本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种taqman-mgb探针法检测人类tpmt基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
巯嘌呤类药物如6-巯基嘌呤(mercaptopurine，6-mp)、6-硫鸟嘌呤(thioguanine，6-tg)和硫唑嘌呤(azathioprine，azp)等是一类具有免疫抑制作用的抗代谢药。6-tg和6-mp常用于恶性肿瘤的化疗，azp则主要用于自身免疫性疾病及器官移植患者。azp作为前体药物在肝脏经谷胱甘肽转移酶转化为6-mp。6-mp经次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶代谢为巯基次黄嘌呤单磷酸盐(thioinosinemonophosphate，timp)，后者再经过一系列的过程代谢为活性代谢产物6-硫鸟嘌呤核苷酸(6-thioguaninenucleotide，6-tgn)后发挥抗肿瘤作用。6-mp也可经tpmt代谢为无活性的6-甲巯基嘌呤(6-methylmp，6-mmp)。tpmt的活性与红细胞及造血组织中6-mp活性代谢产物6-tng的水平呈负相关，tpmt活性降低可使巯嘌呤类药物的造血系统毒性(严重的骨髓抑制)增加。
tpmt酶活性分布存在多态性现象，tpmt遗传变异是导致其酶活性降低的主要原因。正常活性的tpmt由tpmt*1等位基因编码，tpmt*2(rs1800462，238g>c，ala80pro)、tpmt*3a(rs1800460460g>a，ala154thr；rs1142345，719a>g，tyr240cys)、tpmt*3b(rs1800460460g>a，ala154thr)、tpmt*3c(rs1142345，719a>g，tyr240cys)是导致tpmt活性下降的主要snp或单倍型。tpmt基因型可分为3种：野生型纯合子(tpmt*1/*1)、杂合子和突变纯合子。野生型纯合子个体具有正常的tpmt活性，杂合子个体tpmt活性降低，而突变纯合子tpmt酶活性极低甚至缺乏。此外，2种突变等位基因纯合子(tpmt*2/tpmt*3a和tpmt*3a/tpmt*3c)个体也缺乏酶活性。在白种人群和非裔美国人群中，野生型纯合子基因型的频率约90％，突变杂合子基因型的频率约10％，突变纯合子基因型的频率约0.3％。中国人群中tpmt*3杂合子基因型频率约2.2％，未检测到tpmt*2等位基因。tpmt基因多态性与嘌呤类药物的治疗效果和毒副作用密切相关，医生应结合tpmt基因型慎重使用嘌呤类药物。
目前针对多态性位点分析的方法主要有pcr-限制性片段长度多态性(pcr-restrictionlengthpolymorphism，pcr-rflp)、扩增阻滞突变系统-pcr(amplificationrefractorymutationsystempcr，arms-pcr)、飞行质谱等，但是由于这些方法操作步骤多，费时费力，或者需要pcr后处理，易产生污染，因此不适用于人群大规模的快速检测。测序法是核酸测序的金标准，虽然准确，但是操作步骤繁琐且成本较高。本发明，采用taqman-mgb探针技术，发明了一种快速、准确的基因分型方法和试剂盒，可以为药物的个体化治疗起到积极的推动作用。该技术不仅实现了对核酸特异性扩增的实时监测，而且具有灵敏度和特异性高、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种taqman-mgb探针法检测人类tpmt基因多态性的试剂盒及其方法。本发明为药物的个体化治疗起到积极的推动作用。该技术不仅实现了对核酸特异性扩增的实时监测，而且具有灵敏度和特异性高、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种taqman-mgb探针法检测人类tpmt基因多态性的引物，包括如下核酸序列：
(1)扩增tpmt基因rs1142345多态性位点的引物对，其核苷酸序列seqidno.：1和seqidno.：2所示；
(2)用于检测tpmt基因rs1142345多态性位点的taqman-mgb探针，其核苷酸序列seqidno.：3和seqidno.：4所示，其中seqidno.：3在5末端标记fam信号，seqidno.：4在5末端标记vic信号；
上述引物对和荧光探针对在一次检测中共同使用。
上述taqman-mgb探针法检测人类tpmt基因多态性的引物在检测tpmt基因多态性中的应用在本发明的保护范围之内。
本发明还提供一种taqman-mgb探针法用于检测人类tpmt基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针以及2xpcr反应混合液，阳性标准品。
本发明还提供另一种技术方案：一种taqman-mgb探针法用于检测人类tpmt基因多态性的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)提取人外周血基因组dna；
