技术领域：
本发明属于生物细胞培养技术领域，具体涉及一种海马原代细胞培养体系的建立方法。
背景技术：
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原代培养是指由体内取出细胞、组织和器官后进行的首次培养，也叫初代培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。细胞系作为一种体外表达系统，专一性好，可重复性高，是一种有用的实验材料。鱼类细胞系在毒理学、免疫学、生理学、细胞遗传学、细胞生物学等学科上均有广泛的应用。
线纹海马(hippocampuserectus)是海龙科(syngnathidae)海马属(hippocampus)的一种小型海洋硬骨鱼类，具有较高的观赏价值、药用价值与科研价值。由于旺盛的市场需求导致野生海马资源遭受过度捕捞，加上环境污染与生境破坏等影响，世界范围内的海马野生资源都已遭到严重破坏，部分海马种类已经濒临灭绝。目前对海马的研究多集中在海马行为学、生理学、养殖学、遗传学等方面，尚未见任何有关海马细胞培养的报道。本研究建立了一种稳定的海马原代细胞培养体系，为海马相关研究奠定基础。
技术实现要素：
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本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种简单易行的海马原代细胞培养体系的建立方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种海马原代细胞培养体系的建立方法，包括以下步骤：将活体海马进行表面消毒，于无菌条件下取出胚胎或肝脏，胚胎或肝脏经漂洗培养液漂洗后用胰蛋白酶消化，过滤除杂，离心，去掉上清液，细胞沉淀用原代生长培养液重悬，制得单细胞悬液(细胞浓度约2×104-2×105细胞/ml)，将单细胞悬液移入添加有原代生长培养液的培养瓶中培养，每2-3天按半量换液方式更换原代生长培养液；所述的漂洗培养液为：以dmem/f12培养基为基础培养基，所述的基础培养基中还添加有青霉素和链霉素；所述的原代生长培养液为：以dmem/f12培养基为基础培养基，添加体积分数20％fbs、青霉素、链霉素、1-5ng/mlfgf和2-10ng/mlegf。
所述的胚胎或肝脏经漂洗培养液漂洗后用胰蛋白酶消化，其消化时间优化为10-20min。
所述的将活体海马进行表面消毒具体为：用无菌海水浸泡活体海马20min，用无菌纱布吸干海马表面液体，再将海马置于体积分数75％酒精中浸泡1-2min，无菌海水漂洗海马2-3次。
所述的原代生长培养液优选为：以含体积分数20％fbs的dmem/f12培养基为基础培养基，所述的基础培养基中还添加有400iu/ml青霉素、400μg/ml链霉素、5ng/mlfgf和2ng/mlegf。
所述的海马优选为线纹海马(hippocampuserectus)。
本发明的第二个目的是提供一种海马原代细胞培养体系的建立方法，包括以下步骤：将活体海马进行表面消毒，于无菌条件下取出育儿袋，育儿袋用漂洗培养液漂洗，然后将育儿袋切块后接种于培养瓶中，干帖培养后，加入原代生长培养液培养，每2-3天按半量换液方式更换原代生长培养液；所述的漂洗培养液为：以dmem/f12培养基为基础培养基，所述的基础培养基中还添加有青霉素和链霉素；所述的原代生长培养液为：以dmem/f12培养基为基础培养基，添加体积分数20％fbs、青霉素、链霉素、1-5ng/mlfgf和2-10ng/mlegf。
所述的将活体海马进行表面消毒具体为：用无菌海水浸泡活体海马20min，用无菌纱布吸干海马表面液体，再将海马置于体积分数75％酒精中浸泡1-2min，无菌海水漂洗海马2-3次。
所述的原代生长培养液优选为：以含体积分数20％fbs的dmem/f12培养基为基础培养基，所述的基础培养基中还添加有400iu/ml青霉素、400μg/ml链霉素、5ng/mlfgf和2ng/mlegf。
