本发明涉及一种鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物及方法，属于分子生物技术领域。
背景技术：
多鳞鱚隐存种发现于巴基斯坦近海，隶属于鲈形目、鲈亚目、鱚科、鱚属。其外部形态与多鳞鱚极为相似：体呈长圆柱形，略侧扁，口小，开于吻端，上下颌和锄骨上有带状细齿，但口盖骨、腭骨及舌上均无齿。主鳃盖骨小，有一短棘；前鳃盖骨后缘垂直，平滑或略有锯齿，下缘水平。鳃膜在头侧与另一侧会合。体被小形栉鳞，鳞片易脱落；颊部具鳞2列，皆为圆鳞；侧线完全，呈单一列，略弯曲，侧线鳞数66-72；第一背鳍具xi硬棘；第二背鳍i硬棘，20-23软条。臀鳍有ii弱棘，21-23软条，与第二背鳍相对；腹鳍正常，其外缘硬棘不鼓起；尾鳍后缘截平或浅凹；脊椎骨数为34。头部至体背侧土褐色至淡黄褐色，腹侧灰黄色，腹部近于白色。多鳞鱚隐存种为巴基斯坦近海重要的经济鱼种。其肉质细腻鲜美，具有很高的食用价值。
目前用于鉴定巴基斯坦多鳞鱚隐存种的方法还没有见正式报道；由于二者形态非常相似，仅凭借形态特征很难将两者区分，因此寻找区分多鳞鱚隐存种和多鳞鱚的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题；这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种方法操作简单，易于掌握，准确性高，有助于解决鱚属鱼类种质混杂问题的鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物及方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：一种鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物，所述引物序列为：
l5979：5’-tttagtattcggagcctgag-3’；
h6241：5’-cctcaacacctgatgaggcc-3’。
一种利用所述分子标记引物进行鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的方法，所述的方法包括：
提取多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的dna，以两种鱼的dna为模板进行pcr扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果，种内遗传差异不大于1%；
所述多鳞鱚隐存种的分子标记序列为：
caggcatggtgggcacggccctgagcttgctaatccgagcagaactcagccagcccggcgctctactcggtgatgaccagatttataatgttattgtcactgcacatgctttcgtaatgattttctttatagtaataccaatcctcatcggaggatttgggaactgactcgtacccctaatgattggggcccccgacatagcattcccacgaatgaataacatgagcttctgacttctccctccttctttccttcttctttt；
所述多鳞鱚的分子标记序列为：
caggtatggtgggcacggccctaagcctgcttatccgagcagaacttagccaacctggcgctctgcttggtgacgaccaaatttacaatgtcattgtcaccgcacatgcctttgtaataattttctttatagtaatgccaatccttatcggagggttcggcaactggcttgttcccctgatgatcggagcccctgatatggcattcccacgaatgaataacatgagcttctgactccttcctccttctttcctccttctctt。
本发明所述pcr扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer2.5ul，dntps2ul，rtaq0.15ul，dna模板1ul，primer各1ul；
所述的pcr扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。
本发明与现有技术相比的有益效果：由多鳞鱚隐存种和多鳞鱚mtdnacoi基因262bp序列排序结果可以看出多鳞鱚隐存种与多鳞鱚存在35个碱基的差异，表现为3个颠换，32个转换；其结果稳定，可重复性强；30尾多鳞鱚隐存种个体（巴基斯坦群体）的扩增结果一致，表现出高度的一致性，因此基于coi基因的碱基差异可以作为多鳞鱚隐存种和多鳞鱚的种质区分的分子标记；同时，鉴别方法简单。
具体实施方法
下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
一种鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物，所述引物序列为：
l5979：5’-tttagtattcggagcctgag-3’；
h6241：5’-cctcaacacctgatgaggcc-3’。
一种利用所述分子标记引物进行鉴别多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的方法，所述的方法包括：
提取多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的dna，以两种鱼的dna为模板进行pcr扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果，种内遗传差异不大于1%；
所述多鳞鱚隐存种的分子标记序列为：
caggcatggtgggcacggccctgagcttgctaatccgagcagaactcagccagcccggcgctctactcggtgatgaccagatttataatgttattgtcactgcacatgctttcgtaatgattttctttatagtaataccaatcctcatcggaggatttgggaactgactcgtacccctaatgattggggcccccgacatagcattcccacgaatgaataacatgagcttctgacttctccctccttctttccttcttctttt；
所述多鳞鱚的分子标记序列为：
caggtatggtgggcacggccctaagcctgcttatccgagcagaacttagccaacctggcgctctgcttggtgacgaccaaatttacaatgtcattgtcaccgcacatgcctttgtaataattttctttatagtaatgccaatccttatcggagggttcggcaactggcttgttcccctgatgatcggagcccctgatatggcattcccacgaatgaataacatgagcttctgactccttcctccttctttcctccttctctt。
本发明所述pcr扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul，10×buffer2.5ul，dntps2ul，rtaq0.15ul，dna模板1ul，primer各1ul；
所述的pcr扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。
实施例1：
选用巴基斯坦多鳞鱚隐存种与福建晋江沿海的多鳞鱚，提取2个样本群体的dna，然后以所提取的dna为模板进行pcr扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果；
所述的引物序列为l5979：5’-tttagtattcggagcctgag-3’；h6241：5’-cctcaacacctgatgaggcc-3’；所述的pcr扩增的反应体系组成为：
0.2ml离心管中依次加入：
超纯水17.5ul
10×buffer2.5ul
dntps2ul
rtaq0.15ul
模板1ul
primer各1ul；
pcr扩增程序为94℃预变性5min，（94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec）×35个循环，72℃延伸10min，4℃保存∞。对pcr产物进行纯化后测序，并对2个群体的测序结果进行比对。
由多鳞鱚隐存种和多鳞鱚mtdnacoi基因262bp序列排序结果可以看出多鳞鱚隐存种与多鳞鱚存在35个碱基的差异，表现为3个颠换，32个转换。
多鳞鱚隐存种群体和多鳞鱚的mtdnacoi基因262bp序列比对结果为：
jjdcaggtatggtgggcacggccctaagcctgcttatccgagcagaacttagc
pks****c*****************g***t****a**************c***
ruler.........10.........20.........30.........40.........50
jjdcaacctggcgctctgcttggtgacgaccaaatttacaatgtcattgtcac
pks**g**c********a**c*****t*****g*****t******t*******
ruler.........60.........70.........80.........90.........100
jjdcgcacatgcctttgtaataattttctttatagtaatgccaatccttatcg
pkst********t**c*****g*****************a********c****
ruler........110........120........130........140........150
jjdgagggttcggcaactggcttgttcccctgatgatcggagcccctgatatg
pks****a**t**g*****a**c**a*****a*****t**g*****c**c**a
ruler........160........170........180........190.........200
jjdgcattcccacgaatgaataacatgagcttctgactccttcctccttcttt
pks***********************************t**c***********
ruler........210........220........230........240........250
jjdcctccttctctt
pks***t*****t**
ruler........260.262
其中“*”表示相同的碱基序列位点，jjd：福建晋江沿海多鳞鱚样品；pks：巴基斯坦沿海多鳞鱚隐存种样品。
测序结果表明，30尾多鳞鱚隐存种样品扩增结果一致，结果稳定且可重复性强。