(2)分别以提取的人外周血基因组dna和阳性标准品为模板、引物、探针、pcr反应混合液，进行实时荧光定量pcr反应；
(3)根据检测到的荧光信号值对rs1142345位点进行基因型判定。
进一步地，所述步骤(2)中，实时荧光定量pcr反应的扩增体系为：总体积20μl，2xpcr反应混合液10ul，seqidno.：10.2um，seqidno.：2，0.2um，seqidno.：10.2um，seqidno.：10.2um，模板dna50ng。
更进一步地，所述步骤(2)中，实时荧光定量pcr反应中的扩增程序为：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集荧光，40个循环。
本发明提供了一种taqman-mgb探针法检测人类tpmt基因多态性的引物和试剂盒，采用taqman-mgb探针法实现了对tpmt基因rs1142345位点进行快速、简单的检测。本发明检测结果准确，易于判读。与测序法相比，该方法不需要对pcr产物进行一系列复杂的后续处理，pcr扩增和检测同步进行，整个检测过程无需开盖操作，降低了pcr产物造成污染的风险，大大缩短了检测时间，降低了检测成本。
附图说明
图1为不同基因型对应的结果示图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
步骤1：dna提取
取200μl外周血，按照全血基因组dna提取试剂盒说明书进行dna提取(购自杭州新捷生物科技有限公司)，提取dna用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：定量pcr扩增和检测
(1)扩增tpmt基因rs1142345多态性位点的引物对，其核苷酸序列seqidno.：1和
seqidno.：2所示；
(2)用于检测tpmt基因rs1142345多态性位点的taqman-mgb探针，其核苷酸序列seqidno.：3和seqidno.：4所示，其中seqidno.：3在5末端标记fam信号，seqidno.：4在5末端标记vic信号。
在96孔板中，配制如下反应体系：2xpcr反应混合液10ul，seqidno.：10.2um，seqidno.：20.2um，seqidno.：30.2um，seqidno.：40.2um，模板dna50ng，加水补足至总体积20μl，同时设立阳性标准品和阴性对照。实时荧光定量pcr反应中的扩增程序为：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集荧光，40个循环。
步骤3：结果分析
反应结束后，应用仪器自带软件进行数据分析。根据扩增结果，对标本基因型进行判定，具体检测结果见下表。
步骤4：结果统计
10例标本的基因型结果统计如下：
以上所述，是本发明较佳的实施例，并非本发明任何形式上或实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的技术人员，在不脱离本发明的范围前提下，还可以对之做一些修改和改进，这些改进和补充也应该视为本发明的保护范围。
序列表
<110>济南迪安医学检验中心有限公司
<120>一种taqman-mgb探针法检测人类tpmt基因多态性的试剂盒及方法
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cgttgtcttgagaaggttgatg22
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tcctcaaaaacatgtcagtgtg22
<210>3
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
ttgaaaagttatatctactttg22
<210>4
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ttgaaaagttatgtctactttg22
<210>5
<211>141
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
cgttgtcttgagaaggttgatgcttttgaagaacgacataaaagttggggaattgactgt60
ctttttgaaaagttatatctacttacagaaaagtaaatgagacatagataaaataaaatc120
acactgacatgtttttgagga141
<210>6
<211>141
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
cgttgtcttgagaaggttgatgcttttgaagaacgacataaaagttggggaattgactgt60
ctttttgaaaagttatgtctacttacagaaaagtaaatgagacatagataaaataaaatc120
acactgacatgtttttgagga141