CsPR3基因及其在黄瓜抗枯萎病中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学、生物信息学、基因工程技术领域，具体地说，涉及cspr3基因及其在黄瓜抗枯萎病中的应用。

背景技术：

黄瓜(cucumissativusl.)是葫芦科(cucurbitaceae)黄瓜属(cucumis)一年蔓生的草本植物。黄瓜具有产量高、效益好等特点，是世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一，占全国蔬菜面积的10％左右。同时，黄瓜也特别容易遭受病害的侵染，其中黄瓜枯萎病(fusariumwilt)是系统性侵染的土传病害。黄瓜枯萎病，生产上又称之为死秧病、蔓割病、萎蔫病，在我国各地均有发生。黄瓜枯萎病的病原菌是尖孢镰刀菌黄瓜专化型(fusariumoxysporumf.sp.cucumerinumowen)，有4个生理小种，生理小种4号是我国普遍流行的黄瓜枯萎病致病菌。病原菌从根部伤口到根毛生长点侵染植株，进而破坏黄瓜根、茎和叶的维管束，使黄瓜植株吸收和运输水分功能丧失，最终造成黄瓜植株枯萎死亡。枯萎病一般可造成黄瓜产量下降10％-30％，严重时可达80％-90％甚至绝产，是黄瓜病害中最为严重、造成经济损失最大的病害之一。由于黄瓜生产面积的逐年扩大由此带来的连作重茬导致黄瓜枯萎病日益加重。生产上采用化学防治对抗枯萎病效果不理想，不仅使生产投入增加且会造成环境的污染，主要靠采用的嫁接栽培措施能有效防治。但容易降低黄瓜品质，选育抗黄瓜枯萎病品种是有效控制黄瓜枯萎病最安全、最经济的途径。因此，鉴定和筛选抗枯萎病的基因，将有利于高效改良黄瓜的枯萎病抗性，为黄瓜抗病分子育种提供技术支撑。

克隆基因是寻找与目标性状连锁的分子标记最重要的应用之一，与经典的图位克隆相比，混合分析(bsa，bulkedsergeantanalysis)结合rna-seq是一种快速高效定位基因的新方法，克服了基因组一段区域内分子标记较少的瓶颈，根据rna-seq的表达谱数据，同时分析差异表达基因所参与的代谢调控途径(liuetal.,2012)。分析群体中选择具有相对性状的单株混成2个bulk池，对2个池分别混合提取rna进行测序，测序完成后可以获得大量的snp，这些snp可以作为分子标记检测突变池与正常池中的基因型频率。在突变池中，当逼近候选基因位点时，来自于野生型的snp基因型频率会越来越低；反之，在正常池中，当逼近候选基因位点时，来自野生型的snp基因频率就会越来越高。通过检测snp与目的基因的连锁程度，来确定与目标性状连锁的目标基因所在的染色体区域。这种方法在基因定位中具有良好的应用前景。目前利用这种方法已经分离了大量的重要基因，尤其是鲇鱼的抗病基因和小麦的的yr15基因(wangetal.,2013；ricardoetal.,2014)。这种方法对已有基因组的物种特别适用，可以利用两亲本与参考基因组中存在差异的snp，结合遗传分离群体及自然群体分析，可迅速找到与目标性状基因连锁的基因，大大缩短了传统方法获得基因的时间。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有特定启动子序列的cspr3基因。

本发明的另一目的是提供所述cspr3基因在黄瓜抗枯萎病中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供一个全新的与应答枯萎病菌侵染相关的关键基因cspr3，该基因通过bsr-seq方法获得。所述cspr3基因编码蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示，所述cspr3基因的启动子的核苷酸序列为：

i)seqidno:3所示的核苷酸序列；或

ii)seqidno:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与seqidno:3所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

本发明还提供表达盒、表达载体或克隆载体，其包含cspr3基因所示序列的核酸。

本发明还提供含有所述cspr3基因、表达盒或载体的工程菌、转基因细胞系。

本发明还提供所述cspr3基因在植物抗枯萎病中的应用。

本发明所述植物包括但不限于黄瓜。所述植物枯萎病的致病菌为生理小种4号。

本发明还提供一种提高植物抗枯萎病的方法，通过在植物中过表达黄瓜cspr3基因，从而提高植物对枯萎病的抗性；其中，所述黄瓜cspr3基因编码的蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示。

