一种制备高纯度棉皮素‑8‑O‑葡萄糖醛酸苷的方法与流程

本发明涉及一种从金花葵提取液出发，利用金属锌离子与黄酮类物质络合原理，获得高纯度棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷的方法。属于金属络合物制备，天然化合物提取和分离领域。

背景技术：

金花葵(hibiscusmanihotl.)别名菜芙蓉、野芙蓉、黏干或山榆皮，为一年生草本锦葵科(malvaceae)秋葵属植物，是一种生长在深山崖隙间的野生濒危稀有花卉。金花葵始载于明朝宪宗成化年间《顺德府志》，但因国内现代文献资料均无从查找，直至2003年在河北邢台地区被再次发现，其在200多个秋葵植物中最具食用、药用、营养以及美容瘦身等保健功能(中国药物评价，2015，32，90-92)。已有专利报道金花葵可进一步加工成高级保健品、化妆品和药品。目前在各版《中华人民共和国药典》及卫生部药品部颁标准中未见收载，但一些药理研究证明其具有良好的镇痛抗炎、抗氧化、降血脂、免疫调节、抑制肿瘤细胞等作用(精细化工，2016，33，890-895.)，具有较高的药用价值和广阔的发展前景。

金花葵有“植物大熊猫”的美誉，含有多种植物生物活性物质，主要有黄酮类化合物、维生素e、不饱和脂肪酸、膳食纤维和微量元素等等。这些营养物质是人体必需但又不能自行合成，必需靠饮食摄入，近年，金花葵花作为提取黄酮类物质的重要来源受到各方关注。研究表明，棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷为金花葵花中含量最高的黄酮类化合物，是金花葵花的主要活性成分之一(journalofchromatographicscience，2009，47，206-210)，其作为一种典型的含有6个羟基的黄酮醇类化合物，具有良好的抗炎活性和神经细胞保护作用(computationalbiologyandchemistry，2016，64，353-358)。临床可作为一种用于抗老年痴呆、肿瘤疾病及心血管等疾病的潜在药物(neuroscienceletters2009，461，172–176)。棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷结构式如下式ⅰ所示：

目前黄酮的分离纯化方法主要有溶剂萃取法、膜分离法、大孔树脂法、柱色谱法等方法(中国测试技术，2007，33，22-25)，但是这些方法存在纯化方法繁琐、成本过高、生产周期长、难以工业生产等问题，限制了金花葵黄酮的应用。我们利用黄酮类化合物与金属盐可形成稳定络合物的特性，开发了一种快速、安全、可行、有效地分离纯化棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷的方法。此类络合物有利于人体对相应金属盐的体内运送和吸收，同时，也可以帮助摄入黄酮类化合物，是一种具有巨大开发潜力的药物，值得进一步对其进行仔细研究与开发利用。因此，利用金花葵作为棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷的提取原料，直接提高了金花葵的综合利用价值和经济效益，使得金花葵在药品、食品或保健品等行业中具有较好的应用前景。目前从金花葵中制备高纯度的棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷尚未见报道。

本发明从金花葵提取液出发，利用金花葵中黄酮类化合物与锌盐形成稳定络合物的特性，把棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷从金花葵提取液中分离出来。络合物沉淀分离出来后，通过加入比黄酮类化合物络合效果更强的络合剂edta，将络合态的黄酮转化为纯度高的游离态黄酮，获得高纯度的棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷。

技术实现要素：

本发明的目的是利用黄酮类化合物与金属锌盐可形成稳定络合物的特性，开发一种快速、安全、可行的从金花葵中有效分离纯化棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷的方法。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：

