一种释放硫化氢的可注射水凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及生物医用材料领域，更具体地说涉及一种可释放硫化氢的，海藻酸盐基可注射水凝胶的制备，是利用部分氧化海藻酸钠上的醛基与明胶上的氨基反应生成schiff碱的方法制备可释放硫化氢的水凝胶。
背景技术：
：海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，其分子由β-d-甘露糖醛酸(β-d-mannuronic，m)和α-l-古洛糖醛酸(α-l-guluronic，g)按(1→4)键连接而成。海藻酸钠含有大量的—coo－，在水溶液中可表现出聚阴离子行为，具有一定的黏附性，可用作治疗黏膜组织的药物载体。在酸性条件下，—coo－转变成—cooh，电离度降低，海藻酸钠的亲水性降低，分子链收缩，ph值增加时，—cooh基团不断地解离，海藻酸钠的亲水性增加，分子链伸展。因此，海藻酸钠具有明显的ph敏感性。海藻酸钠可以在极其温和的条件下快速形成凝胶，当有ca2+、sr2+等阳离子存在时，g单元上的na+与二价阳离子发生离子交换反应，g单元堆积形成交联网络结构，从而形成水凝胶。海藻酸钠形成凝胶的条件温和，这可以避免敏感性药物、蛋白质、细胞和酶等活性物质的失活。硫化氢是一种带有强烈臭鸡蛋气味的无色有毒的气体。但近年来的研究表明，它也是一种新型的气体信号分子和细胞保护剂。是继一氧化氮(no)，一氧化碳(co)之后的第三种气体介质。h2s参与调节包括心血管，神经元，胃肠道，肾脏，肝脏和生殖系统在内的各种生理系统的体内平衡。细胞内h2s的调节水平对疾病生物学具有巨大的影响。因此，控制生成和耗散的方法是重要的。研究人员试图用硫化氢供体在生物体内释放硫化氢，常用的硫化氢供体有硫氢化钠等，但这些小分子硫化氢供体只能在短时间内快速的释放硫化氢，且过程不可控。因此迫切的需要能够缓慢且在较长时间内产生硫化氢的供体。本发明中涉及的2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺能够在巯基的刺激下，缓慢可控的产生硫化氢气体。技术实现要素：本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种释放硫化氢的可注射水凝胶及其制备方法，利用氨基与醛基生成schiff碱的反应，将能够在巯基刺激下产生硫化氢的2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺接枝到部分氧化海藻酸钠上，制得可释放硫化氢的海藻酸盐基可注射水凝胶。本发明的目的通过下述技术方案予以实现。一种释放硫化氢的可注射水凝胶，将海藻酸钠(alg)上的羟基氧化成醛基，得到部分氧化海藻酸钠(ada)，利用醛基与2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(apta)上的氨基反应，将2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺接枝到部分氧化的海藻酸钠上，得到带有醛基的可释放硫化氢的大分子交联剂部分氧化海藻酸钠-2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(ada-apta)，将ada-apta与明胶共混后，得到释放硫化氢的可注射水凝胶；其中，部分氧化海藻酸钠(ada)与2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(apta)的质量比为(8-12)：(1-2)，ada-ta与明胶的质量比为(1-2)：5。部分氧化海藻酸钠(ada)与2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(apta)的质量比为10：1。ada-apta与明胶的质量比为1：5。一种释放硫化氢的可注射水凝胶的制备方法，按照下述步骤进行：步骤1，将海藻酸钠加入无水乙醇中，搅拌至分散均匀，将高碘酸钠加入去离子水中，避光搅拌至完全溶解，将高碘酸钠溶液倒入海藻酸钠的悬浮液中，室温20-25℃下反应2-4h后，向上述反应体系中加入4-6ml乙二醇终止反应10-20min后，将反应液倒入透析袋，用去离子水透析2-4天后，将透析完成的产物进行冻干，得到白色泡沫状的部分氧化海藻酸钠(ada)；氧化海藻酸钠的合成原理如下：步骤2，将步骤1制备得到的部分氧化海藻酸钠(ada)溶于去离子水中，并向其中加入分散剂搅拌至分散均匀，将2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(apta)置于分散剂中搅拌至分散均匀后，将2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(apta)分散液逐滴加入ada分散液中，滴加速率为3-5滴/min，在无氧条件下，40-60℃反应3-6h后，抽滤，将滤液倒入无水乙醇中置于冰箱8-12h后，离心、烘干后，得到浅黄色的部分氧化海藻酸钠-2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(ada-apta)，ada-apta化学式如下：步骤3，将部分氧化海藻酸钠-2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(ada-apta)配制成2-5wt％的水溶液，将明胶配制成4-8wt％的水溶液，按照质量比为(1-2):5进行共混，涡旋使得反应液混合均匀，得到释放硫化氢的可注射水凝胶。