本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种抗禽类传染性支气管炎病毒的纳米抗体，本发明还涉及该纳米抗体的制备方法。
背景技术：
鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒（infectiousbronchitisvirus，ibv)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，是严重危害养鸡业的重大传染病之一。ibv是禽类一种变异性很强的冠状病毒，有囊膜，为单股负链rna病毒。
传统培养ibv病毒的方法多是在9-11日龄spf鸡胚尿囊腔接种培养，同等条件下用pbs接种做对照组。captotmcore700设计用于病毒和其他大分子的纯化，能与分子量高达660000的蛋白结合，而分子量更大的蛋白会被排阻在微球外。将含有病毒的尿囊液，用captotmcore700进行病毒纯化，获得ibv抗原。
骆驼免疫系统里内存在一种仅由重链单一的折叠单元组成的抗体，将其称为单域重链抗体（variabledomainofheavy-chainofheavy-chainantibody,vhh）或纳米抗体（nanobody,nbs）。纳米抗体仅由重链抗体的可变区组成，较普通抗体具有一些独特性能，如分子量小、稳定性高、亲和力高、免疫原性弱、良好和广泛的抗原结合能力以及水溶性好等特点，使其在病原的检测、食品安全分析等领域被广泛应用。
免疫学的检测方法具有很多优点，主要包括操作简便、检测速度快等，其中有elisa法、荧光免疫法等。在免疫学检测方法中，检测结果主要受抗体与抗原结合效果的影响。传统抗体的制备需要免疫动物，导致制备过程繁琐且对操作人员的实验技术要求较高，从而导致生产成本较高，研发周期较长。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种抗禽类传染性支气管炎病毒（ibv）的纳米抗体，本发明还提供该纳米抗体的制备方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的抗禽类传染性支气管炎病毒的纳米抗体，其氨基酸编码序列为：seqidno：2，编码所述氨基酸序列的dna序列为：seqidno：1。
所述纳米抗体仅有重链组成，天然缺失轻链，其分子量约为15kd。
本发明所述的抗禽类传染性支气管炎病毒的纳米抗体的制备方法包括下述步骤：
第一步，按传统方法将ibv病毒在9-11日龄spf鸡胚上接种传代培养，将含有病毒的鸡胚尿囊液收集并用captotmcore700进行纯化，检测病毒纯化结果良好备用；
第二步，从未经免疫的健康骆驼的外周血淋巴细胞中提取其rna，并鉴定rna的完整性良好；以rna为模板，反转录为cdna，特异性扩增骆驼重链抗体可变区基因，将酶切后基因与噬菌粒载体pcantab5e连接后电转化至大肠杆菌tg1，获得vhh抗体基因库；分析其库容量及多样性后，筛选出能够与ibv特异性结合的纳米抗体vhh-a2片段；构建pet28a-a2表达载体，对其进行原核表达、纯化与鉴定，得到氨基酸编码序列为：seqidno：2，编码所述氨基酸序列的dna序列为：seqidno：1的纳米抗体。
本发明的优点在于采用未经免疫的骆驼的淋巴细胞为起始实验材料，扩增全套单域抗体基因，构建骆驼非免疫噬菌体抗体库，鉴定抗体库的库容量及多样性。利用ibv抗原，对骆驼天然单域抗体噬菌体展示文库进行筛选，并从抗体库中筛选出抗ibv的纳米抗体，为ib的检测提供了一种新的思路。
本发明制备的纳米抗体作为一种新型的基因工程抗体，由于其独特的结构特征，抗原识别能力强，可用于快速、准确的检测禽类（如鸡）传染性支气管炎，且制备周期短，制备方法简单。
附图说明
图1为本发明实施例中rna的鉴定结果。
图2为本发明实施例中vhh的鉴定结果。
图3本发明实施例中文库pcr的鉴定结果。
图4本发明实施例中vhh抗体库中随机克隆的测序结果。
图5本发明实施例中ibv的纯化结果。
图6本发明实施例中ibv的纯化鉴定结果。
图7本发明实施例中ibv纳米抗体酶联免疫活性的鉴定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。以下实施例中所用原料及试剂，如无特别说明，则均为市售；所涉及的检测方法或试验方法，如无特别说明，则均为常规方法。
实施例1、骆驼天然单域重链噬菌体展示抗体库的构建
实验所用balb/c小鼠购自郑州大学医学院动物实验中心。9-11日龄鸡胚，由购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司的种蛋孵育。实验所用主要试剂见表1。
表1
1、外周血淋巴细胞的分离和总rna的提取
取骆驼外周血，以109mmol/l柠檬酸钠抗凝。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，计数细胞，按每107细胞溶于1ml的trizol试剂中，参照trizol试剂使用说明抽提总rna。提取后的总rna用去离子水溶解，测定浓度，并于-80℃保存备用。提取出的rna鉴定结果如图1所示，证明其完整性良好。