本发明提供的另一种提高植物抗枯萎病的方法，使植物含有或表达cspr3基因，从而提高植物对枯萎病的抗性。

本发明进一步提供黄瓜cspr3基因的启动子，所述启动子克隆自黄瓜抗枯萎病品种3461。所述启动子的核苷酸序列为：

i)seqidno:3所示的核苷酸序列；或

ii)seqidno:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与seqidno:3所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

本发明提供的基因定位方法如下：

1、抗黄瓜枯萎病材料3461和感黄瓜枯萎病材料3229及分离群体中子代极端植株rna混池的构建：

基因定位研究所涉及的rna混池总共为四个，包括两个亲本混池和两个子代极端植株构建的混池。根据苗期抗病性鉴定的结果，从f2分离群体中挑选30株极抗病和30株极感病植株，分别提取总rna，构建子代极端植株rna混池。

2.、rna混池转录组学测序及生物信息分析：

针对rna混池，建立测序文库并上机测序。对所获得的数据进行评估分析、转录组变异分析和群体分组分析。经bsa关联分析，结合等位基因频率的差异推断变异与目的基因的关联程度，只有一个区域内所有的变异都达到显著关联水平(p值<10^-10)，且这些变异的等位基因频率差异大于0.8、可重复性大于0.9，该区域才被认为是目的基因所在区域(图1-图4)。

3、黄瓜cspr3基因来源：

依据基因结构设计引物：5'-atgttaatcacatcaaggaaaaat-3'和5'-ctagaaagacctttgattgtagc-3'，用pcr的方法从黄瓜(cumcumissativusl.)中克隆得到该基因全长，得到的该基因命名为cspr3。

4、黄瓜cspr3基因的核苷酸序列：黄瓜中cspr3基因的序列号为csa6g507520(http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp)，其开放阅读框(orf)序列如seqidno:1所示，由963个碱基组成，atg为起始密码子，tag为终止密码子。其编码的蛋白由320个氨基酸残基组成(seqidno:2)。

图5为基因cspr3cds编码区pcr扩增图。

图6为cspr3的蛋白跨膜区分析图。黄瓜cspr3蛋白具有一个信号肽和一个特殊的跨膜结构域；其中，1-22个氨基酸为信号肽，221-236位置的氨基酸为跨膜结构域。

5、黄瓜cspr3在根中优势表达且受黄瓜枯萎病生理小种4的诱导：

依据基因的序列设计实时荧光定量引物，5'-tattgtaaaaatggttgtcaaagc-3'和5'-cctcctgtagtctcgtgagaagtt-3'，在黄瓜各个组织中进行表达分析。同时，利用黄瓜枯萎病生理小种4对上述抗性材料和易感病材料进行接种后不同时间点该基因的表达检测。得到上述基因在组织部位与菌种侵染的表达分析结果(图7-图8)。

6、黄瓜cspr3在不同抗性材料中氨基酸序列没有发生变化，启动子区域结合hd-zipiii转录因子位点发生碱基突变：在atg上游2000bp作为启动子扩增区域，设计引物进行三段式扩增。引物如下：

5'-atgcatacatgttcaatcaacca-3'和5'-tcaaatgcccatcgtttgtg-3'

5'-tcttttgtaatcttgttgcggt-3'和5'-atgattacgaagctagtgtgaaa-3'以及

5'-caaggcggccgaattaaata-3'和5'-gtgattaacatcgaagatgggg-3'

比较两者在不同材料中的变化，结果在启动子核心元件上碱基发生变化，可能导致表达模式的不同(图9)。cspr3启动子区域在3461和3229中的序列所示。

本发明中利用在线工具protparma(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质的理化性质；利用tmpred程序(http://www.ch.embnet.org/software/tmpred_form.html)进行氨基酸跨膜区预测；利用targetp1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/targetp/)预测cspr3基因的亚细胞定位。

