本发明属于基因工程领域，尤其是植物基因工程领域。具体而言，本发明涉及二甲基亚砜(dmso)在植物遗传转化技术中的应用，其用于实时荧光定量pcr(qpcr)的研究，并改进了基于qpcr的拷贝数分析在植物中的应用。
背景技术：
植物遗传转化是一种广泛应用于作物改造和基因功能研究的的技术，通常导入基因在作物中的表达水平和生物学性状与其拷贝数的多少密切相关。传统的southern杂交法[1]作为一种绝对定量的方法，具有准确性高的优点，但由于其工作量大、周期长，并不适用于早期转化植株拷贝数的快速鉴定。近几年兴起的数字pcr(ddpcr，digitaldropletpcr)技术[2][3]，虽然可以实现精准的绝对定量，但它基于对dna样品进行准确的浓度稀释，不易实现高通量样品制备。
实时荧光定量pcr(qpcr)方法中的taqman探针法，是一种常用的利用taqdna聚合酶的5′核酸酶活性的实时荧光定量方法。taqman探针组由一条正向引物、一条反向引物和一条在5′端标记报告基团及3′端标记猝灭基团的探针组成。基于taqman探针法的qpcr反应大致可分为：双链dna在高温条件下变性解离成单链dna；探针和引物与模板特异性结合；被激活的taqdna聚合酶起始dna链的合成；随着dna链的延伸，taqdna聚合酶的5′核酸酶活性将下游结合的taqman探针分解；taqman探针5′端标记的报告基团与3′端的猝灭基团分离，从而发出荧光信号；实时荧光定量pcr仪的检测器通过接收荧光信号对其进行定量。
随着植物遗传转化技术的普及和广泛应用，对转基因植株拷贝数的快速检测提出了更高的要求。qpcr[4]作为一种相对定量的方法，由于可以使用内参基因实现dna样品的快速均一化，具有高通量、快速、灵敏的检测基因拷贝数的特点，得到广泛的认可和应用。与此同时，低成本、高通量基因组dna的提取方法，高通量样品制备方法，也对qpcr提出了挑战。
对于不同质量的dna或不同gc含量的基因序列，pcr体系需要进行优化，其中常用的方法就是添加相应浓度的化学试剂。虽然有文章报道，一些化学试剂，如dmso、甜菜碱等，可以提高pcr的特异性、产量和成功率，但仅限于针对终端pcr(end-pointpcr，即pcr反应结束后检测pcr产物的量)的研究。
早在1990年，bachmann等就报道了利用二甲基亚砜和非离子洗脱剂改进pcr扩增[5]。随后，甜菜碱被报道可以提高高gc含量基因的pcr扩增[6]。2006年，musso等利用dmso、甜菜碱和7-脱氮-2-脱氧鸟苷三磷酸扩增gc含量高达67％到79％的基因序列[7]。2010年，jensen等报道dmso和甜菜碱可以减少dna二级结构的形成和扩增的引导错误，从而大大提高了高gc含量基因pcr扩增过程中特异性和产量，而且具有很好的兼容性[8]。除此以外，牛血清白蛋白(bsa)[9]、甲酰胺[10]等，也可以提高pcr的特异性和产量，并最终提高pcr的成功率。
而这些报道大多数是针对终端pcr展开的。迄今为止，尚无关于二甲基亚砜(dmso)在实时荧光定量pcr(qpcr)中的应用。
本申请则首次报道了二甲基亚砜(dmso)在实时荧光定量pcr(qpcr)中的应用，提高了基于qpcr的拷贝数分析的精确度，并改进了基于qpcr的拷贝数分析在植物中的应用。
技术实现要素：
本发明的发明人首次发现将dmso添加至实时荧光定量pcr(qpcr)的反应体系中可改进基于实时荧光定量pcr的基因拷贝数分析，由此完成了本发明。
本发明的第一方面涉及二甲基亚砜在改进基于实时荧光定量pcr(qpcr)的基因拷贝数分析中的应用。在一个实施方案中，二甲基亚砜的加入，可以同时改进内参基因和目的基因探针组在不同样品中的pcr扩增效率(以最大限度接近理想的扩增效率)，从而改进了基因拷贝数分析中样品的数据组，例如改进不同拷贝数的数据集合的彼此分离程度。在一个实施方案中，二甲基亚砜的加入，使样品定位在更加准确的数据集合，且更多的样品定位在了低拷贝(即1个拷贝)数据集合，从而提高了基因拷贝数分析中低拷贝(即1个拷贝)数据集合的比例。
本发明通过向qpcr反应体系添加二甲基亚砜来改进基于qpcr的基因拷贝数分析。例如，本发明可以向通常的qpcr反应体系添加二甲基亚砜并采用通常的反应参数。例如，可采用两步扩增法，即95℃变性20-30s，60℃退火延伸30s，同时接收荧光信号。循环数一般为40-50。在一个实施方式中，本发明采用下文表3所示的反应程序。
在一个具体实施方案中，二甲基亚砜在qpcr反应体系中的浓度为2.5-7.5％v/v，优选5-7.5％v/v，最优选5％v/v。数据显示，5％v/v的dmso对于测试的不同植物品种和目的基因以及不同的探针组均能够显著改善基于qpcr的拷贝数分析。
在一个具体实施方案中，所述基因拷贝数分析为在植物中的基因拷贝数分析。植物可以是水稻或玉米，例如粳稻或籼稻。
