本发明涉及化学成分的检测
技术领域：
，且特别涉及一种胃蛋白酶消化率的测定方法及其应用。
背景技术：
：近几年，关于消化率的测定方法受到广泛关注，主要的测定方法有消化液测定法、消化酶提取法、肠隔离法、指示剂法及同位素标记法等。其中，胃蛋白酶测定法因具有快速简便、稳定性好等优势，而在鱼粉及其他动物性蛋白质饲料中被广泛应用。目前，评价鱼粉质量的指标主要有感官、粗蛋白质、粗脂肪、水分、盐分、灰分及卫生指标等，但仅用这些指标很难全面评价鱼粉的真实质量，尤其是不能反映鱼粉中可被畜禽消化利用的蛋白质含量。而鱼粉胃蛋白酶消化率的测定是鱼粉中可被消化吸收蛋白质含量的真实反映，是评价鱼粉质量的重要指标。因此，鱼粉胃蛋白酶消化率的测定也越来越受到重视。本发明方法能够快速准确地测定鱼粉胃蛋白酶消化率，对鱼粉的采购和验收提供参考数据，同时对饲料品质安全具有重要意义。基于国家对鱼粉胃蛋白酶消化率测定尚未明确，目前大家对鱼粉胃蛋白酶消化率的测定方法稍有差异，故有必要推出一个准确简便测定鱼粉胃蛋白酶消化率的方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种胃蛋白酶消化率的测定方法，该测定方法操作高效便捷，所用试剂种类少、来源广，经该测定方法测定所得的结果重复性好、准确有效。本发明的另一目的在于提供一种上述胃蛋白酶消化率的测定方法在测定胃蛋白酶消化率中的应用，尤其是在测定鱼粉的胃蛋白酶消化率中的应用，用上述测定方法可实现待测样品的批量处理，提高效率，节约成本。本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：本发明提出一种胃蛋白酶消化率的测定方法，其包括以下步骤：取同一样品分为第一试样与第二试样，第一试样经脱脂后测定粗蛋白质含量，第二试样经脱脂、胃蛋白酶酶解、离心，洗涤后得到残渣，测定残渣中粗蛋白质含量。按以下公式计算即得胃蛋白酶消化率：消化率＝(第一试样粗蛋白质含量-第二试样残渣中粗蛋白质含量)/第一试样粗蛋白质含量×100％。上述粗蛋白质含量均以质量百分数计。本发明还提出上述胃蛋白酶消化率的测定方法在测定胃蛋白酶消化率中的应用，例如可以用来测定鱼粉的胃蛋白酶消化率。本发明实施例的胃蛋白酶消化率的测定方法及其应用的有益效果是：用离心代替国标中“呈45°角放置，让残渣沉淀15min以上”可缩短实验周期，提高实验效率。此外，通过离心操作能够克服现有技术中通过抽滤达到分离的方式耗时长且无法实现批量处理的问题，大大提高分离效果，节约时间。本发明实施例的胃蛋白酶消化率的测定方法操作高效便捷，所用试剂种类少、来源广，经该测定方法测定所得的结果重复性好、准确有效。将其用于测定胃蛋白酶消化率，尤其是测定鱼粉的胃蛋白酶消化率中，可实现待测样品的批量处理，提高效率，节约成本。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的胃蛋白酶消化率的测定方法及其应用进行具体说明。本发明实施例提供的胃蛋白酶消化率的测定方法，尤其适用于测定鱼粉胃蛋白酶的消化率，具体地，包括以下步骤：取同一样品分为第一试样与第二试样。其中，第一试样经脱脂后测定粗蛋白质含量，第二试样经脱脂、酶解、离心，洗涤后得到残渣，测定残渣中粗蛋白质含量。然后按以下公式计算即得胃蛋白酶消化率：消化率＝(第一试样粗蛋白质含量-第二试样残渣中粗蛋白质含量)/第一试样粗蛋白质含量×100％。上述粗蛋白质含量均以质量百分数计。作为可选地，上述样品在测定前，经粉碎处理。例如可将样品粉碎至0.6-1mm，或者过20目筛，以提高除脂和酶解效果。因鱼粉中粗脂肪含量在7-10％，若不经过脱脂处理，该部分粗脂肪易对胃蛋白酶消化率的测定结果产生影响。故在本发明实施例中，优选对第一试样及第二试样均进行脱脂处理。较佳地，本发明实施例中第一试样和第二试样的脱脂过程均是用脱脂剂进行淋洗。作为可选地，脱脂剂可以为石油醚或乙醚。优选为石油醚。