与现有黄瓜抗病基因的挖掘或者定位相比，本发明提供了一种基于bsr-seq方法筛选一种全新的抗枯萎病相关基因cspr3的克隆及表达分析。利用bsa结合rna转录组测序的方法，锁定了位于6号染色体上与目标性状连锁的候选区域。利用黄瓜基因库信息，克隆得到黄瓜cspr3，该基因全长1401bp，其中开放阅读框序列为963bp，该序列编码320个氨基酸，cspr3蛋白分子量约为34.82kd，pi为8.40，生物信息学预测该蛋白定位在液泡膜上。氨基酸n段1-22个氨基酸是信号肽序列，221-236位置氨基酸是一个跨膜域。荧光定量rt-pcr分析表明，cspr3基因在根部强优势表达，且表达受枯萎病菌的诱导。黄瓜枯萎病生理小种4菌株侵染csrp3表达显著不同的黄瓜品系，cspr3表达量高的品系(3461)具有较高的抗枯萎病能力(黄瓜品系3461基因cspr3的启动子序列见seqidno:3)，相反，cspr3表达量低的品系(3229)较易感染枯萎病(黄瓜品系3229基因cspr3的启动子序列见seqidno:4)。对抗枯萎病能力不同的品系克隆cspr3，基因编码蛋白没有发生改变。基因cspr3的启动子区与hd-zipiii类型转录因子(cshb15)的结合位点处发生突变。

本发明提供的抗枯萎病基因具有重要的应用价值，cspr3基因将将在黄瓜抗病改良中发挥重要作用。基因cspr3的克隆及表达分析为挖掘新的抗枯萎病提供了重要的基因资源。通过分子遗传育种的手段将其进行导入黄瓜植株内，将针对性的抵抗国内枯萎病生理小种4的侵染，减少由此病引发的黄瓜产量的损失。提高了广大种植者的经济效益。同时利用传统育种手段，在不改变黄瓜品质的前提下，利用高表达cspr3的株系可培育出高抗枯萎病的品种，保证了农户的生产，具有可观的经济效益和良好的社会效益。此外，该基因的克隆及表达分析对黄瓜抗枯萎病基因资源的筛选提供了有力的技术支持。

附图说明

图1是本发明黄瓜抗枯萎病基因筛选构建的4个混池测序的质量分布图。其中，a为抗病亲本混池测序质量统计，横坐标表示测序read位置，纵坐标表示质量值。统计每个循环得到的测序数据的质量分布，上面横线线表示平均值。b为感病亲本混池测序质量统计，横坐标表示测序read位置，纵坐标表示质量值。统计每个循环得到的测序数据的质量分布，上面横线线表示平均值。c为抗病群体混池测序质量统计，横坐标表示测序read位置，纵坐标表示质量值。统计每个循环得到的测序数据的质量分布，上面横线线表示平均值。d为感病群体混池测序质量统计，横坐标表示测序read位置，纵坐标表示质量值。统计每个循环得到的测序数据的质量分布，上面横线线表示平均值。

图2是本发明基因筛选文库所挖掘的高质量变异测序深度统计图。

图3是本发明snp在黄瓜7条染色体上发生变异的密度分布图。其中，横坐标表示染色体位置，纵坐标表示变异密度(snp#/100kb，3号染色体为snp#/1000kb)。

图4是本发明黄瓜抗枯萎病候选区域的关联分析图。

图5是本发明基因cspr3cds编码区pcr扩增图。

图6是本发明cspr3的蛋白跨膜区分析图。

图7是本发明cspr3基因在黄瓜各个组织中的表达分析图。

图8是本发明cspr3表达不同品系经黄瓜枯萎病生理小种4侵染后的表型图。其中，a表示经黄瓜枯萎病生理小重4侵染不同时间之后cspr3基因在跟根本的表达水平。b表示经黄瓜枯萎病生理小重4侵染不同时间之后发病状况在感病品系3461和抗病品系3229中的表型。

图9是本发明cspr3启动子区在不同品系之间的碱基变化。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

黄瓜品系3461参见theinfectionofcucumber(cucumissativusl.)rootsbymeloidogyneincognitaalterstheexpressionofactin-depolymerizingfactor(adf)genes,particularlyinassociationwithgiantcellformation.binliu等，frontiersinplantscience.doi:10.3389/fpls.2016.01393。黄瓜品系3229为河北地方品种，又名白叶三，参见nacl胁迫对不同品种白皮黄瓜种子发芽特性的影响。赵晓玲，张占军，陇东学院学报201425(5)。

实施例1黄瓜抗枯萎病基因cspr3的筛选

1、材料

以黄瓜高代自交系3461、3229(由中国农业大学黄瓜遗传育种课题组提供)以及两者为基础构建f2分离群体，其中3461为抗黄瓜枯萎病材料，3229为感黄瓜枯萎病材料。试验接种用枯萎病原菌为生理小种4号(由中国农业大学植保系提供)。将试验所用黄瓜种子进行消毒，置于28℃培养箱种进行催芽，然后进行72穴盘育苗。置于中国农业大学人工气候室，进行正常培养。