一种从金花葵提取液出发，利用锌盐与黄酮类物质络合原理，获得高纯度棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷的方法，其步骤如下：

a.精密称取5.0g干燥金花葵花粗粉末，在功率为400w，温度80℃的条件下，微波提取15min，冷却至室温后抽滤，得到金花葵残渣和上清液，收集上清液，用70％的乙醇溶液定容到250ml容量瓶中即得样品溶液；

b.称取金花葵样品溶液，用碱性溶液调节ph值为8.5-11.5，所用碱性溶液可选择一定浓度氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、氨水等。加入一定质量浓度锌盐，所用锌盐可选择硫酸锌、乙酸锌、氯化锌等，添加量保证金花葵样品与锌盐的质量比为1/0.5-1/5。添加后，络合反应时间为1-12h。络合反应温度为10-70℃，离心分离络合反应生成的沉淀；

c.在上述的沉淀加入一定质量的解离剂乙二胺四乙酸(edta)和10％-70％的乙醇溶液进行解络合反应，优选为50％的乙醇溶液，添加量保证锌盐与edta的质量比为1/1-1/5，优选为1/1。添加后，超声0.5-4h，优选为0.5h。离心分离解络合反应后生成的沉淀，收集上清液，浓缩，得到高纯度棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷。

对金花葵的提取液和制备的高纯度棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷经高效液相色谱分析得到分析结果，色谱图见附图。采用的色谱条件为：watershplc高效液相色谱仪，色谱柱为cosmosilc18(4.6mm×200mm，5μm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸溶液梯度洗脱(0min，15:85v/v；18min，16:84v/v；26min，20:80v/v；35min，40:60v/v；40min，40:60v/v)，流速为1.0ml/min，检测波长为360nm，进样量10μl，柱温为室温。

本发明取得了如下有益成果：

1、对金花葵提取液不需要做进一步处理，直接加入锌盐溶液，通过调节ph使锌盐与提取液中棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷络合，简化了处理步骤，节约操作时间、减少人力和能源的消耗等，提高了制备效率和经济效益；

2、采用硫酸锌等锌盐的成本低，无毒无害，危险程度降低，也便于提取溶剂的回收；

3、通过加入比黄酮类化合物络合效果更强的络合剂edta，将络合态的黄酮转化为纯度高的游离态黄酮，大幅度提高有机溶液中棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷的浓度。通过前述组合操作，便于纯化棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷的大规模工业生产。

附图说明

图1是未经纯化的金花葵提取液中棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷的hplc谱图。

图2是经过络合物处理纯化的样品中棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷的hplc谱图。

具体实施方式：

下面结合附图和具体的实施例对本发明的一种从金花葵中提取黄酮类物质，制备高纯度棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷的方法进一步说明，以便本领域的技术人员更加了解本发明，但是并不以此限制本发明。

实施例1：

a.精密称取5.0g干燥金花葵花粗粉末，在功率为400w，温度80℃的条件下，微波提取15min，冷却至室温后抽滤，得到金花葵残渣和上清液，收集上清液，用70％的乙醇溶液定容到250ml容量瓶中即得样品溶液；

b.量取10ml金花葵样品溶液，用氢氧化钠溶液调节ph值为9.5，加入一定质量浓度硫酸锌，添加量保证金花葵样品与硫酸锌的质量比为1/0.5。添加后，络合反应时间为3h，络合反应温度为30℃，离心分离络合反应后生成沉淀；

c.在上述的沉淀加入一定质量的解离剂乙二胺四乙酸(edta)和50％的乙醇溶液进行解络合反应，添加量保证硫酸锌与edta的质量比为1/1。添加后，超声0.5h，离心分离解络合反应后生成的沉淀，收集上清液，浓缩，得到高纯度棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷，纯度达82.16％。

实施例2：

a.精密称取5.0g干燥金花葵花粗粉末，在功率为400w，温度80℃的条件下，微波提取15min，冷却至室温后抽滤，得到金花葵残渣和上清液，收集上清液，用70％的乙醇溶液定容到250ml容量瓶中即得样品溶液；

b.量取10ml金花葵样品溶液，用碳酸钠溶液调节ph值为11.5，加入一定质量浓度氯化锌，添加量保证金花葵样品与氯化锌的质量比为1/0.5。添加后，络合反应时间为12h。络合反应温度为70℃，离心分离络合反应后生成沉淀；

c.在上述的沉淀加入一定质量的解离剂乙二胺四乙酸(edta)和30％的乙醇溶液进行解络合反应，添加量保证氯化锌与edta的质量比为1/5。添加后，超声4h，离心分离解络合反应后生成的沉淀，收集上清液，浓缩，得到高纯度棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷，纯度达73.79％。

