本发明涉及细胞培养领域，具体地说，是一种小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化剂及诱导分化方法。
背景技术：
：小鼠前脂肪细胞3t3-l1是从小鼠胚胎中分离克隆的具有单一分化潜能的细胞株，其在一定条件下可诱导分化为成熟脂肪细胞。3t3-l1分化后的成熟脂肪细胞在形态以及功能上可较好的模拟在体脂肪细胞，因此3t3-l1是研究肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝等代谢综合征的重要工具细胞。3t3-l1的细胞分化过程是一个基因水平和激素水平综合调控的过程。然而3t3-l1前脂肪细胞不仅细胞培养困难，其诱导分化成熟更成为许多科学研究的瓶颈问题。传统的3t3-l1前脂肪细胞诱导法是将一定剂量的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素作为诱导剂序贯加入细胞培养基中，诱导3t3-l1细胞的分化，又名鸡尾酒法。用传统鸡尾酒法诱导主要表现为3t3-l1细胞转化率低，转化周期长，后期细胞容易漂浮，脂滴较小且分化不均匀。因此找到一种分化周期短，前脂肪细胞转化率高且分化一致的诱导方法是目前脂肪代谢领域亟待解决的问题之一。罗格列酮属于噻唑烷二酮类药物，是一种常用的降糖药物，其可增强机体组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛β细胞功能，实现对血糖的有效控制。专利文献cn103361307a，公开日2013.10.23，公开了一种c3h10t1/2中胚层多潜能胚胎干细胞株的诱导分化方法，其步骤包括：将c3h10t1/2细胞培养于培养液中培养，细胞达80％-90％融合后加入0.25％胰酶5ml消化，细胞收缩呈圆形时终止胰酶消化反应，离心3-5分钟、沉淀、弃去上清，再加入培养液后吹打；按1:4比例传代培养到6孔板或12孔板培养，每2-4天更换培养液1次；待培养板上的细胞长满后置于诱导液a中，2天后撤去诱导液a换成诱导液b，2天后撤去诱导液b换成培养液，每2-4天更换培养液1次即可。诱导液a为含有体积百分比为10％fbs的dmem培养液，该培养液中还含有胰岛素4-5μg/ml，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5-0.7mmol/l，地塞米松1-2μmol/l，吲哚美辛120-130nmol/l，三碘甲状腺氨酸1-2nmol/l，罗格列酮1-2μmol/l。诱导液b为含有体积百分比为10％fbs的dmem培养液，该培养液中还含胰岛素5-10μg/ml，三碘甲状腺氨酸1-3nmol/l，罗格列酮1-3μmol/l。然而目前未见分化周期短、转化率高且分化一致的小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化方法。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中小鼠前脂肪细胞3t3-l1诱导分化困难的问题，提供一种分化周期短、转化率高且分化一致的小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化方法。本发明首先提供了一种小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化剂，组成为：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，胰岛素，地塞米松，罗格列酮，fbs；以上各组分的比例为：(0.45-0.55)mmol/l:(4.5-5.5)μg/ml:(0.9-1.1)μmol/l:(0.9-1.1)μmol/l:100ml/l。较佳地，所述的诱导分化剂中3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和罗格列酮的比例为：0.5mmol/l:5μg/ml:1μmol/l:1μmol/l:100ml/l。本发明又提供了所述的诱导分化剂在诱导小鼠前脂肪细胞3t3-l1分化为成熟脂肪细胞中的应用。本发明还提供了一种小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化培养基，所述的诱导分化培养基含有如上所述的诱导分化剂。较佳地，所述的诱导分化培养基为高糖dmem培养基。本发明还提供了一种小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化方法，所述的方法包含以下步骤：1)3t3-l1细胞常规复苏，置于含10％fbs的高糖dmem培养基中，37℃、5％co2，饱和湿度条件下培养；2)以(4-6)×104/ml的密度接种细胞于细胞培养板，待细胞生长至85％开始分化；3)用含(0.45-0.55)mmol/l3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，(4.5-5.5)μg/ml胰岛素，(0.9-1.1)μmol/l地塞米松，(0.9-1.1)μmol/l罗格列酮，10％fbs，高糖dmem培养液培养36-60小时；4)再用含(4.5-5.5)μg/ml胰岛素，10％fbs高糖dmem培养液培养36-60小时；5)之后用含10％fbs高糖dmem培养液培养，每天换液一次，采用半液换液法；6)直至细胞分化成功。