2、制备黄瓜枯萎病生理小种4的孢子悬浮液及黄瓜枯萎病病原菌的接种

采用灭菌的接种针挑取保存在pda培养基斜面上的黄瓜枯萎病病菌，将其转移至新的pda培养基的中央位置，置于28℃的培养箱中进行培养繁殖，培养3天左右，用接种针挑取菌落边缘的病菌，将其转移至新的pda培养基的中央位置，重复上述培养方式，直至致病菌恢复活力。将活化后的致病菌进行正常pda培养基培养，采用灭菌的打孔器对菌落边缘进行打孔，并将其转移至armstrong液体培养液中，于28℃条件下振荡培养5-7天，振荡器保持150转/分。振荡培养过后，培养液进行双层纱布过滤，滤液在5000转/分条件下离心15分钟，弃上清液，将剩下的孢子用无菌水进行稀释得到孢子悬浮液。采用血球计数板测量包子悬浮液的浓度，使其浓度控制在10⁶孢子/ml。采用浸根接种法对黄瓜幼苗进行枯萎病病原菌的接种。待黄瓜幼苗长至一片真叶时，将幼苗从穴盘中轻轻连根拔起，用水将幼苗根部洗净，将幼苗根部进入孢子悬浮液中，接种时间为10分钟，接种后的幼苗定植于含有灭菌基质的营养钵中。

3、黄瓜苗期枯萎病抗病性鉴定

接种处理后的幼苗在中国农业大学蔬菜系人工气候室中正常培养，白天温度控制在28℃，夜间温度控制在20℃。接种15天后进行病情调查，以后每隔7天调查一次，病情分级参照以下标准：0级，无症状；1级，子叶黄化不萎蔫；2级，子叶萎蔫或植株轻度矮化；3级，植株明显萎蔫或植株矮化；4级，植株枯死(0-2级定为抗病植株，3-4级为感病植株)。

4、亲本及分离群体中子代极端植株rna混池构建

基因定位研究所涉及的rna混池总共为四个，包括两个亲本混池和两个子代极端植株组建的混池。根据苗期抗病性鉴定结果，从f2分离群体中挑选30株极抗病植株和30株极感病植株，分别提取总rna，构建子代极端植株rna混池。

1)总rna的提取

采用柱式植物rnaout试剂盒(购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品目录号为71203)提取黄瓜果实的总rna，并用dnase去除rna样品中残留的dna。步骤如下：

①在研钵中加入约200mg黄瓜果实，加入液氮研磨至粉末状。将研磨物转移至干净无rna酶的1.5ml塑料离心管，加入1ml细胞裂解液(试剂盒自带)，充分振荡混匀。

②在离心管中加入300μl的去蛋白液(试剂盒自带)和200μl自备氯仿，在振荡器上振荡30秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。室温12000rpm离心3-5min，两相间将有约5-10毫米厚的细胞破碎物。

③将上清液(约600μl)转移到另一干净的1.5ml塑料离心管中，下层有机相和中间层含有dna、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。最好留下100μl上清液不取。加入等体积的漂洗液，充分颠倒混匀。将一半的溶液转移到离心吸附柱中，12000rpm室温离心1min，弃穿透液。

④将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中，12000rpm室温离心1min，弃穿透液。

⑤加700μl通用洗柱液，12000rpm室温离心1min，弃穿透液。加300μl通用洗柱液，12000rpm室温离心1min，弃穿透液。12000rpm室温离心1min。此步十分重要，否则残留的乙醇会影响rna的使用。往吸附柱的中央加入50μldnaase反应液，室温静置10-15min，加入500μl通用洗柱液，12000rpm室温离心1min，弃穿透液。12000rpm室温离心1min。

⑥将离心吸附柱转移到rnase-free收集管中，加入50μlrna洗脱液，室温放置1-2min。12000rpm室温离心1min，离心管中溶液即为rna样品，存放于-80℃待构建测序文库用。