在一个具体实施方案中，所分析的基因可以为pmi、gus或red基因。在一个更加具体的实施方式中，pmi、gus或red基因的引物和探针序列如下文表2所示。
测定基因的拷贝数通常通过相对定量的方法，即同一dna模板、两个完全独立的扩增反应(包括内参基因和目的基因)，其中目的基因起始量与内参基因起始量的比值即为目的基因的拷贝数。
内参基因的选择通常选取生物体内源的低拷贝基因，如玉米的乙醇脱氢酶基因、大豆的凝集素基因、水稻的蔗糖磷酸合酶基因及一些内源性管家基因如β-肌动蛋白和β2-微球蛋白等。
可遵循本领域已知的原则设计可用于本发明的引物和探针，并选择引物和探针的长度。
在一个更加具体的实施方式中，本发明的内参基因选自下文表1所示的osadh1和zmadh1，其相应的引物和探针组可如表1所示。在一个更加具体的实施方式中，当目的基因及其相应的引物和探针序列如表2所示时，其内参基因和相应的引物和探针序列可选自表1所示的内参基因和相应的相应的引物和探针序列。
本发明的另一方面涉及一种改进基于实时荧光定量pcr(qpcr)的基因拷贝数分析的方法，其包括向qpcr反应体系添加二甲基亚砜。
发明的有益效果
本研究中，本发明人令人惊讶地发现dmso相比于其它试剂可显著改进基于实时荧光定量pcr(qpcr)的基因拷贝数分析。本发明人进一步发现，5％和7.5％浓度(v/v)的dmso在水稻拷贝数分析中，可以改进植物样品的数据组(1个拷贝和2个拷贝的数据集合分离的更加清晰)，但是7.5％浓度的dmso荧光信号强度较5％有所降低；由于更多的样品点汇聚在1个拷贝的数据集合，使水稻中的低拷贝比例从＜10％提高到＞20％。在玉米np2222中的数据表明，5％浓度的dmso虽然没有明显提高低拷贝比例的作用(从29％提高到32％)，但更加清晰的样品数据组使拷贝数分析更加简单和准确。数据显示，5％浓度(v/v)的dmso对于测试的不同植物品种和目的基因以及不同的探针组均能够显著改善基于qpcr的拷贝数分析。
本研究首次利用dmso改进基于qpcr的拷贝数分析在植物中的应用，具有开创性的意义。
附图说明
图1为植物中外源基因拷贝数分析示意图。
图2显示在0％v/v、2.5％v/v、5％v/v、7.5％v/v和10％v/vdmso浓度下pmi基因探针组在粳稻中拷贝数分析的数据组。
图3显示在2.5％v/v、5％v/v、7.5％v/v和10％v/vdmso浓度下内参基因(tet)和pmi基因(fam)探针组在粳稻中拷贝数分析的荧光信号强度。
图4显示在0％和5％v/vdmso浓度下gus基因和red基因探针组在粳稻中拷贝数分析的数据组。
图5显示在0％和5％v/vdmso浓度下pmi基因和red基因探针组在玉米中拷贝数分析的数据组。
图6显示在0m、0.8m、1m、1.3m和1.6m甜菜碱浓度下pmi基因探针组在水稻中拷贝数分析的数据组。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1.材料与方法
材料
转基因材料：籼稻、粳稻和玉米np2222的t0代转化植株。
试剂：jumpstarttmtaqreadymixtm(sigma-aldrich)、植物基因组dna、内参基因和目的基因引物探针组(引物终浓度为300nm，探针终浓度为100nm)、dmso和无核酸酶的纯净水。除非特殊说明，本申请中dmso的浓度为体积百分比浓度(％v/v)。
方法
植物基因组dna提取：采用改进的tris-sds法[11]。每株植物取大约10mg的叶片放入96孔深孔板，提取前需在-80℃超低温冰箱中保存30分钟以上。
引物和探针：本文中使用的内参基因和目的基因的taqman引物和探针均利用美国appliedbiosystem公司的primerexpress3.0软件设计，并由invitrogen公司合成，序列信息见表1和表2。
表1内参基因实时荧光定量pcr的引物和探针序列
表2目的基因实时荧光定量pcr的引物和探针序列
实时荧光定量pcr(qpcr)反应体系和反应条件
反应体系：qpcr反应总体系为25μl，其中含有12.5μljumpstarttmtaqreadymixtm、5μl植物基因组dna、各0.4μl内参基因和目的基因引物探针组(引物终浓度为300nm，探针终浓度为100nm)、0％至10％浓度(v/v)的dmso和无核酸酶的纯净水。
反应程序：taqman实时荧光定量pcr使用标准制式的applied
表3pcr反应程序
一个拷贝阳性对照的制备：选取之前样品中拷贝数为1的植物样品(部分探针组无一个拷贝阳性对照，如图4中的red探针组)，提取基因组dna，再对其进行以下梯度稀释：1∶1、1∶2、1∶4、1∶8(见图1中的绿点(大圆形点))。该样品将作为拷贝数分析的参照(部分稀释样品可能有所偏离，或由于浓度较低无法显示在图中)，但最终以实际数据集合的分离作为拷贝数分析的依据。