较佳地，步骤3)中各成分浓度分别为：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5mmol/l，胰岛素5μg/ml，地塞米松1μmol/l，罗格列酮1μmol/l。较佳地，步骤6)中直至细胞分化成功所需的时间为自步骤3)起算6-7天。本发明的有益效果为：本发明选用了合适的诱导剂成分，各成分的浓度比例合理，诱导方法和步骤设计合理，因此对小鼠前脂肪细胞3t3-l1向成熟脂肪细胞的分化能起到良好的诱导作用，分化周期短，仅为6-7天，前脂肪细胞转化率高，且细胞分化均匀一致，将极大地便于脂肪代谢疾病研究的开展。附图说明图1为细胞油红染色照片。左侧培养板来自对比例1组，左侧培养板来自实施例7组。具体实施方式下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。以下实施例和对比例中，小鼠前脂肪细胞3t3-l1购于美国atcc，批号为；fbs和高糖dmem培养基购于美国gibco，批号为分别为1453373和1894111；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，ibmx)、胰岛素、地塞米松、罗格列酮均购于美国塞默飞。实施例1小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化剂组成为：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，胰岛素，地塞米松，罗格列酮，fbs。以上各组分的比例为：0.5mmol/l:5μg/ml:1μmol/l:1μmol/l:100ml/l。实施例2小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化剂组成为：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，胰岛素，地塞米松，罗格列酮，fbs。以上各组分的比例为：0.45mmol/l:5.5μg/ml:0.9μmol/l:1.1μmol/l:100ml/l。实施例3小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化剂组成为：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，胰岛素，地塞米松，罗格列酮，fbs。以上各组分的比例为：0.55mmol/l:4.5μg/ml:1.1μmol/l:0.9μmol/l:100ml/l。实施例4小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化剂组成为：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，胰岛素，地塞米松，罗格列酮，fbs。以上各组分的比例为：0.55mmol/l:5.5μg/ml:0.9μmol/l:0.9μmol/l:100ml/l。实施例5小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化剂组成为：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，胰岛素，地塞米松，罗格列酮，fbs。以上各组分的比例为：0.45mmol/l:4.5μg/ml:1.1μmol/l:1.1μmol/l:100ml/l。实施例6小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化剂组成为：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，胰岛素，地塞米松，罗格列酮，fbs。以上各组分的比例为：0.55mmol/l:5.5μg/ml:0.9μmol/l:1.1μmol/l:100ml/l。实施例7小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化方法如下：1)3t3-l1细胞常规复苏，置于含10％fbs的高糖dmem培养基中，37℃、5％co2，饱和湿度条件下培养。2)以5×104/ml的密度接种细胞于12孔板，每孔1ml，待细胞生长至85％开始分化；3)用含0.5mmol/l3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，5μg/ml胰岛素，1μmol/l地塞米松，1μmol/l罗格列酮，10％fbs，高糖dmem培养液培养2天；4)再用含5μg/ml胰岛素，10％fbs高糖dmem培养液培养2天；5)含10％fbs高糖dmem培养液，每天换液一次，采用半液换液法，即吸出一半原来的培养基，再加入一半新鲜的培养基；6)待细胞分化成功。