5、rna混池转录组深度测序及对目标基因的关联分析

针对rna混池，建立测序文库并上机测序。简要流程如下，首先，通过带有oligo(dt)的磁珠富集混池中的mrna(若为原核生物，则用试剂盒去除rrna后进入下一步)；加入fragmentationbuffer将mrna打断成短片段，以mrna为模版，用randomhexamers(六碱基随机引物)合成第一条cdna链；然后，加入缓冲液、dntps、rnaseh和dnapolymerasei合成第二条cdna链；再经过qiaquickpcr试剂盒纯化并加eb缓冲液洗脱之后做末端修复、3’端加入polya并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行pcr扩增，建好的文库用illuminahiseqtm2000进行测序。bsr-seq技术生物信息学分析主要包括，测序数据评估分析、转录组学变异分析和分离群体分组分析(bulkedsegregationanalysis，bsa)。评估分析测序得到各混池reads数据，通过去除测序接头、去除低质量碱基、去除空载体等不可信数据，得到高质量测序数据。运用gapped和splicingaware比对软件，将测序得到的数据比对到黄瓜参考基因组上，经过变异信息挖掘，得到snp和indel分子标记。评估分析所得分子标记质量，筛选得到亲本间的多态性分子标记。

进行bsa分析，初步获得与枯萎病抗性连锁的分子标记。第一，挖掘出可能的变异位点。合并所有测序数据以增加低表达量基因的测序深度，将其比对到参考基因组上，挖掘出可能的变异位点。第二，计算变异位点不同基因型的表达深度。对可能的变异位点，计算其在四个测序样本中的四种碱基的表达深度，去除低质量不可信的测序数据，利用fpkm对深度进行标准化以便进行比较。第三，过滤可能存在错误的变异。对于在一个样本中表达量少于6的变异一律去除，对于出现两种以上基因型的变异一律去除。第四，挖掘亲本间的可信变异。只利用亲本的数据，筛选出亲本中是纯合子，但亲本间基因型不一致的变异位点，以此去除低质量碱基和比对出错以及表型鉴定出错所带来的影响。第五，等位基因频率计算。只对亲本间可信变异位点在混池中计算等位基因频率以及等位基因频率的差值，理论上差值越大的变异与目的基因越近。第六，关联分析。利用等位基因的表达深度，通过fisher精确检验判断两种表达模式是否显著差别，得到p-value，结合等位基因频率的差异推断变异与目的基因的关联程度。第七，候选区域筛选。只有一个区域内所有的变异都达到显著关联水平(p值<10^-10)，且这些变异的等位基因频率差异大于0.8，可重复性大于0.9，该区域才被认为是目的基因所在区域。

bsa分析的整体情况如附图4所示，直观可以看出chr6和chr2上游显著关联的区域，但经过上述多个步骤的严格筛选，chr2区域被排除，确定chr6:26077967-26079100区域为候选区域，且这个区域刚好位于一个基因上，该基因为csa6g507520。该基因编码一个几丁质酶，可能在抗叶枯病基因中具有重要作用。

实施例2黄瓜cspr3基因的克隆

利用黄瓜3461和3229及f2子代极端表型进行混池并进行转录组测序，经bsa分析，确定chr6:26077967-26079100区域为候选区域，且这个区域刚好位于一个基因上，该基因为csa6g507520。根据基因的注释该基因暂命名为cspr3，根据cspr3的基因id在黄瓜基因组数据库(http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp)中找到该基因的cds序列，根据其cds全长序列设计引物：

forward：5'-atgttaatcacatcaaggaaaaat-3'

reverse：5'-ctagaaagacctttgattgtagc-3'

分别以3461和3229的黄瓜第三片真叶(从下至上)的cdna作模板，在目的基因的orf区两端设计引物进行pcr扩增。

pcr扩增程序：

将pcr产物进行凝胶回收酶切产物，然后用t4连接酶连接，转化大肠杆菌dh5α，pcr鉴定后的阳性菌液送华大公司测序。

实施例3cspr3在黄瓜各组织部位的表达分析检测

1、荧光定量pcr检测

对所有黄瓜植株取雌花芽、雄花芽、叶、茎、卷须基部、卷须、受精的子房、未受精子房以及根部进行rna提取及cdna第一条链的合成与实施例1中相同。

2、荧光定量分析所用试剂盒为sybrpremixextaq(takara，drr041s)，仪器为abi7500，引物如下：

cspr3f:5'-tattgtaaaaatggttgtcaaagc-3'

cspr3r:5'-cctcctgtagtctcgtgagaagtt-3'