数据分析：pcr结束后，使用sds2.4软件分析结果。pcr反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，将荧光阈值(threshold)设置在所有扩增曲线的指数型区域内，每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数即为ct值(cyclethreshold，循环阈值)，将基线结束点(baselineendcycle)设置在阈值线穿过第一条扩增曲线时的循环数的前3-5个循环(如：最早的ct＝24，那么基线为24-3＝21)，将数据导出，用于下一步相对定量分析。导出的数据中包含内参基因和目的基因的ct值，标记为cttet和ctfam，通过这两个数值可以将每个样品定位在xy坐标轴的一个点(见图1中的蓝点(方形点))，所有样品的点形成了数据组(见图1中所有蓝点(方形点))。该数据组可包含多个数据集合(1个拷贝集合，2个拷贝集合，3个拷贝集合，等)，分别与图中的三条通过数学模拟可移动的1个拷贝、2个拷贝和3个拷贝的线相重合。参照一个拷贝阳性对照的数据和所有样品数据组中的1个拷贝集合的数据，设定为1个拷贝对照的点(图1中的黄点(小圆形点))。
拷贝数计算：采用相对定量δδct法计算目的基因的拷贝数。由于在pcr的指数扩增时期，荧光信号的量与样品的初始浓度成正比，因此样品中目的基因相对于内参基因的数量为2^ctfam样品/2^cttet样品＝2^(ctfam样品-cttet样品)，即2^δct样品。通过分析一个拷贝阳性对照的数据，可以设定一个拷贝阳性对照中目的基因相对于内参基因的数量为2^δct对照，即1拷贝＝2^δct对照，由此样品中目的基因的拷贝数计算公式为：拷贝数＝(2^δct样品)/(2^δct对照)＝2^δδct。
实施例2.不同浓度dmso对样品数据组、扩增曲线和荧光信号强度δrn的影响
为了确定dmso的最佳工作浓度，首先选用了pmi基因探针组在粳稻中测试了一系列的浓度梯度，分别为0％、2.5％、5％、7.5％和10％(见图2)。图2中样品数据组显示，在5％、7.5％和10％浓度的dmso体系下更多的样品汇集在了1拷贝数据集合，且与1拷贝阳性对照重合的更好。而0％和2.5％v/v浓度dmso体系下的样品则汇集的较为松散，且有很少的样品与1拷贝阳性对照重合。不同浓度dmso对qpcr的扩增曲线也有不同程度的影响。如图3所示，随着dmso浓度从2.5％v/v、5％v/v、7.5％v/v到10％v/v的增加，内参基因和pmi基因探针组的扩增曲线均变得松散且更快的到达平台期，终点的荧光信号强度降低，尤其是目的基因pmi探针组表现的尤为明显。因此，参照样品的数据组、扩增曲线和荧光信号强度，选择5％浓度的dmso体系是比较好的工作浓度。
为了验证不同的探针组在5％v/v浓度dmso体系中的表现，使用了gus基因和red基因探针组进行了测试。如图4显示，在5％浓度(v/v)dmso体系中，这两个探针组均有更好的数据组，更多的样品点汇聚在1个拷贝数据集合，且其扩增曲线和荧光信号强度也较为正常(数据未显示)。
在玉米np2222中的数据显示(图5)，5％v/vdmso对样品数据组的改进虽然不如在水稻中明显，但仍然可以看到分离更加清楚的数据集合，使得拷贝数分析更加简单准确。
实施例3.5％v/v浓度dmso对转基因植株中低拷贝(1个拷贝)比例的影响
通过在水稻和玉米中qpcr中使用5％v/vdmso后，进行了低拷贝(1个拷贝)比例的统计。如表4所示，在粳稻中低拷贝比例由7.5％提高到了25％，籼稻则由10％提高到了22％。在玉米中，低拷贝比例没有明显变化(29％到32％)。
表40％和5％dmso对水稻和玉米拷贝数分析中低拷贝(1个拷贝)的比例
dmso对pcr扩增效率的影响
基于qpcr的拷贝数分析对pcr的扩增要求相对较高，除了要求单个探针组的效率在0.9至1.1之间外，还要求内参基因和目的基因探针组之间的差异控制在一定范围(斜率差＜0.2)。如表5和表6所示，在5％v/v和7.5％v/v浓度dmso体系中，两个探针组的pcr效率和之间的斜率差(differenceofslop)均可以达到拷贝数分析的要求。
表50％、5％v/v和7.5％v/v浓度dmso体系下内参基因和pmi探针组的qpcr效率及其之间的差异
表60％、5％v/v和7.5％v/v浓度dmso体系下内参基因和red探针组的qpcr效率及其之间的差异
实施例4.不同浓度甜菜碱对基于qpcr的拷贝数分析的影响及与dmso的比较
为了测试dmso之外其他试剂，我们选用了甜菜碱并测试了在om，0.8m，1m，1.3m，1.6m浓度下对pmi探针组qpcr的影响(见图6)。图6中样品数据组显示，虽然在1m和1.3m浓度的甜菜碱体系下数据组稍有改进但是效果不如5％浓度dmso明显，且不同探针组下表现不稳定(数据未显示)。因此，相比较dmso，甜菜碱改进基于qpcr的记忆拷贝数分析所表现的效果不明显且不稳定。