实施例3：

a.精密称取5.0g干燥金花葵花粗粉末，在功率为400w，温度80℃的条件下，微波提取15min，冷却至室温后抽滤，得到金花葵残渣和上清液，收集上清液，用70％的乙醇溶液定容到250ml容量瓶中即得样品溶液；

b.量取10ml金花葵样品溶液，用氢氧化钾溶液调节ph值为11.5，加入一定质量浓度乙酸锌，添加量保证金花葵样品与乙酸锌的质量比为1/5。添加后，络合反应时间为1h。络合反应温度为10℃，离心分离络合反应后生成沉淀；

c.在上述的沉淀加入一定质量的解离剂乙二胺四乙酸(edta)和10％的乙醇溶液进行解络合反应，添加量保证乙酸锌与edta的质量比为1/5。添加后，超声1h，离心分离解络合反应后生成的沉淀，收集上清液，浓缩，得到高纯度棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷，纯度达71.43％。

实施例4：

a.精密称取5.0g干燥金花葵花粗粉末，在功率为400w，温度80℃的条件下，微波提取15min，冷却至室温后抽滤，得到金花葵残渣和上清液，收集上清液，用70％的乙醇溶液定容到250ml容量瓶中即得样品溶液；

b.量取10ml金花葵样品溶液，用氨水调节ph值为9.5，加入一定质量浓度硫酸锌，添加量保证金花葵样品与硫酸锌的质量比为1/0.5。添加后，络合反应时间为5h。络合反应温度为50℃，离心分离络合反应后生成沉淀；

c.在上述的沉淀加入一定质量的解离剂乙二胺四乙酸(edta)和70％的乙醇溶液进行解络合反应，添加量保证硫酸锌与edta的质量比为1/1。添加后，超声4h，离心分离解络合反应后生成的沉淀，收集上清液，浓缩，得到高纯度棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷，纯度达75.72％。

实施例5：

a.精密称取5.0g干燥金花葵花粗粉末，在功率为400w，温度80℃的条件下，微波提取15min，冷却至室温后抽滤，得到金花葵残渣和上清液，收集上清液，用70％的乙醇溶液定容到250ml容量瓶中即得样品溶液；

b.量取10ml金花葵样品溶液，用氢氧化钠调节ph值为10.5，加入一定质量浓度硫酸锌，添加量保证金花葵样品与硫酸锌的质量比为1/1。添加后，络合反应时间为5h。络合反应温度为50℃，离心分离络合反应后生成沉淀；

c.在上述的沉淀加入一定质量的解离剂乙二胺四乙酸(edta)和50％的乙醇溶液进行解络合反应，添加量保证硫酸锌与edta的质量比为1/1。添加后，超声1h，离心分离解络合反应后生成的沉淀，收集上清液，浓缩，得到高纯度棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷，纯度达77.54％。

实施例6：

a.精密称取5.0g干燥金花葵花粗粉末，在功率为400w，温度80℃的条件下，微波提取15min，冷却至室温后抽滤，得到金花葵残渣和上清液，收集上清液，用70％的乙醇溶液定容到250ml容量瓶中即得样品溶液；

b.量取10ml金花葵样品溶液，用氢氧化钠调节ph值为8.5，加入一定质量浓度硫酸锌，添加量保证金花葵样品与硫酸锌的质量比为1/2。添加后，络合反应时间为7h。络合反应温度为50℃，离心分离络合反应后生成沉淀；

c.在上述的沉淀加入一定质量的解离剂乙二胺四乙酸(edta)和50％的乙醇溶液进行解络合反应，添加量保证硫酸锌与edta的质量比为1/2。添加后，超声1h，离心分离解络合反应后生成的沉淀，收集上清液，浓缩，得到高纯度棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷，纯度达65.49％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。