本发明涉及生物制品制备技术领域，尤其是涉及缓解膝骨关节炎的活性多肽的制备方法。
背景技术：
膝骨关节炎是以关节软骨退变为核心的骨及骨质、滑膜、关节囊及关节其他结构的多方位、多层次、不同程度的慢性炎症。其临床表现多为膝关节疼痛、肿胀、功能障碍、关节粗大、内翻畸形等、膝骨关节炎的发生多为老年人，乃本虚标实之症，加之由于膝关节疼痛而长期缺乏活动，致局部气血运行不足，筋失所养，酸痛麻木，久之易致筋肉萎缩和骨质疏松。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供缓解膝骨关节炎的活性多肽的制备方法，该方法无催化剂或酶的加入，避免了分离步骤，且所得活性多肽的收率高，能够有效缓解膝骨关节炎。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：缓解膝骨关节炎的活性多肽的制备方法，方法包括以下步骤：
低值鱼的预处理：将低值鱼在质量分数为22％-25％的食盐水中蒸煮，蒸煮温度为81-87℃，时间为17-21min，冷却至室温，其中，低值鱼与食盐水的质量比为1/1.2-1.5，预处理过程避免了杂质的影响，同时用盐水蒸煮低值鱼，对低值鱼起到了杀菌的效果，且该温度下低值鱼中的蛋白质能够适度变性，为后续的高压蒸煮提供了良好的条件；
蛋白的制备：将低值鱼放入高压锅，在绝对压力0.15-0.2mpa，温度121-126℃下蒸煮0.6-1h，得蛋白液，该条件下，低值鱼所含的蛋白溶出速率快，溶出度高，使低值鱼资源得到了充分利用，极大地增加了方法的经济价值；
蛋白的分解：将所得蛋白液在绝对压力0.1-0.15mpa，温度116-122℃下继续蒸煮3.1-3.8h，得蛋白分解液，蛋白分解过程中无催化剂的加入，避免了后续催化剂的分离过程，简化了工艺步骤，且避免了分离过程中低值鱼蛋白的损失，降低了加工成本；
分离纯化：蛋白分解液经截留分子量为1kda的超滤膜进行过滤，收集截留液，将截留液按照体积比加入到装有8-10倍d101大孔树脂的层析柱中，用3-5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5-8倍柱体积的质量分数为58%-61%乙醇水溶液进行洗脱，乙醇洗脱液在50℃旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得活性多肽。该过程操作简单，重复性好，且洗脱范围广，可根据实际情况进行放大条件实现工业化生产。
作为优选，分离纯化过程中，在乙醇洗脱液旋蒸前向乙醇洗脱液中加入占乙醇洗脱液质量分数0.02％的二苯溴甲烷和0.03％的3-甲基水杨酸。所加入的二苯溴甲烷、3-甲基水杨酸与乙醇具有协同作用，提高了旋蒸过程中活性多肽的收率。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开的缓解膝骨关节炎的活性多肽的制备方法包括低值鱼的预处理、蛋白的制备、蛋白的分解以及分离纯化，该方法无催化剂或酶的加入，避免了分离步骤；盐水蒸煮低值鱼，对低值鱼起到了杀菌的效果，且该温度下低值鱼中的蛋白质能够适度变性，为后续的高压蒸煮提供了良好的条件。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明：
实施例1：
缓解膝骨关节炎的活性多肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)低值鱼的预处理：将低值鱼在质量分数为22％的食盐水中蒸煮，蒸煮温度为81℃，时间为17min，冷却至室温，其中，低值鱼与食盐水的质量比为1/1.2，预处理过程避免了杂质的影响，同时用盐水蒸煮低值鱼，对低值鱼起到了杀菌的效果，且该温度下低值鱼中的蛋白质能够适度变性，为后续的高压蒸煮提供了良好的条件；
2)蛋白的制备：将低值鱼放入高压锅，在绝对压力0.15mpa，温度121℃下蒸煮0.6h，得蛋白液，该条件下，低值鱼所含的蛋白溶出速率快，溶出度高，使低值鱼资源得到了充分利用，极大地增加了方法的经济价值；
3)蛋白的分解：将所得蛋白液在绝对压力0.1mpa，温度116℃下继续蒸煮3.1h，得蛋白分解液，蛋白分解过程中无催化剂的加入，避免了后续催化剂的分离过程，简化了工艺步骤，且避免了分离过程中低值鱼蛋白的损失，降低了加工成本；
4)分离纯化：蛋白分解液经截留分子量为1kda的超滤膜进行过滤，收集截留液，将截留液按照体积比加入到装有8倍d101大孔树脂的层析柱中，用3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5倍柱体积的质量分数为58%乙醇水溶液进行洗脱，乙醇洗脱液在50℃旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得活性多肽。该过程操作简单，重复性好，且洗脱范围广，可根据实际情况进行放大条件实现工业化生产。
实施例2：
缓解膝骨关节炎的活性多肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：首先是低值鱼的预处理：将低值鱼在质量分数为25％的食盐水中蒸煮，蒸煮温度为87℃，时间为21min，冷却至室温，其中，低值鱼与食盐水的质量比为1/1.5；接着是蛋白的制备：将低值鱼放入高压锅，在绝对压力0.2mpa，温度126℃下蒸煮1h，得蛋白液，该条件下，低值鱼所含的蛋白溶出速率快，溶出度高，使低值鱼资源得到了充分利用，极大地增加了方法的经济价值；接着是蛋白的分解：将所得蛋白液在绝对压力0.15mpa，温度122℃下继续蒸煮3.8h，得蛋白分解液；最后是分离纯化：蛋白分解液经截留分子量为1kda的超滤膜进行过滤，收集截留液，将截留液按照体积比加入到装有10倍d101大孔树脂的层析柱中，用5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用8倍柱体积的质量分数为61%乙醇水溶液进行洗脱，乙醇洗脱液在50℃旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得活性多肽。该过程操作简单，重复性好，且洗脱范围广，可根据实际情况进行放大条件实现工业化生产。
实施例3：
缓解膝骨关节炎的活性多肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：首先是低值鱼的预处理：将低值鱼在质量分数为24％的食盐水中蒸煮，蒸煮温度为86℃，时间为21min，冷却至室温，其中，低值鱼与食盐水的质量比为1/1.4；接着是蛋白的制备：将低值鱼放入高压锅，在绝对压力0.2mpa，温度125℃下蒸煮1h，得蛋白液，该条件下，低值鱼所含的蛋白溶出速率快，溶出度高，使低值鱼资源得到了充分利用，极大地增加了方法的经济价值；接着是蛋白的分解：将所得蛋白液在绝对压力0.15mpa，温度121℃下继续蒸煮3.8h，得蛋白分解液；最后是分离纯化：蛋白分解液经截留分子量为1kda的超滤膜进行过滤，收集截留液，将截留液按照体积比加入到装有10倍d101大孔树脂的层析柱中，用5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用8倍柱体积的质量分数为60%乙醇水溶液进行洗脱，向所得乙醇洗脱液中加入占乙醇洗脱液质量分数0.02％的二苯溴甲烷和0.03％的3-甲基水杨酸，接着在50℃旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得活性多肽。该过程操作简单，重复性好，且洗脱范围广，可根据实际情况进行放大条件实现工业化生产。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。