以上结果表明，dmso显著地改进了基于实时荧光定量pcr(qpcr)的基因拷贝数分析。其中，5％和7.5％浓度(v/v)的dmso在水稻拷贝数分析中，可以改进植物样品的数据组(1个拷贝和2个拷贝的数据集合分离的更加清晰)；由于更多的样品点汇聚在1个拷贝的数据集合，使水稻中的低拷贝比例从＜10％提高到＞20％。在玉米np2222中的数据表明，5％浓度(v/v)的dmso虽然没有明显提高低拷贝比例的作用(从29％提高到32％)，但更加清晰的样品数据组使拷贝数分析更加简单和准确。综上所述，5％浓度(v/v)的dmso对于测试的不同植物品种和目的基因以及不同的探针组均能够显著改善基于qpcr的拷贝数分析。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
参考文献
[1]southerne.m.(1975)detectionofspecificsequencesamongdnafragmentsseparatedbygelelectrophoresis.journalofmolecularbiology98，503-517.
[2]hindsonb.j.，nessk.d.，masquelierd.a.，belgraderp.，heredian.j.，makarewicza.j.&colstonb.w.(2011)high-throughputdropletdigitalpcrsystemforabsolutequantitationofdnacopynumber.analyticalchemistry83，8604-8610.
[3]hindsonc.m.，chevilletj.r.，briggsh.a.，gallichottee.n.，rufi.k.，hindsonb.j.&tewarim.(2013)absolutequantificationbydropletdigitalpcrversusanalogreal-timepcr.naturemethods10，1003-1005.
[4]ingham，dj.，beer，s.，money，s.，hanseng.(2001)quantitativereal-timepcrassayfordeterminingtransgenecopynumberintransformedplants.biotechniques31，132-140.
[5]b.bachmann，w.luke，g.hunsmann，improvementofpcramplifieddnasequencingwiththeaidofdetergents，nucleicacidsres.18(1990)1309.
[6]w.henke，k.herdel，k.jung，d.schnorr，s.a.loening，betaineimprovesthepcramplificationofgc-richdnasequences，nucl..acidsres.25(1997)3957-3958.
[7]m.musso，r.bocciardi，s.parodi，r.ravazzolo，i.ceccherini，betaine，dimethylsulfoxide，and7-deaza-dgtp，apowerfulmixtureforamplificationofgc-richdnasequences，j.mol.diagn.8(2006)544-550.
[8]jensen，m.，fukushima，m.anddavis，r.(2010)dmsoandbetainegreatlyimproveamplificationofgc-richconstructsindenovosynthesis.plosone5(2010)11024.
[9]c.a.kreader，reliefofamplificationinhibitioninpcrwithbovineserumalbuminort4gene32protein，appl.environ.microbiol.62(1996)1102-1106.
[10]r.chakrabarti，c.e.schutt，theenhancementofpcramplificationbylowmolecularweightamides，nucleicacidsres.29(2001)2377-2381.
[11]lih，lij，congxh，duanyb，lil，weipc，luxz，yangjb.ahigh-throughput，high-qualityplantgenomicdnaextractionprotocol.genetmolres.2013oct15；12(4)：4526-39.