具体地，可将第一试样或第二试样加入折成漏斗状的滤纸内，然后用脱脂剂进行淋洗脱脂。淋洗后风干，除去脱脂剂。风干可于通风橱内进行，以避免溶剂等散发于空气中。作为可选地，上述第二试样的称取量可以为0.7-1.1g，优选为0.9-1.0g，该称量范围内测定出的结果最为稳定，误差最小。每1g第一试样或第二试样所用的脱脂剂的体积为8-12ml，优选重复淋洗两次，共计淋洗三次，以降低脂肪的残余量。值得说明的是，本发明实施例中当采用石油醚为脱脂剂的情况下，当脱脂室温低于30℃时，优选采用沸点为30-60℃的石油醚；当脱脂室温高于30℃时，优选采用沸点为60-90℃的石油醚，以避免石油醚在脱脂过程中蒸发，影响除脂效果。承上，本发明实施例优选用不属于易制毒试剂种类的石油醚为脱脂剂，购买方便，且可根据室温高低对应选择沸点为30℃-60℃或60℃-90℃的石油醚。通过淋洗方式代替国标中的浸提方式，可达到高效便捷，节省时间成本以及脱脂效果显著的效果。第一试样在脱脂后，可取0.3000g±0.0002g按照《gb/t6432》中粗蛋白质含量的测定方法测定粗蛋白质含量。第二试样在脱脂后用胃蛋白酶对其进行酶解。酶解可以是在42-48℃的条件下用胃蛋白酶溶液处理脱脂后的上述第二试样，酶解时间优选为14-18h。较佳地，上述胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的浓度为18-22iu/ml，更佳地，胃蛋白酶在胃蛋白酶溶液中的浓度为20iu/ml。为了使酶解更加充分，酶解过程还可以是在转速为180-220r/min的条件下用胃蛋白酶溶液处理脱脂后的第二试样。作为可选地，第二试样与胃蛋白酶溶液的比例可以为150ml：0.9-1.0g。具体地，例如可以将脱脂风干后的第二试样连通滤纸漏斗放入250ml的具塞磨口瓶中，然后加入150ml新配置的并已预热至42-48℃的胃蛋白酶溶液，盖紧瓶盖并置于42-48℃的恒温摇床中，于转速为180-220r/min的条件下振荡保温酶解消化14-18h。值得说明的是，在酶解过程中，优选使第二试样完全被胃蛋白酶溶液浸湿，以确保酶解效果。其中，浓度为20iu/ml的胃蛋白酶溶液可以经以下方式配制而得：稀释6.1ml浓盐酸至1000ml水中，调节ph值为1-2，然后加热至42-48℃。加入6.67g活性为1：3000的生化级胃蛋白酶(临用前按《中华人民共和国兽药典》中规定方法测定胃蛋白酶活性)。进一步地，对脱脂后的第二试样进行离心操作。具体地，将经胃蛋白酶溶液消化后的第二样品取出，分装于50ml的离心管，然后于3800-4200r/min的转速下分离8-12min，优选于4000r/min的转速下分离10min，得到残渣。本发明实施例中用离心代替国标中“呈45°角放置，让残渣沉淀15min以上”可缩短实验周期，提高实验效率。此外，由于现有技术中通过抽滤达到分离的方式时间较长，且无法实现批量处理，因此通过上述离心操作，可大大提高效果，节约时间，实现样品批量处理。进一步地，用42-48℃的水洗涤上述残渣至洗涤后所得的滤液中粗蛋白质的含量稳定。具体地，可以在铺有快速滤纸的布氏漏斗上抽滤上述残渣，先用少量温水(42-48℃)将瓶盖上的残渣洗至滤纸上，再将离心后的上清液慢慢倾出。当上清液通过滤纸后，用装有温水(42-48℃)的塑料洗瓶反复清洗离心管及磨口瓶内未倾出的残渣，然后再用玻璃棒按住磨口瓶内的滤纸将附着在磨口瓶瓶壁上的残渣洗脱下来，反复清洗离心管及磨口瓶，直至将所有残渣均转移至铺有快速滤纸的布氏漏斗中。当全部液体通过布氏漏斗后，用温水(42-48℃)多次洗涤布氏漏斗内滤纸上的残渣，并尽可能的抽干水分。值得说明的是，本实施例中用温水(42-48℃)代替国标中的丙酮洗涤残渣，其一，温水较丙酮而言，安全且成本低；其二，能够避免丙酮在抽滤过程中由于挥发速度较快，达不到洗净残渣的效果，从而提高测定结果的准确度。