实施例8小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化方法如下：1)3t3-l1细胞常规复苏，置于含10％fbs的高糖dmem培养基中，37℃、5％co2，饱和湿度条件下培养。2)以4×104/ml的密度接种细胞于12孔板，每孔1ml，待细胞生长至85％开始分化；3)用含0.45mmol/l3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，5.5μg/ml胰岛素，0.9μmol/l地塞米松，1.1μmol/l罗格列酮，10％fbs，高糖dmem培养液培养60小时；4)再用含5.5μg/ml胰岛素，10％fbs高糖dmem培养液培养36小时；5)含10％fbs高糖dmem培养液，每24小时换液一次，采用半液换液法，即吸出一半原来的培养基，再加入一半新鲜的培养基；6)待细胞分化成功。实施例9小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化方法如下：1)3t3-l1细胞常规复苏，置于含10％fbs的高糖dmem培养基中，37℃、5％co2，饱和湿度条件下培养。2)以6×104/ml的密度接种细胞于12孔板，每孔1ml，待细胞生长至85％开始分化；3)用含0.55mmol/l3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，4.5μg/ml胰岛素，1.1μmol/l地塞米松，0.9μmol/l罗格列酮，10％fbs，高糖dmem培养液培养36小时；4)再用含4.5μg/ml胰岛素，10％fbs高糖dmem培养液培养60小时；5)含10％fbs高糖dmem培养液，每24小时换液一次，采用半液换液法，即吸出一半原来的培养基，再加入一半新鲜的培养基；6)待细胞分化成功。实施例10小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化方法如下：1)3t3-l1细胞常规复苏，置于含10％fbs的高糖dmem培养基中，37℃、5％co2，饱和湿度条件下培养。2)以5×104/ml的密度接种细胞于12孔板，每孔1ml，待细胞生长至85％开始分化；3)用含0.55mmol/l3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，5.5μg/ml胰岛素，0.9μmol/l地塞米松，0.9μmol/l罗格列酮，10％fbs，高糖dmem培养液培养48小时；4)再用含4.5μg/ml胰岛素，10％fbs高糖dmem培养液培养48小时；5)含10％fbs高糖dmem培养液，每24小时换液一次，采用半液换液法，即吸出一半原来的培养基，再加入一半新鲜的培养基；6)待细胞分化成功。实施例11小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化方法如下：1)3t3-l1细胞常规复苏，置于含10％fbs的高糖dmem培养基中，37℃、5％co2，饱和湿度条件下培养。2)以6×104/ml的密度接种细胞于12孔板，每孔1ml，待细胞生长至85％开始分化；3)用含0.45mmol/l3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，4.5μg/ml胰岛素，1.1μmol/l地塞米松，1.1μmol/l罗格列酮，10％fbs，高糖dmem培养液培养48小时；4)再用含4.5μg/ml胰岛素，10％fbs高糖dmem培养液培养48小时；5)含10％fbs高糖dmem培养液，每24小时换液一次，采用半液换液法，即吸出一半原来的培养基，再加入一半新鲜的培养基；6)待细胞分化成功。实施例12小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化方法如下：1)3t3-l1细胞常规复苏，置于含10％fbs的高糖dmem培养基中，37℃、5％co2，饱和湿度条件下培养。2)以4×104/ml的密度接种细胞于12孔板，每孔1ml，待细胞生长至85％开始分化；3)用含0.55mmol/l3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，5.5μg/ml胰岛素，0.9μmol/l地塞米松，1.1μmol/l罗格列酮，10％fbs，高糖dmem培养液培养48小时；4)再用含4.5μg/ml胰岛素，10％fbs高糖dmem培养液培养48小时；5)含10％fbs高糖dmem培养液，每24小时换液一次，采用半液换液法，即吸出一半原来的培养基，再加入一半新鲜的培养基；6)待细胞分化成功。