所述的海马优选为线纹海马(hippocampuserectus)。
本发明的建立方法所具有的优点和积极效果如下：
(1)本发明的构建方法操作简便易行，效率高，并且构建方法重复性强，构建的细胞系稳定性好；
(2)本发明使用不同的组织作为外植体，筛选到胚胎和肝脏均是比较理想的外植体组织，尤其已胚胎组织效果最佳，可短期内获得大量的原代细胞；当以育儿袋为外植体组织时，培养得到的细胞全部为纤维样细胞；
(3)本发明构建的线纹海马细胞系是首个海马细胞系，为海马种质资源保存、细胞生物学、免疫学等领域的研究奠定了基础。
附图说明：
图1是实施例1的线纹海马不同组织细胞培养过程，其中a、b分别为胚胎组织培养2d、10d细胞迁出状态，c、d分别为肝脏组织培养4d、12d细胞迁出状态，e、f、g分别为育儿袋、肌肉、鳍条组织培养14d细胞迁出状态。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
线纹海马原代细胞的培养，步骤如下：
1.相关试剂配制
漂洗培养液：向dmem/f12培养基中添加青霉素(penicillin)与链霉素(streptomycin)，使青霉素和链霉素终浓度分别为400iu/ml和400μg/ml。
原代生长培养液：向dmem/f12培养基中添加胎牛血清(fbs)，使胎牛血清体积分数为20％，然后以含体积分数20％fbs的dmem/f12培养基为基础培养基，在基础培养基中添加青霉素、链霉素、成纤维细胞生长因子(fgf)和表皮细胞生长因子(egf)，使青霉素、链霉素、fgf和egf终浓度分别为400iu/ml、400μg/ml、5ng/ml和2ng/ml。
2.外植体消毒处理
先用无菌海水浸泡活体线纹海马(hippocampuserectus)20min，用无菌纱布吸干表面液体；再将海马置于体积分数75％酒精中浸泡1min；再以无菌海水漂洗海马3次后，于超净工作台中用无菌解剖器械分别取出胚胎、肝脏、育儿袋、肌肉和鳍条5种组织；将5种组织分别置于无菌容器中用漂洗培养液漂洗3次；
3.海马不同组织处理与培养
(1)胚胎、肝脏的处理：加入胰蛋白酶消化20min后，用100目的灭菌滤网过滤；转移滤液至离心管中，150g离心10min；吸去上清，用2ml原代生长培养液重悬沉淀，制得单细胞悬液，移入25cm2培养瓶中，每个培养瓶内添加5ml原代生长培养液；
(2)育儿袋、肌肉和鳍条的处理：由于肌肉、育儿袋和鳍条组织不宜消化，采用组织块培养法，即将组织切成约1mm3的碎片后接种于25cm2培养瓶中，25℃培养箱内贴壁培养2h后，添加2ml原代生长培养液；
(3)将培养瓶置于25℃培养箱内培养，每2天按半量换液方式更换原代生长培养液。
实施例2：
线纹海马原代细胞的培养，步骤如下：
1.相关试剂配制
漂洗培养液：向dmem/f12培养基中添加青霉素(penicillin)与链霉素(streptomycin)，使青霉素和链霉素终浓度分别为400iu/ml和400μg/ml。
原代生长培养液：向dmem/f12培养基中添加胎牛血清(fbs)，使胎牛血清体积分数为20％，然后以含体积分数20％fbs的dmem/f12培养基为基础培养基，在基础培养基中添加青霉素、链霉素、成纤维细胞生长因子(fgf)和表皮细胞生长因子(egf)，使青霉素、链霉素、fgf和egf终浓度分别为400iu/ml、400μg/ml、1ng/ml和10ng/ml。
2.外植体消毒处理
先用无菌海水浸泡活体线纹海马(hippocampuserectus)20min，用无菌纱布吸干表面液体；再将海马置于体积分数75％酒精中浸泡2min；再以无菌海水漂洗海马2次后，于超净工作台中用无菌解剖器械分别取出胚胎、肝脏、育儿袋、肌肉和鳍条5种组织；将5种组织分别置于无菌容器中用漂洗培养液漂洗3次；
3.海马不同组织处理与培养