洗涤结束后，对残渣洗涤结果进行自检，即将抽滤瓶中的滤液全部倒出，并将抽滤瓶洗涤干净，再用温水(42-48℃)洗涤残渣，收集滤液，并对滤液进行粗蛋白质含量测定。通过新增残渣洗涤结果自检的步骤，可确定粗蛋白质中的可溶性粗蛋白在经胃蛋白酶溶液酶解后是否洗脱干净，填补了国标中采用丙酮洗涤残渣并未对残渣是否洗净的缺陷。当滤液中粗蛋白含量不变(稳定)后，取所得的残渣进行粗蛋白质含量测定。上述粗蛋白含量不变是指前后两次测得的粗蛋白含量允许相对偏差不超过3％。具体地，例如可以从布氏漏斗上取下载有残渣的滤纸，无损地移入foss凯氏消化管中，加入约6.4g混合催化剂及20ml浓硫酸(每多加一张滤纸需多加约5ml浓硫酸进行消化)，然后置于foss消化炉上420℃消化至呈透明的蓝绿色(硫酸铜的颜色)，并按《gb/t6432》测定方法测定残渣中粗蛋白质含量。值得说明的是，本发明实施例中还设置有空白对照组，空白对照组除未加试样外，其余步骤与第二试样的处理步骤一致，测定所得值为空白测定值。第一试样粗蛋白质含量实际为第一试样粗蛋白质含量测定值减去空白测定值，第二试样残渣中粗蛋白质含量实际为第二试样残渣中粗蛋白质含量测定值减去空白测定值。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1取同一鱼粉样品分为第一试样和第二试样。用乙醚对第一试样和第二试样进行淋洗脱脂，共淋洗三次，每次均按每1g第一试样或第二试样用8ml乙醚淋洗。其中，第二试样的称取量为0.7g。称取0.2998g脱脂后的第一试样，按照《gb/t6432》中粗蛋白质含量的测定方法测定粗蛋白质含量，得到第一试样粗蛋白质含量。将脱脂后的第二试样于42℃的条件下，用胃蛋白酶溶液酶解18h。第二试样与胃蛋白酶溶液的比例为150ml：0.9g，胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的浓度为18iu/ml。将酶解后的第二试样于3800r/min的转速下分离12min，得残渣。用42℃的水洗涤上述残渣，并对残渣洗涤结果进行自检至洗涤后所得的滤液中粗蛋白质的含量稳定，然后用《gb/t6432》中的测定方法测定残渣中粗蛋白质含量。按照以下公式即得鱼粉的胃蛋白酶消化率：消化率＝(第一试样粗蛋白质含量-第二试样残渣中粗蛋白质含量)/第一试样粗蛋白质含量×100％。上述粗蛋白质含量均以质量百分数计。实施例2取同一鱼粉样品粉碎至0.6mm，然后分为第一试样和第二试样。用乙醚对第一试样和第二试样进行淋洗脱脂，共淋洗三次，每次均按每1g第一试样或第二试样用12ml乙醚淋洗。其中，第二试样的称取量为1.1g。称取0.3002g脱脂后的第一试样，按照《gb/t6432》中粗蛋白质含量的测定方法测定粗蛋白质含量，得到第一试样粗蛋白质含量。将脱脂后的第二试样于48℃、转速为180r/min的恒温摇床中，用胃蛋白酶溶液酶解14h。第二试样与胃蛋白酶溶液的比例为150ml：1g，胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的浓度为22iu/ml。将酶解后的第二试样于4200r/min的转速下分离8min，得残渣。用48℃的水洗涤上述残渣，并对残渣洗涤结果进行自检至洗涤后所得的滤液中粗蛋白质的含量稳定，然后用《gb/t6432》中的测定方法测定残渣中粗蛋白质含量。按照以下公式即得鱼粉的胃蛋白酶消化率：消化率＝(第一试样粗蛋白质含量-第二试样残渣中粗蛋白质含量)/第一试样粗蛋白质含量×100％。上述粗蛋白质含量均以质量百分数计。实施例3取同一鱼粉样品粉碎至1mm，然后分为第一试样和第二试样。用乙醚对第一试样和第二试样进行淋洗脱脂，共淋洗三次，每次均按每1g第一试样或第二试样用10ml石油醚淋洗。其中，第二试样的称取量为0.9g。称取0.3000g脱脂后的第一试样，按照《gb/t6432》中粗蛋白质含量的测定方法测定粗蛋白质含量，得到第一试样粗蛋白质含量。