本发明涉及溯源检测领域，具体而言，涉及一种用于肉牛个体及品种鉴定的aflp引物组合产品、试剂盒及方法。
背景技术：
：近年，在肉类市场经常出现仿冒品牌、仿冒产地，利用低价值产品冒充高价值产品的现象，不仅扰乱了市场秩序，侵犯了消费者权益，而且还可能因为过敏等问题导致消费者的健康风险。我国虽已实施了肉类产品的可追溯管理和应用体系，但是由于主要是以动物佩戴电子耳标和条码技术进行溯源和管理。一方面电子耳标易脱落，造成信息的缺失，另一方面，动物屠宰后耳标与胴体分开，仅依靠条码技术，难以保证产品信息的真实性。因此需要开发一种行之有效的方法对市场上的牛肉来源进行鉴别与溯源。扩增片段长度多态性技术(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，aflp)通过选择性扩增基因组dna的酶切片段，由于不同基因组dna的酶切位点存在差异，因而产生了扩增片段长度的多态性，进而可以将不同的动物品种甚至个体及品种加以区分开。aflp兼具rflp技术的可靠性及pcr技术的高效性，有可同时对多位点进行检测、重复性好、信息量大、符合孟德尔遗传的特点，非常适合动物个体及品种的鉴定应用方面。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种aflp引物组合产品，包含该引物产品的试剂盒以及基于该试剂盒的肉牛个体及品种鉴定方法，以解决上述问题。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：本发明涉及一种用于肉牛个体及品种鉴定的aflp引物组合产品，其包含选自下列的序列中的至少两条：seqidno:1～8所示核苷酸序列。根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于肉牛个体及品种鉴定的试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的引物组合产品、限制性内切酶、接头序列以及预扩增引物。根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于肉牛个体及品种鉴定的方法，包括：使用如上所述的试剂盒对待检样本的dna依次进行aflp酶切与连接反应、连接产物的预扩增以及对预扩增产物的选择性扩增，并检测aflp的选择性扩增产物。本发明所提供的用于肉牛个体及品种鉴定的aflp引物组合产品、试剂盒及方法，能够便利、精确地进行肉牛的个体及品种鉴定，进一步用于肉牛个体及品种的溯源，保证食品安全。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例2中aflp引物组合对于肉牛品种的鉴定效果注：a-安多牦牛，hn-日本和牛，lm-利木赞牛，jx-郏县红牛，n-南阳黄牛，lx-鲁西黄牛。具体实施方式本发明涉及一种用于肉牛个体及品种鉴定的aflp引物组合产品，其包含选自下列的序列中的至少两条：seqidno:1～8所示核苷酸序列。优选的，如上所述的引物组合产品，其包含选自下列的引物对中的一对或多对：seqidno:2和6、seqidno:2和5、seqidno:2和8、seqidno:1和7、seqidno:1和8、seqidno:3和6、seqidno:3和5以及seqidno:3和8。优选的，如上所述的引物组合产品，每对引物对中的至少一条引物被荧光染料所标记；优选的，所述荧光染料选自fam、fitc、sybrgreenⅰ、hex、vic、joe、tamra、tet、rox、cy3、cy5、texas-red、pet、ned、alexafluor、dylight和ftm中的一种或多种；更优选的，所述荧光基团选自fam、hex、vic或joe中的一种或多种。根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于肉牛个体及品种鉴定的试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的引物组合产品、限制性内切酶、接头序列以及预扩增引物。优选的，如上所述的试剂盒，所述限制性内切酶包括ecorⅰ以及mseⅰ；所述ecorⅰ对应的接头序列的核苷酸序列分别如seqidno:9和10所示；所述mseⅰ对应的接头序列的核苷酸序列分别如seqidno:11和12所示。优选的，如上所述的试剂盒，所述预扩增引物的核苷酸序列分别如seqidno:13和14所示。优选的，如上所述的试剂盒，所述试剂盒还包括：dna聚合酶、dna连接酶、水、atp、dntps、pcr反应缓冲液以及酶切缓冲液中的一种或多种；优选的，所述dna聚合酶选自taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4dna聚合酶、klenow片段；更优选地，所述dna聚合酶为hstmtaqdna聚合酶；优选的，所述dna连接酶为t4dna连接酶、t3dna连接酶、t7dna连接酶、e.colidna连接酶、taqdna连接酶和9°ndna连接酶；优选地，所述水选自双蒸水或去离子水。根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于肉牛个体及品种鉴定的方法，包括：使用如上所述的试剂盒对待检样本的dna依次进行aflp酶切与连接反应、连接产物的预扩增以及对预扩增产物的选择性扩增，并检测aflp的选择性扩增产物。