荧光定量的反应体系为：

扩增程序为：95℃,30sec；(95℃,5sec；60℃,40sec),40个循环。以tuα基因为内参，利用2^-△△ct算法计算各基因表达量变化。

结果如图7所示，cspr3在根部表达强烈，暗示该基因可能与根部侵染抵抗能力有关。

实施例4黄瓜枯萎病生理小种4号诱导cspr3表达分析检测及功能验证

将活化后的致病菌进行正常pda培养基培养，采用灭菌的打孔器对菌落边缘进行打孔，并将其转移至armstrong液体培养液中，于28℃条件下振荡培养5-7天，振荡器保持150转/分。振荡培养过后，培养液进行双层纱布过滤，滤液在5000转/分条件下离心15分钟，弃上清液，将剩下的孢子用无菌水进行稀释得到孢子悬浮液。采用血球计数板测量包子悬浮液的浓度，使其浓度控制在10⁶孢子/ml。

利用上述释希的浓度对黄瓜3461和3229进行2真叶展开期接种，分别在侵染后6hrs、12hrs、1day、3days、5days、7days和9days。各部位rna提取及cdna第一条链的合成与实施例1中相同。荧光定量pcr检测与实施例3中相同。荧光定量结果表明cspr3应答黄瓜枯萎病病原菌的诱导，且在抗性株系中表达量高，暗示抗性的强弱可能与抗性相关(图8a)。黄瓜枯萎病生理小种4号侵染3461和3229后，易感品系3229在侵染5天后(5dpi)开始出现叶片发黄、失水萎蔫等症状。与此同时，抗性品种3461出现叶片稍微的发黄。7dpi时，3229几乎呈现全株发病状态，而3461叶片开始发黄；9dpi时，3229茎部已经萎蔫，叶片接近干枯，3461仅一片真叶坏死，尤其茎部几乎没有伤害(图8b)。说明，cspr3的表达强度与枯萎病抗性有关，暗示该基因在对抗枯萎病过程中起重要作用。

实施例5cspr3启动子在3461和3299品种的克隆与分析

根据atg前2000bp，作为cspr3的启动子区域，分别以3461和3229dna的提取采用ctab经典方法。植株的叶片dna作为模板进行pcr扩增。在2000bp区两端设计引物进行pcr扩增。

扩增cspr3启动子引物序列如下：

forward5'-atgcatacatgttcaatcaacca-3'和

reverse：5'-tcaaatgcccatcgtttgtg-3'；

forward5'-tcttttgtaatcttgttgcggt-3'和

reverse：5'-atgattacgaagctagtgtgaaa-3'；

forward5'-caaggcggccgaattaaata-3'和

reverse：5'-gtgattaacatcgaagatgggg-3'

pcr反应体系(50μl):5×primestarbuffer10μl,上、下游引物各1μl,模板dna1μl,dna聚合酶(2.5u/μl)0.5μl,灭菌水32.5μl。

pcr扩增程序：

结果如图9所示，黄瓜抗枯萎病品系3461基因cspr3的启动子序列见seqidno:3，黄瓜感枯萎病品系3229基因cspr3的启动子序列见seqidno:4，启动子区域一些重要结合位点如hd-zipiii发生碱基突变显著变化。

本发明根据bsr-seq方法鉴定的一个与目标性状高度相关的区域，且这个区域只有唯一的cspr3基因，该基因编码一个几丁质酶，可能在抗叶枯病基因中具有重要作用。基因cspr3的表达模式暗示，cspr3在根系中强烈表达，说明该基因可能对抗有土传病害引起的疾病起重要的作用。黄瓜枯萎病病菌生理小种4号侵染试验表明，cspr3能够迅速应答病原菌增加表达。cspr3表达差异明显的品质经黄瓜枯萎病病原菌侵染后，9天后发病轻重与cspr3的表达情况直接相关。田间试验选取了6个不同与3461和3229的黄瓜品系，验证了cspr3的表达量的高低与抗病程度成正相关。一致率达100％。因此，cspr3可以作为一个新的抗黄瓜枯萎病候选基因。可利用cspr3基因进行黄瓜抗枯萎病的筛选以及抗病分子机制的调控研究。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>cspr3基因及其在黄瓜抗枯萎病中的应用

<130>khp171116899.3

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>963

<212>dna

<213>黄瓜(cucumissativus)

<400>1

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