将脱脂后的第二试样于45℃、转速为220r/min的恒温摇床中，用胃蛋白酶溶液酶解16h。第二试样与胃蛋白酶溶液的比例为150ml：0.95g，胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的浓度为20iu/ml。将酶解后的第二试样于4000r/min的转速下分离10min，得残渣。用45℃的水洗涤上述残渣，并对残渣洗涤结果进行自检至洗涤后所得的滤液中粗蛋白质的含量稳定，然后用《gb/t6432》中的测定方法测定残渣中粗蛋白质含量。按照以下公式即得鱼粉的胃蛋白酶消化率：消化率＝(第一试样粗蛋白质含量-第二试样残渣中粗蛋白质含量)/第一试样粗蛋白质含量×100％。上述粗蛋白质含量均以质量百分数计。实施例4取同一鱼粉样品粉碎至0.8mm，然后分为第一试样和第二试样。用乙醚对第一试样和第二试样进行淋洗脱脂，共淋洗三次，每次均按每1g第一试样或第二试样用10ml石油醚淋洗。其中，第二试样的称取量为1.0g。称取0.3000g脱脂后的第一试样，按照《gb/t6432》中粗蛋白质含量的测定方法测定粗蛋白质含量，得到第一试样粗蛋白质含量。将脱脂后的第二试样于45℃、转速为200r/min的恒温摇床中，用胃蛋白酶溶液酶解16h。第二试样与胃蛋白酶溶液的比例为150ml：0.9g，胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的浓度为20iu/ml。将酶解后的第二试样于4000r/min的转速下分离10min，得残渣。用45℃的水洗涤上述残渣，并对残渣洗涤结果进行自检至洗涤后所得的滤液中粗蛋白质的含量稳定，然后用《gb/t6432》中的测定方法测定残渣中粗蛋白质含量。按照以下公式即得鱼粉的胃蛋白酶消化率：消化率＝(第一试样粗蛋白质含量-第二试样残渣中粗蛋白质含量)/第一试样粗蛋白质含量×100％。上述粗蛋白质含量均以质量百分数计。实施例5取同一鱼粉样品粉碎过20目筛，然后分为第一试样和第二试样。用乙醚对第一试样和第二试样进行淋洗脱脂，共淋洗三次，每次均按每1g第一试样或第二试样用10ml石油醚淋洗。其中，第二试样的称取量为0.95g。称取0.3000g脱脂后的第一试样，按照《gb/t6432》中粗蛋白质含量的测定方法测定粗蛋白质含量，得到第一试样粗蛋白质含量。将脱脂后的第二试样于45℃、转速为200r/min的恒温摇床中，用胃蛋白酶溶液酶解16h。第二试样与胃蛋白酶溶液的比例为150ml：0.9g，胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的浓度为20iu/ml。将酶解后的第二试样于4000r/min的转速下分离10min，得残渣。用45℃的水洗涤上述残渣，并对残渣洗涤结果进行自检至洗涤后所得的滤液中粗蛋白质的含量稳定，然后用《gb/t6432》中的测定方法测定残渣中粗蛋白质含量。按照以下公式即得鱼粉的胃蛋白酶消化率：消化率＝(第一试样粗蛋白质含量-第二试样残渣中粗蛋白质含量)/第一试样粗蛋白质含量×100％。上述粗蛋白质含量均以质量百分数计。试验例1取不同量的同一鱼粉样品分为1-5组，每组均分为第一试样和第二试样，每组中的第一试样的量相等，第二试样的量则分别对应表1中的序号1-5，每组设置2个平行。也即鱼粉第二试样的称样量分别为0.7g、0.8g、0.9g、1.0g和1.1g，且称量时第二试样的重量误差不超过0.01g。按照本发明实施例4的测定法方法测定上述1-5组鱼粉样品的胃蛋白酶消化率，其结果如表1所示。表1鱼粉样品的胃蛋白酶消化率由表1可以看出，在第二试样的称样量为0.7-1.1g范围时，同一鱼粉样品的胃蛋白酶消化率的测量结果均在96％左右，结果较为一致。但相比之下，第二试样的称样量为0.9-1.0g范围内时，鱼粉样品的胃蛋白酶效果率的测定结果最为稳定，也即两组平行样品之间测量结果差异最小。因此，本发明实施例中的鱼粉样品的第二试样的称样量最佳控制在0.9-1.0g。