优选的，所述待检样本选自组织、血液、唾液、精液、骨骼或毛发；优选为组织(特别是结蹄组织或脂肪组织)。优选地，所述待检样本的dna通过饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法提取。优选的，如上所述的方法，在进行所述选择性扩增时，退火温度为54℃～58℃。优选的，如上所述的方法，所述检测aflp的选择性扩增产物的方法包括：毛细管电泳分离、聚丙烯酰胺凝胶电泳串联银染技术进行分离、dna测序仪进行分离；优选为dna测序仪进行分离；更优选的，所述dna测序仪为abi3730xl全自动dna测序仪。利用dna测序仪进行aflp片段的分离和分型，规避了变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显色带来的误差，提高了鉴定的准确性。下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1本实施例提供了将aflp技术用于肉牛个体的鉴别的一个实例。1、样本采集及基因组dna提取采集日本和牛肉样15个、郏县红牛肉样16个、南阳黄牛肉样12个、鲁西黄牛肉样22个、利木赞牛肉样16个、安多牦牛肉样16个共计90个牛肉样品。分别提取基因组dna，其中利木赞牛肉样本有4个样本(编号分别为11、13、15、16)，日本和牛有3个样本(编号分别为1、2、3)dna效果差，最后舍去。dna提取采用thermo#k0512dna提取试剂盒提取。具体步骤如下：1)取30mg组织样品，置于1.5ml离心管中，加入200μlte。200μl组织样品中加入400μl溶胞液(lysissolution)，65℃孵化5min。(冻存样品：解冻前加入400μllysissolution，倒置，65℃孵化10min。)2)立刻加入600μl氯仿，倒转3-5次使乳化，10000rpm离心2min。3)配制沉淀试剂：720μlddh2o+80μl(10*)precipilationsolution。4)转移含dna的上层水相至新ep管中，加800μl新配的沉淀试剂，室温下来回倒置混合1-2min，10000rpm离心2min。5)彻底除去上清(勿干燥)，并用100μlnacl涡旋，溶解dna沉淀(需完全溶解)。6)加300μl冷乙醇(-20℃)，让dna沉淀(-20℃沉淀20min)，10000rpm离心4min，弃去乙醇。70％冷乙醇清洗沉淀一次，最后用100μlddh2o溶解dna。7)用nanodrop2000c测dna浓度，0.8％琼脂糖凝胶电泳测定dna片段完整性，合格样本-20℃保存备用，不合格样本重新提取基因组dna。2、引物序列设计aflp接头和二次扩增的引物序列，具体下表：表1酶及接头序列表2预扩增引物序列引物名称引物序列e00seqidno:13m00seqidno:14表3选择性引物及对应的荧光标记引物名称seqidno荧光e33(e00-aag)1hexe042fame393fame44(e00-atc)4famm44(m00-cag)5m06(m00-cta)6m487m49(m00-cca)83、aflp反应条件1)模板dna的酶切及链接每个反应总体积为30μl体系，具体组分比例见表4。表4酶切反应体系反应程序为37℃，12h，结束后混匀体系，离心片刻后于65℃保温10min，后-20℃保存备用。2)dna片段的预扩增每个反应总体积为20μl体系，具体组分比例见表8。反应程序见表9。表5预扩增pcr体系表6预扩增pcr反应程序3)aflp选择性扩增每个反应总体积为20μl体系，具体组分比例见表7。反应程序见表8。表7选择性扩增pcr体系表8选择性扩增pcr反应程序4、上机检测及aflp谱图分析1)上机检测采用abi3730xl测序仪对荧光标记的dna片段进行检测，结合分子量内标进行dna片段长度计算。具体如下：(1)96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液(0.5：8.5)9μl，pcr产物1.0μl；(2)95℃变性3min，上机检测；(3)得到下机数据fsa文件；2)将检测得到的原始数据文件导入到genemapper5.0中进行分析。统计不同迁移率处的扩增片段的有无，分别以1和0代表。将获得的aflp指纹图谱转换为1和0构成的数字矩阵，得到不同个体的aflp指纹图谱。同时，计算受试样本中出现的所有迁移率不同的扩增谱带数目、多态性谱带数目及其比例。并计算个引物组合对受试个体的区分效果。同时采用upgma法对所有样本进行聚类分析，考察引物组合对于个体的区分效果。5、结果分析1)选择性扩增组合确定随机选取6个品种中的12个模板，对16对荧光引物组合进行筛选，并优化pcr反应条件，经过多次重复，最后筛选出8对多态性较高、带型质量较好、分辨率较高的引物组合，具体见表9。表9选择性引物组合组名引物组合1e04m062e04m443e04m494e33m485e33m496e39m067e39m448e39m492)8对引物组合扩增结果统计及用于肉牛个体的区别效果采用8对引物对90个受试样本进行检测，如表10所示，每对引物平均扩增出575.6个条带，多态百分率为92.3％。