2、骆驼重链抗体可变区基因的扩增
以总rna为模版，oligo(dt)18为引物，按照反转录试剂盒说明书，合成第一链cdna。参照表1合成pcr引物，以cdna为模版，pcr扩增重链抗体的可变区基因vhh。反应程序为：95℃预变性5min；95℃35s；63℃35s；72℃35s；共32个循环；72℃延伸7min。反应产物经1%的琼脂糖凝胶电泳验证后，经dna片段回收试剂盒回收定量，于-20℃保存备用。vhh的鉴定结果如图2所示，获得了片段大小约为500bp的骆驼重链可变区基因vhh。
3、噬菌体单域抗体库的构建
将噬菌粒载体pcantab5e和pcr扩增产物vhh分别用noti和sfii进行酶切反应；用dna回收试剂盒回收酶切片段,与酶切后的pcantab5e载体在t4dna连接酶的作用下进行连接；连接产物电转化入感受态大肠杆菌tg1，转化后的菌液于lb液体培养基中在37℃，220rpm培养1h。将转化菌液浓缩后，涂若干块平板培养基(含2%葡萄糖和amp抗生素的2×yt培养板)，同时取10μl倍比稀释计算库容，37℃培养过夜。次日，计算菌落形成单位(cfu)，即为噬菌体抗体库的滴度，并从平板上随机挑选20个单菌落，进行pcr鉴定，以确定抗体库的重组率，鉴定结果如图3所示，有18个阳性克隆，证明天然抗体库重组率大约为90%。挑取8个单克隆，送生物技术服务公司测序，测序结果如图4所示，结果显示，8个克隆的外源片段均为编码重链抗体可变区的基因。剩余菌液加入适量的2×yt/amp液体培养基和m13k07，37℃过夜培养。次日，用20%的peg8000/nacl从菌液上清中分离噬菌体，并悬浮于pbs中。
实施例2、ibv的扩繁和纯化
1、ibv在鸡胚上传代培养
用高锰酸钾-福尔马林熏蒸法消毒种蛋和孵化箱，将种蛋大头朝上放置孵化箱孵育。标准毒株冻干粉用pbs按1:1000稀释，接种9-11日龄spf鸡胚200ul/枚，对照组鸡胚注射等量的pbs。弃去24h内非正常死亡的鸡胚，48h后收获鸡胚尿囊液。6000rpm/min4℃离心15min，0.22μm过滤。连续在鸡胚上传3代，含病毒的尿囊液放于-80℃保存.
2、ibv的纯化
先后用10倍柱体积的ddw和pbs平衡captotmcore700柱子，流速1ml/min。上样，观察出峰时开始接样，过pbs，当od值降为0时停止接样。用洗脱液（含30%异丙醇的1mnaoh）洗脱杂蛋白，20%乙醇保存柱。图5为ibv的纯化结果，ibv被排阻在微球外先流出，而杂蛋白与柱子结合。
3、ibv的纯化结果鉴定
如图6左侧图所示，采用sds-page的方法，检测纯化结果，对照为不含病毒的尿囊液。结果显示纯化前后病毒完整性较好。
如图6右侧图所示，采用western-blot的方法，检测纯化结果，对照为不含病毒的尿囊液。将需要做western的胶切下，放入转膜缓冲液中浸泡20min，滤纸提前30min浸泡,取pvdf膜用甲醇浸泡30s,再放入转膜缓冲液中浸泡3-5min。依次在电转移上放滤纸、pvdf膜，胶，滤纸，赶出气泡。15v1h20min，停止转膜。pvdf膜用2.5%脱脂奶封闭2h，一抗为传染性支气管炎特异性血清，二抗为羊抗鸡igg-hrp，用ecl方法显色。结果显示主要结构蛋白没有丢失且能与ibv阳性血清结合。
实施例3、ibv特异性纳米抗体的淘选
1、富集筛选重组噬菌体
用nahco3缓冲液稀释ibv，使其终浓度为100μg/ml，100μl/孔包被于酶标板中，4℃过夜。次日，弃掉板中包被液，用tbst洗涤4次，加入封阻缓冲液，200μl/孔，37℃封闭2h。倒掉封闭液，用tbst（tbs+0.1%<v/v>tween-20），快速洗涤10次。然后在干净的纸巾上甩拍，以除去洗涤液；加入噬菌体，100μl/孔，37℃孵育1h。弃去未结合的噬菌体，用tbst洗涤10次，再用tbs洗5次。加入缓冲洗脱液，100μl/孔，把结合的噬菌体洗脱到洗脱液中，温和摇动8min。把洗脱液转移到微量离心管中，加入100μl中和缓冲液，使洗脱液为中性。取中和后的洗脱液少许进行测滴度，其余用于扩增。取400μl洗脱液，感染4ml对数期tg1细胞，摇匀后37℃静置30min，加入16ml的2×yt/amp-glu培养，37℃，220rpm培养至对数期。向培养液中加入20μl的m13ko7辅助噬菌体，摇匀后室温静置30min，2800g室温离心10min，弃上清，菌体用100μl2×yt/amp-kana培养基重悬，37℃，220rpm，培养14h。用peg8000/nacl溶液对其进行浓缩纯化，每管加入0.5mlpbs，重悬噬菌体沉淀。
重复步骤，完成第二轮和第三轮淘选。ibv包被原浓度依次降低，分别为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml。洗涤液中的tween20的含量依次升高，分别为0.1%、0.3%、0.5%。
