本发明属于生物蛋白分离技术领域，具体涉及一种从大鲵肝金属硫蛋白中脱除重金属的方法。
背景技术：
金属硫蛋白(mt)是一种重要、奇异、生理功能强的活性物质，被誉为生命的守护神之一；目前，国内外科技工作者均采用人工喂养的动物(多为大鲵)肝脏为原料来获得金属硫蛋白，而目前人工养殖动物时多采用饲料喂养的方式，饲料中含有重金属元素(pb2+、cu2+、cd2+等)，而这些重金属元素很容易被动物肝脏吸收，那么从动物肝脏提取出的金属硫蛋白中也一定含有这些对人体是有害而无利的重金属，因此，研究从金属硫蛋白中脱除重金属是研究人员正在攻克的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种从大鲵肝金属硫蛋白中脱除重金属的方法，解决了现有金属硫蛋白中重金属含量高，导致食品安全性低的问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种从大鲵肝金属硫蛋白中脱除重金属的方法，其特征在于，该方法通过以下步骤实现：
步骤1，取大鲵肝金属硫蛋白并向其中加入蒸馏水，搅拌均匀，获得金属硫蛋白液；
步骤2，向所述步骤1获得的金属硫蛋白液中加入酸性吸附剂溶液，搅拌均匀并静置，进行一次离心分离，获得一次分离后的金属硫蛋白液；
步骤3，用氢氧化钠溶液调节所述步骤2获得的一次分离后的金属硫蛋白液的ph值至6-10并静置，进行二次离心分离，获得二次分离后的金属硫蛋白液；
步骤4，采用琼脂糖和n-甲基氨基二乙酸层析柱对所述步骤3获得二次分离后的金属硫蛋白液层析，获得金属硫蛋白层析液；
步骤5，对所述步骤4获得的金属硫蛋白层析液进行真空冷冻干燥，获得除去重金属的金属硫蛋白。
优选地，所述步骤2中，所述酸性吸附剂溶液是用质量分数为0.5-1.5％的硝酸作溶剂配制而成的，所述溶质为吸附剂，所述吸附剂为壳聚糖、改性壳聚糖中的至少一种。
优选地，所述步骤2中，所述静置时间为20-30min，所述一次离心分离的时间为5-10min。
优选地，所述步骤3中，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.5-1.0mol/l。
优选地，所述步骤3中，所述静置时间为20-30min，所述二次离心分离的时间为10-20min。
优选地，所述步骤4的具体方法为：采用由70-80％琼脂糖和20-30％n-甲基氨基二乙酸混合物填充的层析柱对所述二次分离金属硫蛋白液进行层析，层析速度为15ml/min，收集吸收峰波长为272-282nm的层析液，获得金属硫蛋白层析液。
优选地，所述步骤1中，所述大鲵肝金属硫蛋白的提取方法为：
步骤1.1，采用添加诱导剂的饲料投喂大鲵进行诱导、宰杀，获得大鲵肝脏；
步骤1.2，采用缓冲液对所述步骤1.1获得的大鲵肝脏进行匀浆处理，再离心分离，获得金属硫蛋白提取液；
步骤1.3，采用葡聚糖和亚氨基二乙酸混合物的层析柱对所述步骤1.2获得的金属硫蛋白粗提液层析，获得金属硫蛋白层析液；
步骤1.4，将所述步骤1.3获得的金属硫蛋白层析液进行真空冷冻干燥，获得大鲵肝金属硫蛋白。
优选地，所述步骤1.1中，所述诱导的具体方法为：将诱导剂混合于饲料中，采用所述混有诱导剂的饲料连续投喂大鲵6-12天，每天投喂1-3次。
优选地，所述步骤1.1中，所述诱导剂为乙酸锌、硫酸锌和硫酸铜中的至少一种，所述诱导剂添加的剂量为两栖体重的20-120mg/kg。
优选地，所述步骤1.2的具体方法为：切取并粉碎大鲵肝脏，将缓冲液加入所述大鲵肝脏中，搅拌获得肝脏匀浆；将所述肝脏匀浆静置24h后在4℃下以8000r/min的转速离心分离12-24min，取上层清液为一次分离液；向所述一次分离液加入无水乙醇并混合均匀，将混合均匀的所述一次分离液在-20℃下静置24h后在4℃下以8000r/min的转速再次离心分离12-24min，取下层沉淀物为二次分离物；采用浓度为0.02mol/l的tris-hcl的洗脱液对所述二次分离物进行洗脱，获得金属硫蛋白提取液。