试验例2本试验例设有3组试验组，每组试验组的鱼粉样品的质量及重量均一致，每组试验组设置5个平行重复组。试验组1采用乙醚浸提的方式对鱼粉样品进行脱脂处理，试验组2采用乙醚淋洗的方式对鱼粉样品进行脱脂处理，试验组3采用石油醚淋洗的方式对鱼粉样品进行脱脂处理。分别测定经试验组1处理后的样品的粗脂肪含量(％)、经试验组2处理后的样品剩余粗脂肪含量(％)以及经试验组3处理后的样品剩余粗脂肪含量(％)。其结果如表2所示。表2粗脂肪含量由表2可以看出，与试验组1相比，采用试验组2及试验组3的淋洗方式能有效地除去鱼粉样品中的粗脂肪，经处理后其剩余粗脂肪含量均能达到测定胃蛋白酶消化率对样品粗脂肪含量的要求，且能省去浸提方式的繁琐，同时节约时间成本，提高试验效率。此外，对比试验组2和试验组3可以看出，同一鱼粉样品经石油醚淋洗脱脂后样品剩余脂肪含量与经乙醚淋洗脱脂后样品剩余脂肪含量基本保持一致，说明本发明实施例中将石油醚替代国标中的乙醚有效可行。且石油醚较乙醚使用更加安全，并能根据不同的脱脂条件选择不同沸点的石油醚产品。试验例3本试验例设有2组试验组，每组试验组的鱼粉样品的质量及重量均一致。其中，试验组1为实施例4中的鱼粉胃蛋白酶消化率的测定方法，试验组2与实施例4的唯一区别在于试验组2中用国标中的“呈45°角放置，让残渣沉淀15min以上”代替实施例4中的离心步骤(4000r/min的转速下分离10min)。每组试验组设置5个平行重复组。分别测定两组试验组鱼粉胃蛋白酶消化率(％)。其结果如表3所示。表3鱼粉胃蛋白酶消化率由表3可以看出，试验组1与试验组2所得的鱼粉胃蛋白酶消化率结果基本保持一定，说明本发明实施例中将离心操作替代国标中的“呈45°角放置，让残渣沉淀15min以上”有效可行。并且，较试验组2而言，采用试验组1中的离心操作还能缩短试验周期，提高试验效率。试验例4本试验例设有2组试验组，试验组1和试验组2的鱼粉样品的质量及重量均一致。其中，试验组1为实施例4中的鱼粉胃蛋白酶消化率的测定方法，试验组2与实施例4的唯一区别在于试验组2中用国标中的“丙酮”代替实施例4中的温水(45℃)对残渣进行洗涤。每组试验组设置5个平行重复组，分别测定两组试验组鱼粉胃蛋白酶消化率(％)，其结果如表4所示。表4胃蛋白酶消化率及粗蛋白质含量由表4可以看出，试验组2中用丙酮洗涤残渣后滤液中粗蛋白质含量较高，因此胃蛋白酶消化率较低，其原因可能由于丙酮的挥发速度较快，使得残渣未能被洗涤干净，造成残渣粗蛋白质含量偏高，导致最终结果偏低。试验组1中用温水洗涤残渣后滤液中粗蛋白质含量较试验组2中的更低，也即胃蛋白酶消化率更高，说明本发明实施例中用温水代替国标中的“丙酮”洗涤残渣以及新增对残渣进行自检的操作能够提高测定结果的准确性。试验例5本试验例设有2组试验组，试验组1和试验组2的鱼粉样品的质量及重量均一致。其中，试验组1为实施例4中的鱼粉胃蛋白酶消化率(％)的测定方法，试验组2与实施例4的唯一区别在于试验组2中用国标《gb/t17811-2008》进行胃蛋白酶消化率(％)的测定。每组试验组设置5个平行重复组。其结果如表5所示。表5胃蛋白酶消化率序号试验组1试验组2194.5294.05294.0893.86396.6896.42496.0395.57595.1494.66由表5可以看出，本发明实施例对鱼粉胃蛋白酶消化率的测定方法与国标《gb/t17811-2008》测定方法结果差异在允许范围内(无显著性差异)，说明本发明实施例提供的胃蛋白酶消化率的测定方法有效可行。综上所述，本发明实施例的胃蛋白酶消化率的测定方法操作高效便捷，所用试剂种类少、来源广，经该测定方法测定所得的结果重复性好、准确有效。将其用于测定胃蛋白酶消化率，尤其是测定鱼粉的胃蛋白酶消化率中，可实现待测样品的批量处理，提高效率，节约成本。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页12