在步骤1中，海藻酸钠和高碘酸钠的质量比为(2-4)：(1-2)，优选2:1。在步骤1中，将高碘酸钠溶液倒入海藻酸钠的悬浮液中，室温20-25℃下反应4h后，向上述反应体系中加入5ml乙二醇终止反应15min。在步骤1中，离子水透析中，离子水的更换频率为6-8h/次。在步骤2中，部分氧化海藻酸钠(ada)与2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(apta)的质量比为(8-12)：(1-2)，优选10:1。在步骤2中，分散剂采用二甲基亚砜(dmso)或者n,n-二甲基甲酰胺(dmf)；使用惰性保护气体为反应体系提供无氧条件，如氮气、氦气或者氩气。在步骤3中，ada-apta与明胶的质量比为1:5，室温20℃-25℃下、ph＝7时，成胶时间为10-15min；37℃-40℃下，ph＝8时，成胶时间为2-5min。检验2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺对巯基的响应性：将10mgapta溶解在1ml无水乙醇中，加入2ml去离子水稀释至3ml配成反应液。将反应液在37℃水浴中持续加热，用醋酸铅试纸检测硫化氢的释放状况，加入半胱氨酸，继续观察醋酸铅试纸的颜色变化。图1为apta的13c-nmr谱图，从谱图中可以看出，188ppm处为硫代酰胺基团上碳原子的吸收峰，109ppm，139ppm，126ppm，151ppm，162ppm分别为吡啶环上碳原子的吸收峰，其中188ppm处的酰胺峰十分明显，由核磁碳谱可基本判断apta的结构特征。图2为部分氧化海藻酸钠(ada)，2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(apta)，部分氧化海藻酸钠-2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(ada-apta)的紫外光谱对比图，从谱图中可以看出，ada没有吸收峰，而接枝2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺的ada-apta有和apta同样的吸收峰，由此可以判断，ta接枝成功。将部分氧化海藻酸钠-2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(ada-apta)配制成2-5wt％的水溶液，将明胶配制成4-8wt％的水溶液，按照质量比为1:5进行共混，得到释放硫化氢的可注射水凝胶。该释放硫化氢型可注射凝胶因接枝2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(apta)而表现为浅黄色，不透明状。性状软而弹，具有粘性和微弱的流动性。值得注意的是，由于该凝胶机械性能较弱，成胶之后仍具有微弱的流动性，不仅可以以溶液形式进行注射，成胶之后仍可注射，因此，该凝胶在临床应用中，对于成胶时间没有严苛的要求，可以根据需要，在成胶之前或之后进行注射，这也是针对现有可注射凝胶对于成胶时间严格要求进行的一种有利的改进。本发明的有益效果为：凝胶制备方法简单，反应条件温和，生物相容性好，且可以通过控制2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺的接枝率来调节凝胶释放硫化氢的量。附图说明图1为apta的13c-nmr谱图；图2为部分氧化海藻酸钠(ada)，2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(apta)，部分氧化海藻酸钠-2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(ada-apta)的紫外光谱对比图；图3为3wt％ada-apta水溶液与凝胶的对比图。具体实施方式下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。实施例中所使用的药品如下表所示：药品厂家海藻酸钠天津市元立化工有限公司高碘酸钠凯玛特(天津)化工科技有限公司2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺天津市光复精细化工研究所明胶天津苏斯泰来生物技术有限公司二甲基亚砜天津市光复精细化工研究所n,n-二甲基甲酰胺萨恩化学技术(上海)有限公司液氮天津市贞好科技有限公司丙酮天津市元立化工有限公司实施例中所使用的仪器如下表所示：实施例1以氧化度为50％，2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺投料比为10％为例，说明可释放硫化氢海藻酸盐基可注射水凝胶的制备。