优选地，所述步骤1.2中，所述缓冲液的组分为tris-hcl的洗脱液，无水乙醇，氯仿的混合物。
与现有技术相比，本发明提出了大鲵肝金属硫蛋白中脱除重金属的方法，该方法通过采用壳聚糖或者改性壳聚糖溶液对金属硫蛋白中的重金属进行吸附(离子交换)，实现重金属的脱除，从而提高了金属硫蛋白的去除解毒能力，同时也提高了食用的安全性，并且能够在脱除重金属的前提下，降低对金属硫蛋白(mt)营养物质的影响；本发明方法，操作简单，方法简易，原料来源丰富，可大力推广使用。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种从大鲵肝金属硫蛋白中脱除重金属的方法的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种从大鲵肝金属硫蛋白中脱除重金属的方法，该方法通过以下步骤实现：
步骤1，取大鲵肝金属硫蛋白并向其中加入蒸馏水，搅拌均匀，获得第一金属硫蛋白液；
其中，大鲵肝金属硫蛋白的提取方法为：
步骤1.1，将诱导剂混合于饲料中，采用所述混有诱导剂的饲料连续投喂大鲵6-12天，每天投喂1-3次，宰杀，获得大鲵肝脏；诱导剂为乙酸锌、硫酸锌和硫酸铜中的至少一种，诱导剂添加的剂量为两栖体重的20-120mg/kg；
步骤1.2，采用缓冲液对所述步骤1.1获得的大鲵肝脏进行匀浆处理，再离心分离，获得金属硫蛋白提取液；缓冲液的组分为ph值为8.6的0.01mol/ltris-hcl的洗脱液800ml，无水乙醇1000ml，氯仿80ml；该步骤具体方法为：切取并粉碎大鲵肝脏，将缓冲液加入所述大鲵肝脏中，搅拌获得肝脏匀浆；将所述肝脏匀浆静置24h后在4℃下以8000r/min的转速离心分离12-24min，取上层清液为一次分离液；向所述一次分离液加入无水乙醇并混合均匀，将混合均匀的所述一次分离液在-20℃下静置24h后在4℃下以8000r/min的转速再次离心分离12-24min，取下层沉淀物为二次分离物；采用浓度为0.02mol/l的tris-hcl的洗脱液对所述二次分离物进行洗脱，获得金属硫蛋白提取液；
步骤1.3，采用葡聚糖和亚氨基二乙酸混合物的层析柱对所述步骤1.2获得的金属硫蛋白粗提液层析，获得金属硫蛋白层析液；
步骤1.4，将所述步骤1.3获得的金属硫蛋白层析液进行真空冷冻干燥，获得大鲵肝金属硫蛋白。
步骤2，向所述步骤1获得的第一金属硫蛋白液中加入改性壳聚糖溶液，搅拌均匀并静置20-30min，进行一次离心分离，获得一次分离金属硫蛋白液；其中，改性壳聚糖溶液是用质量分数为0.5-1.0％的盐酸作溶剂配制而成的；
步骤3，用浓度为0.5-1.0mol/l的氢氧化钠溶液调节所述步骤2获得的一次分离金属硫蛋白液的ph值至6-10并静置20-30min，进行二次离心分离，获得二次分离金属硫蛋白液；
步骤4，采用由70-80％琼脂糖和20-30％n-甲基氨基二乙酸混合物填充的层析柱对所述二次分离金属硫蛋白液进行层析，层析速度为15ml/min，收集吸收峰波长为272-282nm的层析液，获得金属硫蛋白层析液；
步骤5，对所述步骤4获得的金属硫蛋白层析液进行真空冷冻干燥，获得提纯后的金属硫蛋白。
与现有技术相比，本发明提出了大鲵肝金属硫蛋白中脱除重金属的方法，该方法通过采用壳聚糖或者改性壳聚糖溶液对金属硫蛋白中的重金属进行吸附(离子交换)，实现重金属的脱除，从而提高了金属硫蛋白的去除解毒能力，同时也提高了食用的安全性，并且能够在脱除重金属的前提下，降低对金属硫蛋白(mt)营养物质的影响；本发明方法，操作简单，方法简易，原料来源丰富，可大力推广使用。
实施例1
本发明实施例1提供一种从大鲵肝金属硫蛋白中脱除重金属的方法，该方法通过以下步骤实现：
