlvvtedypltvvlkkdess

经过多重优化和大量筛选获得的eti优化密码子序列如下：

gttttgcttgacggaaacggagaggttgtccaaaatggtggaacctactatttgcttcctcaagtttgggcacagggtggaggtgtccaattggctaagactggagaagagacctgtccattgacagttgtccagagtcctaacgagctttctgacggtaaaccaattagaatcgaatcaagattgagaagtgcctttattcctgatgacgataaggttagaatcggattcgcttacgccccaaaatgcgctccatctccttggtggacagttgtcgaagatgagcaagaaggtttgtctgttaagctttccgaggacgaatcaactcagttcgattacccttttaagttcgaacaagtttccgaccagttgcattcatacaaattgctttattgtgagggtaaacacgaaaaatgcgcttctatcggaatcaatagagatcaaaagggttacagaagattggttgtcactgaggactatccattgaccgttgtccttaagaaagatgaatcttcc(seqidno.4)。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。需要说明的是，本发明并不限于本处用到的毕赤酵母菌株和载体，以及具体的纯化步骤。在下述实施例中所给出的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

(1)rpa及eti表达载体的构建

基于rpa以及eti的氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子偏好性，优化设计各自的核苷酸序列，两端均引入xhoi/noti限制性酶切位点。注意eti序列的羧基末端引入组氨酸标签(6个组氨酸)便于镍柱纯化。然后经过酶切消化，插入毕赤酵母载体ppiczαa的xhoi/noti位点，构建成各自的表达载体ppiczαa-rpa和ppiczαa-eti。

(2)电穿孔转化及高表达菌株的筛选

将上述构建好的重组载体ppiczαa-rpa和ppiczαa-eti各自大量制备，线性化，分别电穿孔转化毕赤酵母菌株gs115，涂布于含不同浓度的博来霉素zeocin平板上筛选高抗性克隆，小摇表达筛选高表达克隆，分别获得高表达菌株gs115/ppiczαa-rpa及gs115/ppiczαa-eti。在小摇试验中rpa表达可获得30-50mg/l以上的产量，上5l发酵罐高密度培养后可放大到150mg/l以上；在小摇试验中eti表达可获得50mg/l以上的产量，上5l发酵罐高密度培养后可放大到250mg/l以上。

(3)eti-sepharose4b亲和层析介质的制备

获得的高表达菌株gs115/ppiczαa-eti摇瓶或发酵罐发酵培养，发酵液经过离心过滤或进一步超滤浓缩后过镍柱纯化，洗脱下来的即纯化好的eti。按pharmacia公司说明书制备eti-sepharose4b亲和层析树脂，取cnbractivatedsepharose4b，每克活化介质加入eti样品42mg，使eti蛋白的终浓度保持在5～10mg/ml。室温下搅拌1h。用5倍介质体积的偶联缓冲液冲洗掉没有偶联上的配基，用ph8.00.1mol/ltris-hcl封闭2h。0.1mol/lph4.0醋酸钠缓冲液(内含0.5mol/lnacl)冲洗5个柱体积，改用ph8.00.1mol/ltris-hcl缓冲液(内含0.5mol/lnacl)冲洗5个柱体积，如此反复3次，备用。

(4)rpa的亲和纯化

获得的高表达菌株gs115/ppiczαa-rpa摇瓶或发酵罐发酵培养，发酵液经过离心过滤或进一步超滤浓缩后备用。根据上述方法制得的eti-sepharose4b亲和层析树脂，用平衡缓冲液平衡好，离心超滤后的r-pa调节ph，上样至平衡好的亲和层析柱。上样完毕用平衡缓冲液冲洗后，最后用20mmol/l柠檬酸盐，ph3.2进行洗脱，收集洗脱液，即是纯化好的rpa。

纯化好的rpa用sds-page测纯度，用纤维蛋白平板法进行活性测定，纯度要求达到90％-95％以上，活性接近或达到5×10⁵u/mg。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。