称取5.0g海藻酸钠加入到25ml无水乙醇中，搅拌至分散均匀。称取2.67g高碘酸钠，加入到25ml去离子水中，避光搅拌至完全溶解(高碘酸钠容易遇光分解，因此需要避光搅拌，且反应要在避光条件下反应)。将高碘酸钠倒入海藻酸钠的悬浮液中，室温下反应4h。4h后加入5ml乙二醇终止反应15min。将反应液倒入透析袋，用去离子水透析三天，每天更换透析用水，每天约换水3-4次。将透析完成的产物进行冻干，得到白色泡沫状产物。将0.5gada溶解到5ml去离子水中搅拌至分散均匀。5mg2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺溶解在5ml无水乙醇中，充分溶解后，加入5ml去离子水稀释至10ml，加入ada溶液中，通氮气除去体系中的氧气，50℃反应4h。反应结束后，抽滤取滤液，将滤液倒入60ml无水乙醇中，放入冰箱过夜，第二天离心取下层固体，烘干得到浅黄色产物ada-apta。将ada-apta配制成3wt％的水溶液，将明胶配制成5wt％的水溶液，按照体积比1:1共混，搅拌得到凝胶。实施例2以海藻酸钠氧化度为50％，2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺投料比为20％为例，说明可释放硫化氢海藻酸盐基可注射水凝胶的制备。称取5.0g海藻酸钠加入到25ml无水乙醇中，搅拌至分散均匀。称取2.67g高碘酸钠，加入到25ml去离子水中，避光搅拌至完全溶解(高碘酸钠容易遇光分解，因此需要避光搅拌，且反应要在避光条件下反应)。将高碘酸钠倒入海藻酸钠的悬浮液中，室温下反应4h。4h后加入5ml乙二醇终止反应15min。将反应液倒入透析袋，用去离子水透析三天，每天更换透析用水，每天约换水3-4次。将透析完成的产物进行冻干，得到白色泡沫状产物。将0.5gada溶解到5ml去离子水中搅拌至分散均匀。10mg2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺溶解在5ml无水乙醇中，充分溶解后，加入5ml去离子水稀释至10ml，加入ada溶液中，通氮气除去体系中的氧气，50℃反应4h。反应结束后，抽滤取滤液，将滤液倒入60ml无水乙醇中，放入冰箱过夜，第二天离心取下层固体，烘干得到浅黄色产物ada-apta。将ada-apta配制成3wt％的水溶液，将明胶配制成5wt％的水溶液，按照体积比1:1共混，搅拌得到凝胶。在海藻酸钠氧化度不变的情况下改变2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺的投料比会改变接枝率，一般的，接枝率越高凝胶释放硫化氢的量越多，释放速率越快，但由于2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺本身具有一定刚性，接枝率达到一定值时，由于空间位阻作用，接枝率无法继续提高，本文中选用2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺的投料比为20％，得到的接枝率约为10％，接枝效率为50％，实际应用中，可根据需要的硫化氢的浓度，对2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺的接枝率进行调整，从而达到要求的硫化氢的释放量。一般生物体内用于治疗的外源性硫化氢的浓度为μm数量级，但由于生物体内硫化氢的释放效率较低，且硫化氢的半衰期只有几十秒钟到几分钟，因此水凝胶中2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺的浓度一般要达到nm数量级。调节成胶温度和ph值，可对成胶时间进行调节。本文中室温(20℃-25℃)、ph＝7时，成胶时间为10-15min。37℃-40℃，ph＝8时，成胶时间为2-5min。实际应用中可根据需要进行调节。将部分氧化海藻酸钠-2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(ada-apta)配制成2-5wt％的水溶液，将明胶配制成4-8wt％的水溶液，按照质量比为1:5进行共混，得到释放硫化氢的可注射水凝胶。该释放硫化氢型可注射凝胶因接枝2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(apta)而表现为浅黄色，不透明状。性状软而弹，具有粘性和微弱的流动性。值得注意的是，由于该凝胶机械性能较弱，成胶之后仍具有微弱的流动性，不仅可以以溶液形式进行注射，成胶之后仍可注射，因此，该凝胶在临床应用中，对于成胶时间没有严苛的要求，可以根据需要，在成胶之前或之后进行注射，这也是针对现有可注射凝胶对于成胶时间严格要求进行的一种有利的改进。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。当前第1页12