步骤1，取大鲵肝金属硫蛋白并向其中加入蒸馏水，搅拌均匀，获得第一金属硫蛋白液；
其中，大鲵肝金属硫蛋白的提取方法具体为：步骤1)，将乙酸锌混合于饲料中，采用上述混有乙酸锌的饲料连续投喂大鲵10天，每天投喂3次，宰杀，获得大鲵肝脏；乙酸锌添加的剂量为两栖体重的60mg/kg；步骤2)，切取并粉碎大鲵肝脏，将缓冲液加入所述大鲵肝脏中，搅拌获得肝脏匀浆；将肝脏匀浆静置24h后在4℃下以8000r/min的转速离心分离20min，取上层清液为一次分离液；向上述一次分离液中加入无水乙醇并混合均匀，将混合均匀的上述一次分离液在-20℃下静置24h后在4℃下以8000r/min的转速再次离心分离20min，取下层沉淀物为二次分离物；采用浓度为0.02mol/l的tris-hcl的洗脱液对所述二次分离物进行洗脱，获得金属硫蛋白提取液；其中，缓冲液的组分为ph值为8.6的0.01mol/ltris-hcl的洗脱液800ml，无水乙醇1000ml，氯仿80ml；步骤3)，采用由65％葡聚糖和35％亚氨基二乙酸混合物填充的层析柱对所述离后的金属硫蛋白液进行层析，层析速度为10ml/min，收集吸收峰波长为272-282nm的层析液，获得金属硫蛋白层析液；步骤4)将所述步骤3)获得的金属硫蛋白层析液进行真空冷冻干燥，获得大鲵肝金属硫蛋白；
步骤2，向所述步骤1获得的第一金属硫蛋白液中加入改性壳聚糖溶液，搅拌均匀并静置20min，进行一次离心分离，获得一次分离金属硫蛋白液；其中，改性壳聚糖溶液是用质量分数为0.5％的盐酸作溶剂配制而成的；
步骤3，用浓度为0.5mol/l的氢氧化钠溶液调节所述步骤2获得的一次分离金属硫蛋白液的ph值至9并静置20min，进行二次离心分离，获得二次分离金属硫蛋白液；
步骤4，采用由80％琼脂糖和20％n-甲基氨基二乙酸混合物填充的层析柱对所述二次分离金属硫蛋白液进行层析，层析速度为15ml/min，收集吸收峰波长为272-282nm的层析液，获得金属硫蛋白层析液；
步骤5，对所述步骤4获得的金属硫蛋白层析液进行真空冷冻干燥，获得除去重金属的金属硫蛋白，经检测该金属硫蛋白中重金属的含量未超出国家标准。
实施例2
本发明实施例2提供一种从大鲵肝金属硫蛋白中脱除重金属的方法，该方法通过以下步骤实现：
步骤1，取大鲵肝金属硫蛋白并向其中加入蒸馏水，搅拌均匀，获得第一金属硫蛋白液；其中，大鲵肝金属硫蛋白的提取方法同实施例1中所述；
步骤2，向所述步骤1获得的第一金属硫蛋白液中加入改性壳聚糖溶液，搅拌均匀并静置20min，进行一次离心分离，获得一次分离金属硫蛋白液；其中，改性壳聚糖溶液是用质量分数为0.5％的盐酸作溶剂配制而成的；
步骤3，用浓度为0.5mol/l的氢氧化钠溶液调节所述步骤2获得的一次分离金属硫蛋白液的ph值至8并静置20min，进行二次离心分离，获得二次分离金属硫蛋白液；
步骤4，采用由80％琼脂糖和20％n-甲基氨基二乙酸混合物填充的层析柱对所述二次分离金属硫蛋白液进行层析，层析速度为15ml/min，收集吸收峰波长为272-282nm的层析液，获得金属硫蛋白层析液；
步骤5，对所述步骤4获得的金属硫蛋白层析液进行真空冷冻干燥，获得除去重金属的金属硫蛋白，经检测该金属硫蛋白中重金属的含量未超出国家标准。
实施例3
本发明实施例3提供一种从大鲵肝金属硫蛋白中脱除重金属的方法，该方法通过以下步骤实现：
步骤1，取大鲵肝金属硫蛋白并向其中加入蒸馏水，搅拌均匀，获得第一金属硫蛋白液；其中，大鲵肝金属硫蛋白的提取方法同实施例1中所述；
步骤2，向所述步骤1获得的第一金属硫蛋白液中加入改性壳聚糖溶液，搅拌均匀并静置20min，进行一次离心分离，获得一次分离金属硫蛋白液；其中，改性壳聚糖溶液是用质量分数为0.5％的盐酸作溶剂配制而成的；
步骤3，用浓度为0.5mol/l的氢氧化钠溶液调节所述步骤2获得的一次分离金属硫蛋白液的ph值至7并静置20min，进行二次离心分离，获得二次分离金属硫蛋白液；