2、阳性克隆的phage-elisa鉴定
从第三轮筛选中的大平皿上挑取单菌落于96孔板中，分别进行扩增纯化，取每轮筛选后扩增的噬菌体库，将ibv用pbs缓冲液稀释至10μg/ml作为包被原，用phage-elisa检测特异性重组噬菌体。
3、将elisa阳性克隆送生物技术服务公司进行测序，得到插入片段的dna序列,其编码针对ibv的单域重链抗体，具体如下（seqidno：1）：
caggtccaactgcaggagtctgggggaggctcggtgcatctggagggtctctaagactctcctgtgtagcctctggataccgcctcaatttaaactgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggggtcgcaactattgcaagtgattcgtatgggaggtacgcagactccgtgaggggccgattcgccatctcccaagacaacgccaagaacacgctgtacctgcaaatgaacaccctgaaccctgaggacacggccacgtattattgtgcggcctggcggggagattgtggcataccggatatgttaagaaccgacaactaccggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
依据测序结果及密码子表可获得针对ibv的单域重链抗体的氨基酸序列（seqidno：2）
qvqlqesgggsvhlegldspvpldtasitawagsarllersargsqllqvirmggtqtpgadspspkttprtrctcktptlrtrpriivrpggeivayriceptttgargprspsph
实施例4、纳米抗体在大肠杆菌中表达、纯化
1、构建表达载体
根据抗体的基因序列，设计一对特异性引物，采用pcr技术扩增vhh-a8基因。将纳米抗体的dna片段和表达载体pet28a进行双酶切，纯化回收，用t4连接酶连接，转化入表达宿主菌。表达载体的酶切条件为载体1ug(8μl)，10×快切酶buffer5μl，两种酶ndei、noti各1μl，水35μl，37℃孵育60min，从反应液中纯化回收质粒。dna片段酶切条件为dna片段1ug(10μl)，10×快切酶缓冲液5μl，两种酶ndei、noti各1μl，水33μl，37℃水浴60min，从反应液中回收纯化dna。表达载体与dna片段连接条件：表达载体(100ng)3μl，dna片段(120ng)5μl，10×t4buffer1μl，t4连接酶1μl，16℃连接过夜，65℃孵育10min灭活连接酶，转入ecolibl21感受态。
2、诱导表达
挑取阳性克隆，将测序正确的样品进行诱导表达，诱导表达步骤为：将测序正确的样本菌液按1:100接种于2yt培养基，37℃，220rpm进行活化，至菌液od600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.8mmol/l的iptg，20℃220rpm，诱导5～6h，收集菌液，空载体pet28a菌液按照上述诱导表达步骤操作；诱导前后的正确样本菌液和以诱导前后的空载体pet28a菌液进行sds-page凝胶电泳，结果表明iptg能够诱导抗ibv纳米抗体在pet28a中的表达。
3、纯化蛋白
将诱导表达后的菌液5000rpm，离心15min弃上清；用冰的1×pbs(ph7.4)缓冲液重悬，3500g，离心10min弃上清。用40ml的裂解液，涡旋震荡重悬，置于冰上，放到超声波细胞粉碎仪中，按超声发振时间3s，间隙时间3s的程序超声破碎20min，将破碎后的菌液12000rpm，离心20min，将上清液进行亲和层析纯化，保存备用。
实施例5、ibv纳米抗体酶联免疫活性检测
纯化的ibv抗原用cbs缓冲液ph(9.6)稀释到2ng/μl，按每孔100μl加入到酶标板中，4℃过夜，第二天进行elisa实验，elisa步骤如下：
1）按每孔200μl的pbst加入包被后的酶标板进行清洗，洗5次，每次1min，甩掉洗涤液，在纸巾上拍干；
2）按每孔200μl向酶标板中加入1%bsa封闭液，37℃封闭2h；
3）按步骤1进行洗板，依次将100μl的空白对照、阴性对照、纯化后的抗ibv纳米抗体加入到酶标板中，37℃孵育1h；
4）按步骤1中进行洗板，然后，按每孔100μl向酶标板加入hrp标记的his标签抗体，室温孵育1h；
5）按步骤1中进行洗涤，然后向每孔加入100μl的tmb，避光放置5min；
6）向每孔加入100μl的2mol/l的硫酸溶液，终止反应，将酶标板放于酶标仪中，od450nm读数。
其中，阴性对照为未连接抗体基因的空载体培养液，孔板对照为pbs洗液。鉴定结果如图7所示，纳米抗体具有与ibv结合的能力。
序列表
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