研究过程中，发明人还设置了大量实验组，其中包含以下组别：对比例1小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化方法如下：1)3t3-l1细胞常规复苏，置于含10％fbs的高糖dmem培养基中，37℃、5％co2，饱和湿度条件下培养。2)以5×104/ml的密度接种细胞于12孔板，每孔1ml，待细胞生长至85％开始分化；3)用含0.5mmol/l3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，5μg/ml胰岛素，1μmol/l地塞米松，10％fbs，高糖dmem培养液培养2天；4)再用含5μg/ml胰岛素，10％fbs高糖dmem培养液培养2天；5)含10％fbs高糖dmem培养液，每天换液一次，采用半液换液法，即吸出一半原来的培养基，再加入一半新鲜的培养基；6)待细胞分化成功。对比例2小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化方法如下：1)3t3-l1细胞常规复苏，置于含10％fbs的高糖dmem培养基中，37℃、5％co2，饱和湿度条件下培养。2)以4×104/ml的密度接种细胞于12孔板，每孔1ml，待细胞生长至85％开始分化；3)用含0.45mmol/l3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，5.5μg/ml胰岛素，0.9μmol/l地塞米松，1.2μmol/l罗格列酮，10％fbs，高糖dmem培养液培养60小时；4)再用含5.5μg/ml胰岛素，10％fbs高糖dmem培养液培养36小时；5)含10％fbs高糖dmem培养液，每24小时换液一次，采用半液换液法，即吸出一半原来的培养基，再加入一半新鲜的培养基；6)待细胞分化成功。对比例3小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化方法如下：1)3t3-l1细胞常规复苏，置于含10％fbs的高糖dmem培养基中，37℃、5％co2，饱和湿度条件下培养。2)以6×104/ml的密度接种细胞于12孔板，每孔1ml，待细胞生长至85％开始分化；3)用含0.55mmol/l3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，4μg/ml胰岛素，1.1μmol/l地塞米松，0.9μmol/l罗格列酮，10％fbs，高糖dmem培养液培养36小时；4)再用含4.5μg/ml胰岛素，10％fbs高糖dmem培养液培养60小时；5)含10％fbs高糖dmem培养液，每24小时换液一次，采用半液换液法，即吸出一半原来的培养基，再加入一半新鲜的培养基；6)待细胞分化成功。实施例13诱导分化效果以上实施例7-12和对比例1-3各设6个重复。在实施例7-12和对比例1-3细胞诱导分化过程中，观察细胞分化情况，发现实施例7-12的细胞在自步骤3)开始诱导的第3天即开始观察到细胞分化成功，呈脂肪细胞表型，可看到脂滴，第6天时基本全部分化成功，而对比例1-3组的细胞普遍在第4-5天开始看到脂滴。表明本发明的方法具备分化周期短的优势。于自步骤3)开始诱导的第7天对各组细胞进行油红染色，检测细胞脂滴的多少进而判断细胞的分化程度，计算前脂肪细胞转化率。油红染色具体方法为：细胞用磷酸缓冲盐溶液pbs洗两次，用0.4％的多聚甲醛固定30分钟，油红储存液与水3:2混合，然后染色细胞1小时，磷酸缓冲盐溶液pbs洗两次。60％异丙醇分化1分钟，磷酸缓冲盐溶液pbs洗两次拍照即可。再通过肉眼观察判断各组细胞分化的均一度，进行打分，总分10分，分数越高，表明分化均一度越好。数据均以表示，统计处理用t检验。各组前脂肪细胞转化率及分化均一度统计结果见表1。组间比较表明，实施例7-12的转化率均显著高于对比例1-3，差异具有统计学意义(p<0.05)，且实施例7的转化率显著高于实施例8-12，差异也均具有统计学意义(p<0.05)；实施例7-12的分化均一度评分均显著高于对比例1-3，差异具有统计学意义(p<0.05)，且实施例7的分化均一度评分也显著高于实施例8-12，差异均具有统计学意义(p<0.05)。结果表明，本发明的方法选用了合适的诱导剂、培养基，诱导分化步骤和方法合理，显著提高了转化率，获得了分化程度一致的成熟脂肪细胞。表1各组前脂肪细胞转化率及分化均一度组别转化率(％)分化均一度(分)实施例798.3±8.59.3±0.6实施例885.0±7.48.6±0.9实施例992.9±7.88.4±0.7实施例1087.9±10.38.8±1.2实施例1190.3±9.18.9±0.9实施例1296.6±3.49.0±0.8对比例169.2±4.37.3±0.5对比例268.9±6.76.9±0.8对比例373.5±5.16.8±0.7综上，本发明的方法具备分化周期短，转化率高且分化一致的优势。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12