另外，计算每对引物对于受试样本的个体区分率能力，8对引物对于样本的区分率均是97.8％。表108对aflp引物的在所有受试个体中的扩增结果引物组合扩增总带数多态性谱带数多态性百分率％区分率/％e04m0658055695.997.8e04m4461058195.297.8e04m4960057796.297.8e33m4852449394.197.8e33m4953048290.997.8e39m0657950887.797.8e39m4457847682.497.8e39m4960457995.997.8均值575.6531.592.397.8采用upgma法对样本进行聚类分析，当仅使用1对引物组合e39m49时，对6个品种的90个个体的区分效果，除了鲁西黄牛群体中有两个样本18号和21号两个样本没有分开外，其他样本均能很好的彼此分开。这就为肉牛的个体鉴定提供极大便利，进一步用于个体的溯源，保证食品安全。实施例2本实施例提供了一个aflp技术用于肉牛品种鉴别的实例。1、参考实施例1中的方法进行样本采集及基因组dna提取并进行aflp反应。2、上机检测及aflp谱图分析1)上机检测采用abi3730xl测序仪对荧光标记的dna片段进行检测，结合分子量内标进行dna片段长度计算。具体操作同前。2)将检测得到的原始数据文件导入到genemapper5.0中进行分析。统计不同迁移率处的扩增片段的有无，分别以1和0代表。将获得的aflp指纹图谱转换为1和0构成的数字矩阵，得到不同个体的aflp指纹图谱。同时采用simca软件对样本进行pls-da分析。考察不同引物组合对于牛品种的区分效果。3、结果分析1)选择性扩增组合确定随机选取6个品种中的12个模板，对16对荧光引物组合进行筛选，并优化pcr反应条件，经过多次重复，最后筛选出8对多态性较高、带型质量较好、分辨率较高的引物组合，具体见表9。2)8对引物组合扩增结果统计分别统计不同品种牛的特异性片段，见表11。表11不同品种牛特异性片段3)8对引物组合用于肉牛品种的区别效果采用simca软件对样本进行pls-da分析，当仅使用1对引物组合e04m06时，对受试的样本进行区分，见图1。可以看到，利木赞牛、日本和牛、安多牦牛及其他三个品种(郏县红牛、南阳黄牛和鲁西黄牛)可以很好的加以区分开。由于郏县红牛、南阳黄牛和鲁西黄牛同属中国本地有着悠久历史的黄牛品种，且由于所属地理位置较近，不可避免的存在遗传物质交流，所以该三个品种聚集在了一起。同样我们利用其他七组引物e04m44、e04m49、e33m48、e33m49、e39m06、e39m44、e39m49也可以将利木赞牛、日本和牛、安多牦牛及本地黄牛品种很好的区分开。可见，aflp用于市场上常见肉牛品种的区分效果较好，同时操作简便，成本低，适于推广使用。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所<120>用于肉牛个体及品种鉴定的aflp引物组合产品、试剂盒及方法<160>14<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1gactgcgtaccaattcaag19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2gactgcgtaccaattcacg19<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<400>3gactgcgtaccaattcaga19<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4gactgcgtaccaattcatc19<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<400>5gatgagtcctgagtaacag19<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6gatgagtcctgagtaacta19<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列<400>7gatgagtcctgagtaactg19<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列<400>8gatgagtcctgagtaacca19<210>9<211>17<212>dna<213>人工序列<400>9ctcgtagactgcgtacc17<210>10<211>18<212>dna<213>人工序列<400>10aattggtacgcagtctac18<210>11<211>16<212>dna<213>人工序列<400>11gacgatgagtcctgag16<210>12<211>14<212>dna<213>人工序列<400>12tactcaggactcat14<210>13<211>16<212>dna<213>人工序列<400>13gactgcgtaccaattc16<210>14<211>16<212>dna<213>人工序列<400>14gatgagtcctgagtaa16当前第1页12