(1)胚胎、肝脏的处理：加入胰蛋白酶消化20min后，用100目的灭菌滤网过滤；转移滤液至离心管中，150g离心10min；吸去上清，用2ml原代生长培养液重悬沉淀，制得单细胞悬液，移入25cm2培养瓶中，每个培养瓶内添加5ml原代生长培养液；
(2)育儿袋、肌肉和鳍条的处理：由于肌肉、育儿袋和鳍条组织不宜消化，采用组织块培养法，即将组织切成约1mm3的碎片后接种于25cm2培养瓶中，25℃培养箱内贴壁培养2h后，添加2ml原代生长培养液；
(3)将培养瓶置于25℃培养箱内培养，每3天按半量换液方式更换原代生长培养液。
实施例3：
原代细胞种属来源鉴定及生长规律测定
1.原代细胞种属来源的鉴定
(1).待实施例1和实施例2培养的细胞生长稳定后，采用天根生化科技(北京)有限公司提供的海洋动物组织基因组dna提取试剂盒(dp324)进行原代细胞基因组dna提取，操作方法参照说明书进行；
(2).以线纹海马16srrna基因特异性引物(forwardprimer:5’-cgagtagaggtgacaagccaaac-3’，reverseprimer:5’-gctccacagggtcttctcgtc-3’)作为引物，原代细胞系基因组dna为模板，进行pcr扩增；
(3).pcr产物经纯化后，经英俊公司测序；
(4).对测序结果经数据库比对，鉴定原代细胞系种属来源。blast比对结果显示均与线纹海马(hippocampuserectus)相似度为100％，说明实施例1和实施例2中细胞来源于线纹海马，培养得到的细胞为线纹海马原代细胞。
2.海马原代细胞生长特性
实施例1和实施例2的细胞或组织块接种培养后，通过leica体式显微镜及时观察细胞生长状态。观察结果显示，原代生长培养液是一种比较适合海马细胞培养的培养基，但不同组织/细胞表现出明显的生长差异。实施例1的线纹海马不同组织细胞培养过程中，胚胎细胞表现出最高的生长速度，接种第2d即可看到胚胎组织周围有明显的细胞呈辐射状迁出(图1-a)，培养到第10天，细胞大量迁出(图1-b)，铺满瓶底约85％；其次是肝脏细胞，也表现出比较高的生长速度，接种4d后，可明观察到少量细胞迁出(图1-c)，培养至第12天，可观察到较多细胞呈辐射状迁出(图1-d)，铺满瓶底约60％；育儿袋组织块也表现出一定的生长能力，但远不如上述两种；育儿袋组织在接种12d后，可观察到极少量细胞迁出(图1-e)，但继续培养也未见明显新细胞迁出；而肌肉组织与鳍条组织，在本实施例中却未见明显细胞生长/迁出(图1-f,g)；形态学观察表明，胚胎细胞与肝脏细胞培养得到的细胞为纤维样细胞与上皮样细胞的混合细胞，以纤维样细胞为主；而育儿袋培养得到的全部为纤维样细胞。实施例2的线纹海马不同组织细胞培养过程中，胚胎细胞同样表现出最高的生长速度，接种第2d即可看到胚胎组织周围有明显的细胞迁出，呈辐射状，培养到第10天，细胞大量迁出，铺满瓶底约80％；其次是肝脏细胞，也表现出比较高的生长速度，接种4d后，可明观察到少量细胞迁出，培养至第12天，可观察到较多细胞呈辐射状迁出，铺满瓶底约60％；育儿袋组织块也表现出一定的生长能力，但远不如上述两种；育儿袋组织在接种12d后，可观察到极少量细胞迁出，但继续培养也未见明显新细胞迁出；而肌肉组织与鳍条组织，在本实施例中却未见明显细胞生长/迁出；形态学观察表明，胚胎细胞与肝脏细胞培养得到的细胞为纤维样细胞与上皮样细胞的混合细胞，以纤维样细胞为主；而育儿袋培养得到的全部为纤维样细胞。
上述实施例表明，本发明成功建立了海马原代细胞培养体系，原代生长培养液是一种比较适合用于线纹海马原代细胞生长的培养基，胚胎组织是最理想的线纹海马原代细胞培养的外植体，其次是肝脏组织。培养得到的原代细胞以纤维样细胞与上皮样细胞为主，其中纤维样细胞占优势。
本发明建立了一种稳定的海马原代细胞培养体系，为海马种质资源保存、细胞生物学、免疫学等领域的研究奠定了基础。本发明建立的线纹海马原代细胞培养体系操作简单，重复性强，细胞生长稳定，也可适用于其它海龙科鱼类细胞原代培养体系的构建。