步骤4，采用由80％琼脂糖和20％n-甲基氨基二乙酸混合物填充的层析柱对所述二次分离金属硫蛋白液进行层析，层析速度为15ml/min，收集吸收峰波长为272-282nm的层析液，获得金属硫蛋白层析液；
步骤5，对所述步骤4获得的金属硫蛋白层析液进行真空冷冻干燥，获得除去重金属的金属硫蛋白，经检测该金属硫蛋白中重金属的含量未超出国家标准。
实施例4
本发明实施例4提供一种从大鲵肝金属硫蛋白中脱除重金属的方法，该方法通过以下步骤实现：
步骤1，取大鲵肝金属硫蛋白并向其中加入蒸馏水，搅拌均匀，获得第一金属硫蛋白液；其中，大鲵肝金属硫蛋白的提取方法同实施例1中所述；
步骤2，向所述步骤1获得的第一金属硫蛋白液中加入改性壳聚糖溶液，搅拌均匀并静置25min，进行一次离心分离，获得一次分离金属硫蛋白液；其中，改性壳聚糖溶液是用质量分数为1.0％的盐酸作溶剂配制而成的；
步骤3，用浓度为1.0mol/l的氢氧化钠溶液调节所述步骤2获得的一次分离金属硫蛋白液的ph值至6并静置25min，进行二次离心分离，获得二次分离金属硫蛋白液；
步骤4，采用由75％琼脂糖和25％n-甲基氨基二乙酸混合物填充的层析柱对所述二次分离金属硫蛋白液进行层析，层析速度为15ml/min，收集吸收峰波长为272-282nm的层析液，获得金属硫蛋白层析液；
步骤5，对所述步骤4获得的金属硫蛋白层析液进行真空冷冻干燥，获得除去重金属的金属硫蛋白，经检测该金属硫蛋白中重金属的含量未超出国家标准。
实施例5
本发明实施例5提供一种从大鲵肝金属硫蛋白中脱除重金属的方法，该方法通过以下步骤实现：
步骤1，取大鲵肝金属硫蛋白并向其中加入蒸馏水，搅拌均匀，获得第一金属硫蛋白液；其中，大鲵肝金属硫蛋白的提取方法同实施例1中所述；
步骤2，向所述步骤1获得的第一金属硫蛋白液中加入改性壳聚糖溶液，搅拌均匀并静置25min，进行一次离心分离，获得一次分离金属硫蛋白液；其中，改性壳聚糖溶液是用质量分数为1.0％的盐酸作溶剂配制而成的；
步骤3，用浓度为1.0mol/l的氢氧化钠溶液调节所述步骤2获得的一次分离金属硫蛋白液的ph值至10并静置25min，进行二次离心分离，获得二次分离金属硫蛋白液；
步骤4，采用由75％琼脂糖和25％n-甲基氨基二乙酸混合物填充的层析柱对所述二次分离金属硫蛋白液进行层析，层析速度为15ml/min，收集吸收峰波长为272-282nm的层析液，获得金属硫蛋白层析液；
步骤5，对所述步骤4获得的金属硫蛋白层析液进行真空冷冻干燥，获得除去重金属的金属硫蛋白，经检测该金属硫蛋白中重金属的含量未超出国家标准。
实施例6
本发明实施例6提供一种从大鲵肝金属硫蛋白中脱除重金属的方法，该方法通过以下步骤实现：
步骤1，取大鲵肝金属硫蛋白并向其中加入蒸馏水，搅拌均匀，获得第一金属硫蛋白液；其中，大鲵肝金属硫蛋白的提取方法同实施例1中所述；
步骤2，向所述步骤1获得的第一金属硫蛋白液中加入改性壳聚糖溶液，搅拌均匀并静置30min，进行一次离心分离，获得一次分离金属硫蛋白液；其中，改性壳聚糖溶液是用质量分数为1.0％的盐酸作溶剂配制而成的；
步骤3，用浓度为1.0mol/l的氢氧化钠溶液调节所述步骤2获得的一次分离金属硫蛋白液的ph值至10并静置30min，进行二次离心分离，获得二次分离金属硫蛋白液；
步骤4，采用由70％琼脂糖和30％n-甲基氨基二乙酸混合物填充的层析柱对所述二次分离金属硫蛋白液进行层析，层析速度为15ml/min，收集吸收峰波长为272-282nm的层析液，获得金属硫蛋白层析液；
步骤5，对所述步骤4获得的金属硫蛋白层析液进行真空冷冻干燥，获得除去重金属的金属硫蛋白，经检测该金属硫蛋白中重金属的含量未超出国家标准。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。